內皮損傷后血栓模型制備方法的比較

張靜秋，陸永萍，他林昆，孫 月，陳 琦

（云南大學附屬醫院/云南省第二人民醫院超聲科，云南 昆明 650021）

下肢深靜脈血栓（deep vein thrombosis，DVT）是一種常見病，其并發癥肺栓塞（pulmonary embolism，PE）和血栓后綜合征對患者的生活質量和生命安全產生顯著影響[1]。目前，對深靜脈血栓的形成機制和診治療方案的研究是一個熱點領域，因此建立動物模型成為了關鍵。血管內皮細胞損傷是引發血栓形成的重要觸發因素[2?3]。因此，本研究尋找一種安全可行的方法，制備內皮損傷后的血管內血栓模型，通過超聲及病理切片比較模型效果，旨在為深入研究內皮損傷和深靜脈血栓提供可靠的實驗模型，為更好地模擬DVT 的發生過程，及深入研究DVT 的機制和開發新的治療方法提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取雄性日本大耳白兔（45）只，體重2.5～3.2 kg。隨機分為3 組（A 組、B 組、C 組），每組15 只。自由飲水，基礎飼料喂養。本研究經昆明醫科大學動物實驗倫理委員會批準（倫理備案號:kmmu2020258A ）。

1.2 儀器

采用法國Supersonic Imagine 公司（Supersonic Imagine，Aixen Provence，France）生產的Aixplorer型全數字化彩色多普勒超聲波診斷儀，L4-15 線陣探頭，頻率12-15 MHz，也可以對存儲的圖像進行回顧性測量。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物血 栓模型制 備將3 組兔稱重編號，在新環境下適應性喂養1 周后，行股靜脈造模，麻醉、取仰臥及四肢外展位固定，分別游離動、靜脈主干長約1.5 cm，分組制備：A 組不做血管結扎處理，B 組采取完全結扎兔股靜脈近端，C組采取不全結扎兔股靜脈近端（顯露左股靜脈后平行放置超滑縫線并一同結扎，打結后撤出超滑縫線）。此外，3 組均結扎股靜脈側支并使用無齒血管夾反復鉗夾靜脈管壁。術后縫合創口，連續3 d后肢肌注青霉素40 萬U 預防感染。

1.3.2 超聲觀察縱行與橫行掃查兔股靜脈目標區域，觀察血管內回聲及血流情況并記錄血管內徑后（圖1），啟用SWE（shear wave elastography，SWE）模式，選取感興趣區域，取樣框面積1mm2，測量血栓的彈性模量值［包括最大值（Max）、最小值（Min）和平均值（Mean）］、彌散度（Sd），選擇圖像穩定且Sd＜5Kpa 者，取樣3 次后計算平均值。對以上所有數據及圖片均作記錄并保存。

圖1 造模后超聲橫行與縱行掃查兔股靜脈，觀察血管內回聲及血流情況并記錄血管內徑Fig.1 After modeling，perform transverse and longitudinal ultrasound scans of the rabbit femoral vein to observe the echo and blood flow within the blood vessels and record the vascular diameter

1.3.3 病理觀察超聲檢查后處死動物，取病變血管，放入10%中性福爾馬林溶液內固定，血栓組織石蠟切片包埋，HE 染色，顯微鏡檢。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 實驗動物股靜脈造模處普通超聲顯示

血管內皮損傷早期（建模后1 d），A、B、C 3組血管內呈均勻一致低回聲。血管內皮損傷中期（建模后3 d），C 組血管內回聲較前稍增強，管腔內徑較前增寬（P＜ 0.05）。到晚期（建模后7 d），B 組出現部分管腔閉塞萎縮，管腔均較前有所減小（P＜ 0.05）；C 組內血栓充填更明顯，管腔內回聲稍增強，管腔內徑明顯增寬（P＜ 0.05）；CDFI顯示：A 組部分管腔內有點狀或短線狀血流通過，內徑測值見表1。

表1 3 組兔股靜脈管腔內徑比較[（ ），mm]Tab.1 Comparison of the intraluminal diameter of the femoral vein in three groups of rabbits [（），mm]

