雙組分系統YvrG/YvrH調控伊短菌素生物合成的研究

摘 要：伊短菌素（edeine）是短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）X23產生的線性非核糖體抗菌肽，具有抑菌譜廣、抑菌活性強的特點。通過轉錄組測序，發現雙組分調控因子yvrG/yvrH與伊短菌素生物合成基因簇（ede BGC）的表達模式相反，推測YvrG/YvrH可能參與ede BGC的轉錄調控。本研究利用Red/ET同源重組技術構建yvrG/yvrH的X23缺失菌株、回補菌株、過表達菌株，通過表型分析及實時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術研究YvrG/YvrH對伊短菌素生物合成的影響。結果顯示，ΔyvrG/yvrH的抑菌活性顯著降低，且ede BGC的表達水平下調，伊短菌素的合成受到了抑制，產量降低了46.75%。綜上所述，YvrG/YvrH正調控伊短菌素的生物合成。本研究為伊短菌素代謝工程改造提供了基因調控元件。

關鍵詞：短短芽孢桿菌；伊短菌素；雙組分調控因子；抑菌活性；生物合成

中圖分類號：S476+.8" " " " " " " " " " " " "文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2024.05.008

Abstract： Edeine， synthesized by Brevibacillus brevis X23， is a linear peptide antibiotic not encoded by ribosomal RNA， renowned for its extensive range of antibacterial effectiveness. Transcriptome sequencing revealed an inverse expression pattern between the two-component regulatory factors yvrG/yvrH and the edeine biosynthesis gene cluster （ede BGC）， suggesting the involvement of YvrH/YvrG in the transcriptional regulation of ede BGC. This study utilized Red/ET homologous recombination technology to construct X23 mutant strains that yvrG/yvrH lacks， complemented strains， and overexpressing strains， and investigated the impact of YvrG/YvrH on edeine biosynthesis through phenotype analysis and quantitative real-time PCR （RT-qPCR） techniques. The results revealed that knocking out yvrG/yvrH significantly reduced the antibacterial activity of the strains， the expression of ede BGC decreased， the synthesis of edeine was inhibited， and the yield of edeine was reduced by 46.75%. In summary， YvrG/YvrH act as positive regulatory factors in the edeine biosynthesis. This study provides gene regulatory elements for the metabolic engineering of edeine.

Key words： Brevibacillus brevis; edeine; two-component regulatory factors; bacteriostatic activity; biosynthesis

（Acta Laser Biology Sinica， 2024， 33（5）： 461-469）

伊短菌素（edeine）是線性非核糖體抗菌肽，具有抑菌譜廣、抑菌活性強的特點［1］。短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）X23的伊短菌素生物合成基因簇（edeine biosynthetic gene cluster，ede BGC）由17個開放閱讀框組成，長度為45.1 kb［2］。其中，edeB是途徑特異性調控因子，過表達edeB使伊短菌素產量增加了92.27%［3］；edeQ編碼N-乙酰轉移酶，異源表達edeQ提高了宿主菌對伊短菌素的耐受性，edeQ被認為是自抗性基因［1］。此外，Liu等［2］利用啟動子替換工程將伊短菌素的產量提高了8.7倍，張亮等［4］通過敲除X23的全局性負調控基因abrB使伊短菌素的產量提高了1.1倍。雖然伊短菌素生物合成的分子調控機制研究取得了一定進展，但仍處于起步階段。

雙組分系統（two-component system，TCS）是細菌感知并響應外界環境的應激信號傳導系統之一［5］。細菌中TCS數量的多少取決于基因組的大小和生存環境的復雜程度［6］。TCS通常由一個位于膜上感應外部刺激的組氨酸激酶（histidine kinase，HK）和一個位于細胞質內的響應調控蛋白（response regulator，RR）組成［7］，通過磷酸化和去磷酸化介導趨化性、滲透調節、孢子形成、次級代謝產物的生物合成等各類生理過程［8］。此外，它還參與生物膜形成和群體感應等生化過程［9］。比較典型的TCS有PhoR/PhoP、AflQ1/AflQ2和LytS/LytR等，枯草芽孢桿菌的PhoR/PhoP能夠在低磷酸鹽條件下上調豐原素合成酶基因的表達從而提高豐原素的產量［10］；而在玫瑰孢鏈霉菌中，PhoR/PhoP能夠感應環境中磷酸鹽濃度的變化從而影響達托霉素的合成［11］；林可鏈霉菌的AflQ1通過抑制其自身表達并降低林可霉素生物合成基因簇中8個基因的轉錄水平影響林可霉素的合成［12］；敲除lytR提高了須糖多孢菌的生存能力，進而促進丁烯基多殺菌素的生物合成［13］。