表1 3 組兔股靜脈管腔內徑比較[（ ），mm]Tab.1 Comparison of the intraluminal diameter of the femoral vein in three groups of rabbits [（），mm]

與術后1 d比較，*P ＜ 0.05；與術后3 d比較，△P ＜ 0.05；#P ＜ 0.05

2.2 實驗動物股靜脈造模處實時剪切波彈性成像顯示

1 d、3 d 及7 d 兔股靜脈造模處均有彈性顯像，見圖2。

圖2 造模后1 d、3 d 及7 d 3 組兔股靜脈實時剪切波彈性成像觀察Fig.2 Real-time shear wave elastography observation of the femoral vein in three groups of rabbits at 1 d，3 d，and 7 d after modeling

隨著造模時間延長，3 組兔股靜脈血栓模型楊氏模量均值呈增高趨勢，且在造模后7 d 顯著增高，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。同一時間內組間比較，C 組于第3 天及第7 天血栓模型的楊氏模量較A、B 2 組明顯增高（P＜ 0.05）。兔造模處股靜脈血栓楊氏模量值比較結果，見表2。

表2 3 組兔股靜脈血栓模型楊氏模量值MEAN 值比較（Kpa）Tab.2 Comparison of mean values of Young’s modulus（MEAN）in the femoral vein thrombus model of three groups of rabbits（Kpa）

2.3 病理切片觀察分析血栓成分

隨著造模后時間的延長，3 組實驗組均出現不同程度的血管壁的損傷、內皮細胞脫落、炎細胞侵潤，最終導致不同程度的血栓形成，并于造模第7 天C 組血管內出現一定程度的纖維蛋白機化血栓，見表3 及圖3。

圖3 C 組兔造模1 d、3 d 及7 d 后股靜脈血栓病理切片觀察（HE100×）Fig.3 Pathological observation of femoral vein thrombosis in rabbits of group C at 1 d，3 d，and 7 d after modeling（HE100×）

3 討論

Virchow[4]最早提出了深靜脈血栓形成的3 大因素：血流淤積、靜脈內皮損傷和血液高凝狀態。目前，深靜脈血栓動物模型的制備方法主要包括阻斷靜脈血液回流以引發血液淤滯，通過注入促凝物質、異物或機械性損傷血管內皮細胞等輔助手段誘發血栓形成[5?6]。已報道的幾種制備方法，包括結扎法、創傷性擊打后固定下肢、以及放置球囊導管阻塞血管并局部使用凝血酶[7?10]。這些方法各有適用的研究領域，相較于結扎法，其余3 種方法制備血栓時間較長、操作復雜、耗材較多，并且沒有關于機化血栓的報道。本研究旨在比較不同結扎方式制備動物股靜脈血栓的效果，以期找到一種簡單而有效的方法來改進動物血栓模型的制備過程，為后續實驗奠定良好的基礎。

本研究使用超聲聯合實時剪切波彈性成像技術觀察血栓形成過程，并通過病理切片進行驗證，發現不全結扎法制備的靜脈血栓模型更符合人體深靜脈血栓的特點，具有較高的成功率和更準確的數據基礎。動物深靜脈血栓模型的制備常因側支循環的建立，導致模型處血管的完全閉塞和管腔萎縮，因此難以獲取充滿性深靜脈血栓；同時由于缺乏良好的觀察方法，不能很好地觀察血栓形成過程，最終導致血栓模型的成功制備率較低。超聲聯合實時剪切波彈性成像技術是一種非侵入性的影像學技術，可以表征血栓的硬度[11?12]。研究已證實SWE 可用于評估下肢深靜脈血栓的硬度及靜脈血栓的臨床分期，且其效果優于常規超聲檢查[13?15]。在本研究中，筆者利用這項技術實時、非侵入性觀察血栓形成的過程，獲取血栓的形態和血栓硬度的楊氏模量值，幫助筆者了解血栓的形成和演變過程，為后續實驗提供了更準確的數據。同時，加入病理檢查進行驗證，結果表明使用單純夾閉的方法形成的血栓主要是紅色血栓，因此超聲觀察管腔內以低回聲為主，管腔內可見少量血流信號，說明血栓易脫落。完全結扎法制造血栓模型超聲及病理結果均證實管腔出現不同程度的閉塞和萎縮。聯合不全結扎法同時應用了血流淤滯和靜脈內皮損傷這2 個導致血栓形成的關鍵因素，可以快速且大量地形成血栓。在制備模型后的第7 天，超聲檢查發現C 組血管內管腔內回聲明顯充填，SWE 證實管腔內楊氏模量值明顯升高，說明血栓出現機化后血栓硬度增高，通過病理證實該組血栓機化率明顯增高。