大量研究表明，TCS在細菌次級代謝調控中發揮著直接或間接的調控作用，但調控ede BGC的TCS鮮見報道。本研究在X23時序轉錄組測序的基礎上篩選出一系列TCS，以YvrG/YvrH為研究對象，利用Red/ET同源重組技術在X23中敲除yvrG/yvrH，通過生長曲線測定、平皿對峙培養、液相色譜-質譜聯用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）和實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）等手段分析YvrG/YvrH對X23生長及伊短菌素生物合成的影響，為探究其調控伊短菌素生物合成的機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

本研究所用菌株和質粒見表1。

1.1.2 引物

本研究所用引物見表2。

1.1.3 培養基、培養條件及抗生素

大腸桿菌（Escherichia coli）GB05-Dir和X23均采用LB（Luria-Bertani）培養基培養，發酵培養采用營養肉湯（nutrient broth，NB）培養基，按參考文獻配置［4］。

抗生素終質量濃度：安普霉素（apramycin，Apr）50 mg/mL，氨芐青霉素（ampicillin，Am）100 mg/mL，紅霉素（erythromycin，EM）10 mg/mL。

1.1.4 主要試劑

PrimerSTAR Max DNA聚合酶購自寶生物工程有限公司；T4 DNA聚合酶、限制性內切酶EcoR I、Nde I、Kpn I、BamH I和Pst I購自美國NEB公司；細菌基因組DNA、RNA提取試劑盒和反轉錄試劑盒購自北京全式金生物技術公司；細菌質粒提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司；抗生素等其他生化試劑均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 轉錄組比較分析挖掘雙組分調控因子

將X23接種至NB液體培養基培養，分別在12、18、24、30、36 h取樣進行轉錄組測序，每個時間點3個生物學重復。利用生物信息學挖掘與ede BGC轉錄調控相關性較高的雙組分調控因子，以表達倍數差異|log2（fold change）|gt;1且顯著性P-valuelt;0.05為差異閾值，篩選表達模式與ede BGC相同或相反的差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）。

1.3 氨基酸序列比對及結構域分析

利用BLAST數據庫（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對RS17965的氨基酸序列，SMART網站（https：//smart.embl.de/）分析蛋白質結構域，若一致性大于30%且具有相似的結構域，則認為兩者具有同源性。通過SWISS-MODLE網站（https：//swissmodel.expasy.org/）完成RS17965蛋白高級結構的同源建模后，利用ClustalX2軟件和ESPript網站（https：//espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi）比對不同細菌的RS17965氨基酸序列。

1.4 yvrG/yvrH敲除載體及過表達載體的構建

根據yvrH和yvrG的序列信息設計上下游引物，利用Red/ET同源重組多片段線性重組法構建敲除載體［14-17］。以X23基因組DNA為模板，yvrG/yvrH-KO-F1/yvrG/yvrH-KO-F2和yvrG/yvrH-KO-R1/yvrG/yvrH-KO-R2為引物分別擴增長約1 kb的上、下游同源臂；以質粒pSET152為模板，Apra-F/Apra-R為引物擴增Aprar片段；以質粒pBR322-ErmB-ori194為模板，pE194-F/pE194-R為引物擴增載體骨架。利用重疊延伸PCR將4條擴增片段融合，去除鹽離子，按Takahashi等［18］的方法將重組DNA片段導入GB05-dir，在含有安普霉素（20 μg/mL）的LB固體培養基上挑取單菌落進行驗證，獲得敲除載體pBR322-ErmB-ori194-yvrG/yvrH。

過表達載體的構建以X23基因組DNA為模板，yvrG/yvrH-F和yvrG/yvrH-R為引物擴增yvrG/yvrH，載體片段pLQ-PxylA經BamH I和Pst I雙酶切后純化回收，與yvrG/yvrH基因片段同源重組后，按Takahashi等［18］的方法導入GB05-dir，在含有紅霉素（300 μg/mL）和氨芐青霉素（150 μg/mL）的LB固體培養基上挑取單菌落進行驗證，獲得過表達載體pLQ-PxylA-yvrG/yvrH。

1.5 yvrG/yvrH缺失菌株、回補菌株和過表達菌株的構建

缺失菌株的構建方法參考張亮等［4］，將敲除載體電擊轉入X23，通過同源重組將yvrG/yvrH基因替換為Aprar，在含有安普霉素（10 μg/mL）的LB固體培養基上挑取單菌落，以Apra-F和Apra-R為引物進行菌液PCR鑒定，篩選陽性轉化子。將培養溫度提高至37℃，消除溫敏性敲除載體。兩輪篩選后通過引物P1/P2和P3/P4進行PCR鑒定，獲得缺失菌株ΔyvrG/yvrH-Apra。將pDG148-Cre-ErmB載體轉入ΔyvrG/yvrH-Apra去除Aprar片段，在含有紅霉素（2 μg/mL）的抗性平板上篩選轉化子，獲得缺失菌株ΔyvrG/yvrH。

將表達質粒分別導入ΔyvrG/yvrH和X23，在含有紅霉素（2 μg/mL）的LB固體培養基上篩選轉化子并以pLQ-TF/pLQ-TR為引物進行PCR鑒定，獲得質粒回補菌株ΔyvrG/yvrH-yvrG/yvrH和質粒過表達菌株X23-yvrG/yvrH。

1.6 生長曲線測定

按張亮等［4］的方法測定生長曲線。挑取野生型菌株、缺失菌株、回補菌株及過表達菌株的單菌落接種于LB液體培養基，培養過夜，第2天轉接至NB液體培養基并將起始菌體光密度（optical density，OD）在600 nm波長處的吸光值OD600 nm調整至0.1，30℃、180 r/min振蕩培養至48 h，期間每隔12 h取1次樣。測定不同時期的菌液在600 nm波長處的吸光值，繪制生長曲線，每個樣品3次生物學重復。

1.7 抑菌活性評價

按張亮等［4］的方法評價抑菌活性。靶標菌株為青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）GMI1000，以NB培養基為空白對照，X23-pLQ-PxylA為陰性對照，采用十字交叉法測量抑菌圈直徑，每個樣品3次生物學重復。

1.8 伊短菌素的HPLC-MS定量分析

按張亮等［4］的方法，利用HPLC-MS技術對各個菌株edeine A（m/z 755.441 0 ［M+H］+）和edeine B（m/z 797.462 8 ［M+H］+）的峰面積進行定量分析，每個樣品3次生物學重復。

1.9 RT-qPCR檢測ede BGC的轉錄水平

分別收集培養至12、24、36、48 h的菌液，提取RNA后將其反轉錄為cDNA并去除基因組DNA。以16S rRNA為內參基因，ede BGC的第一個基因edeP為目標基因，每個樣品3次生物學重復及技術重復。反應體系（20.0 μL）：ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.2 μL，cDNA 2.0 μL，Nuclease-free water 7.6 μL。使用2–ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.10 數據統計與分析

采用單因素方差分析方法進行數據統計學分析；使用GraphPad Prism 8.2.1軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 YvrG/YvrH雙組分系統的鑒定

編號為RS17965和RS17970的TCS編碼基因與ede BGC表達模式的相關性分析見圖1a。利用SMART分析2個蛋白的結構域，發現RS17965（714 bp）編碼的蛋白具有REC與Trans reg_C結構域（圖1b），這2個結構域均屬于RR的保守性結構域［5， 19］，且與已報道的枯草芽孢桿菌168的RR YvrH結構域一致［20］。RS17970（1 383 bp）編碼的蛋白具有HisKA和HATPase_c結構域（圖1c），這兩個結構域均屬于HK的保守性結構域［5， 19］。同源分析發現，RS17965蛋白與枯草芽孢桿菌168的YvrH蛋白（登錄號：P94504.4）的一致性達39.66%（圖1d）。以上分析說明RS17965/RS17970編碼TCS YvrG/YvrH的同源蛋白。

2.2 敲除、回補和過表達yvrG/yvrH對X23生長的影響

利用Red/ET同源重組法構建了缺失菌株ΔyvrG/yvrH，并且以質粒導入的方式得到了回補菌株ΔyvrG/yvrH-yvrG/yvrH及過表達菌株X23-yvrG/yvrH。生長曲線測定結果顯示（圖2），在12 h時，X23-yvrG/yvrH的菌體密度顯著低于X23，而其他時間點，3個重組菌株的菌體密度與X23相比均無顯著性差異。以上結果說明，敲除yvrG/yvrH對菌體密度的影響不大，yvrG/yvrH不是X23生長的必需基因。

2.3 敲除、回補和過表達yvrG/yvrH對X23抑菌活性的影響

通過平皿對峙培養比較各個菌株的抑菌活性（圖3），結果顯示，在24、36、48 h，ΔyvrG/yvrH的抑菌圈小于X23，說明敲除yvrG/yvrH導致X23的抑菌活性降低。為了確認基因敲除試驗是否正確，同時進一步驗證yvrG/yvrH的功能，我們進行了質粒回補試驗，發現在48 h，ΔyvrG/yvrH-yvrG/yvrH的抑菌圈大小與X23相近，X23-yvrG/yvrH的抑菌圈較X23顯著增大，分析認為，在野生型X23中導入過表達載體，不僅增加了yvrG/yvrH的拷貝數，且載體攜帶的強啟動子PxylA也增加了yvrG/yvrH的表達量，進而提高了抑菌活性。以上結果不僅說明YvrG/YvrH通過促進伊短菌素的合成提高了X23的抑菌活性，同時也證明了ΔyvrG/yvrH抑菌活性的降低并非是由于菌體生物量的降低，而是由伊短菌素產量減少所導致。