筆者比較了單純夾閉、聯合完全結扎和聯合不全結扎法制備血管內皮損傷后血栓模型的優缺點。發現單純夾閉的方法雖然簡單易行，使用止血夾反復夾閉股靜脈，可通過損傷血管內皮，并短暫阻斷了血流回流造成血流瘀滯，使該血管內處于高凝狀態，從而引發血栓形成。但是，單純夾閉的血栓形成效果不夠理想，血栓往往不完整且容易脫落，這導致了觀察效果較差。相比之下，完全結扎法能夠較好地保持血栓的完整性。它通過將動物的股靜脈完全結扎，阻斷了血流，并促使血栓形成。這種方法的優點在于血栓形成相對完整，有利于觀察和評估血栓的特征和性質。然而，完全結扎法也存在一些局限性。它可能導致血管閉塞和萎縮，影響血管的生理功能，甚至對動物的健康產生負面影響。與完全結扎法相比，不全結扎法則在模擬人體深靜脈血栓方面更具優勢。這種方法在不全結扎靜脈血管壁時可造成一定的血管壁及內皮損傷，同時導致遠端血流瘀滯，隨著血管內的壓力逐漸增高，血管壁承受的血液流體力學發生改變，引起血管壁的病理改變，并影響內皮細胞結構與功能。因此，通過不全結扎兔股靜脈，可使血栓形成的速度更快。由于不全結扎法允許少量血流緩慢通過結扎段靜脈，很好地模擬了人體靜脈疾病的重度狹窄和血流緩慢的特點。因此，這種制模方式形成的靜脈血栓模型更符合人體深靜脈血栓的病理生理學特點。本研究還發現，使用這種方法進行建模的手術時間較短，血栓制成率高。有利于超聲觀察，為今后的實驗打下了良好的基礎。

綜上所述，本研究通過對比3 種制備動物股靜脈血栓的方法，可以看到不同方法各有其優勢和局限性。結扎法簡單易行，但血栓形成不完整且易脫落，觀察效果較差。完全結扎法能夠較好地保持血栓的完整性，但容易導致血管閉塞和萎縮，影響觀察結果。而夾閉法聯合不全結扎法能夠產生較為穩定的內皮損傷和血栓形成。這種方法的優勢在于，通過結扎不完全閉塞血管，可以模擬出更接近真實情況下的內皮損傷。此外，該方法制備的血栓模型在血管內徑和楊氏模量值上顯示出明顯的變化，進一步驗證了其有效性。這一研究結果對于進一步研究深靜脈血栓的發生機制、預防和治療方法具有重要的指導意義。

然而，筆者也注意到本研究存在一些局限性。首先，本研究僅使用兔作為實驗動物，而不涉及其他物種，因此不能確定這種方法在其他動物模型中的適用性。其次，本研究的樣本量相對較小，可能存在樣本量不足的局限性。為了提高研究結果的可靠性和推廣性，未來的研究將考慮增加樣本量，并進行更嚴謹的統計分析，以更準確地評估不同方法制備血栓模型的效果。此外，本研究的觀察時間較短，只觀察了造模后1 d、3 d 和7 d 的變化，沒有對更長時間的變化進行觀察。進一步的長期觀察可能有助于更全面地評估血栓模型的穩定性和持久性。

總之，本研究的結果表明，夾閉法聯合不全結扎法是制備內皮損傷后血栓模型的有效方法。然而，筆者需要進一步的研究來驗證其在其他動物模型中的適用性，并擴大樣本量、進行更長期的觀察以評估其穩定性。