2.4 敲除yvrG/yvrH下調了ede BGC的轉錄水平

為了探究不同生理狀態條件下ede BGC的轉錄水平差異，通過RT-qPCR對ede BGC的第一個核心生物合成基因edeP進行不同時期的轉錄水平分析（圖4），發現敲除yvrG/yvrH后，edeP的轉錄水平在12、36、48 h均發生不同程度的下調，并且在對數生長期（12 h）存在顯著性差異（Plt;0.01）。值得注意的是，在24 h時，edeP的表達上調，一方面是因為X23基因組中存在兩對yvrG/yvrH同源基因，敲除yvrG/yvrH可能會啟動同源基因的表達以彌補功能的喪失；另一方面，基因的表達受復雜調控網絡的控制，敲除yvrG/yvrH可能會影響該時期與ede BGC相關的其他基因的表達，從而導致edeP表達上調。伊短菌素的生物合成是一個積累的過程，雖然edeP的表達量在24 h時有所升高，但另外3個時期ede BGC均呈現出較低的轉錄水平。總體來看，敲除yvrG/yvrH下調了ede BGC的轉錄水平，進而降低了伊短菌素的生物合成量。

2.5 YvrG/YvrH正調控伊短菌素的生物合成

通過HPLS-MS定量分析YvrG/YvrH對伊短菌素產量的影響，比較4個菌株48 h發酵液中伊短菌素的峰面積（圖5a），質譜鑒定獲得了edeine A（m/z 755.441 9 ［M+H］+）和edeine B（m/z 797.462 4 ［M+H］+）的分子離子峰（圖5b）。結果表明，ΔyvrG/yvrH的伊短菌素產量比X23降低了46.75%，回補菌株合成伊短菌素的能力部分恢復，過表達yvrG/yvrH能夠促進伊短菌素的合成，產量比X23提高了24.69%（圖5c），進一步證實了YvrG/YvrH正調控伊短菌素的生物合成。

3 討論

本論文研究了YvrG/YvrH對X23生長和伊短菌素生物合成的影響，結果發現：敲除yvrG/yvrH對菌株的生長趨勢及生物量無顯著影響，但導致X23的抑菌活性顯著降低；RT-qPCR分析表明，ede BGC的轉錄水平下調；HPLC-MS分析發現，ΔyvrG/yvrH的伊短菌素產量降低了46.75%，而過表達yvrG/yvrH將伊短菌素的產量提高了24.69%，說明yvrG/yvrH是伊短菌素生物合成的正調控雙組分因子。

TCS普遍存在于細菌次級代謝產物調控系統中，通過直接調節生物合成基因簇的表達或間接調控前體代謝、中心碳代謝或輔因子平衡等途徑參與次級代謝產物的合成。TCS YvrG/YvrH由HK YvrG和RR YvrH組成。在枯草芽孢桿菌中，YvrGHb是首個被發現控制細胞壁水解酶基因表達的TCS。YvrGHb通過正調控wprA對細胞表面蛋白進行定量控制，調節胞質外功能σ因子（extracytoplasmic function-σ，ECF-σ）σX來控制dlt操縱子的表達，dlt操縱子負責D-丙氨酰磷壁酸的形成，該過程可減少細胞表面的負電荷，從而維持細胞表面穩態；YvrGHb還通過負調控lytABC操縱子的轉錄來防止正常培養條件下的細胞自溶［20］。Serizawa等［20］發現，YvrGHb能同時上調sunA和sunT-bdbA-sunS-bdbB的轉錄從而影響抗菌肽sublancin的合成。

YvrG/YvrH調控伊短菌素生物合成的分子機制尚未闡明，推測YvrG/YvrH可能通過增強σX的表達，間接降低其下游調控因子lytR的轉錄水平，影響ede BGC關鍵酶或前體合成有關基因的表達，進而促進伊短菌素的生物合成。為了驗證上述推測，后續將通過染色質免疫共沉淀測序技術（chromatin immunoprecipitation assay with high-throughput sequencing，ChIP-seq）和電泳遷移率變動分析（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）等技術進一步分析YvrG/YvrH調控伊短菌素生物合成的分子機制。綜上所述，本論文首次發現yvrG/yvrH是伊短菌素生物合成的正調控雙組分因子，為后續利用代謝工程策略改造伊短菌素生物合成途徑提供了候選調控元件。

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