幾種誘抗劑對(duì)西瓜ZYMV 的防治效果評(píng)價(jià)

郝小苑，劉卓文，劉楓楠，劉莉銘，吳會(huì)杰，古勤生，康保珊，2*

（1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所，河南省果樹(shù)瓜類(lèi)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450009；2 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院中原研究中心，河南新鄉(xiāng) 453500）

病毒性病害是農(nóng)作物病害中一類(lèi)特殊的病害，其傳播快、防治難，號(hào)稱“植物癌癥”，植物感染病毒病后主要癥狀表現(xiàn)為花葉、枯斑、壞死、畸形、黃化等。病毒是專性寄生物，依賴寄主體內(nèi)的蛋白進(jìn)行增殖、傳播，消耗寄主營(yíng)養(yǎng)，造成植物發(fā)育不良或畸形生長(zhǎng)。一般化學(xué)藥物很難抑制病毒的繁殖和運(yùn)動(dòng)，目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)防治病毒病的理想農(nóng)藥產(chǎn)品。

植物免疫誘抗劑又稱植物疫苗，是近幾年發(fā)展的一類(lèi)新型生物農(nóng)藥，包括蛋白多肽類(lèi)、寡糖類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)和無(wú)機(jī)化合物類(lèi)等（Qiu et al.，2017）。誘抗劑對(duì)農(nóng)作物病蟲(chóng)害沒(méi)有直接的殺滅作用，是由外源生物或分子通過(guò)誘導(dǎo)或激活植物的免疫系統(tǒng)并調(diào)節(jié)植物的新陳代謝，改善植物的養(yǎng)分狀況，增強(qiáng)抵抗病蟲(chóng)害的能力，從而達(dá)到防病、抗病的目的。目前已有多種植物免疫誘抗劑在生產(chǎn)中應(yīng)用。植物病原菌產(chǎn)生的蛋白Harpin 在1992 年被證實(shí)可以提高作物產(chǎn)量，改善作物生長(zhǎng)狀況，而且可以增強(qiáng)對(duì)病毒病的抗性和抵抗蚜蟲(chóng)侵害的能力（Wei et al.，1992；Baker et al.，1993），之后研發(fā)出含該蛋白的顆粒生物制劑用于植物保護(hù)（Grisham，2000），并應(yīng)用于多個(gè)國(guó)家的煙草、蔬菜以及水果種植中；病原菌細(xì)胞壁的組成成分殼寡糖也是一種有效的天然植物免疫誘抗劑，被證明可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)和對(duì)非生物脅迫的耐受性，以及提高多種作物的抗病性（Pichyangkura & Chadchawan，2015），目前已對(duì)殼寡糖及其衍生物進(jìn)行商業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。很多研究證明，免疫誘抗劑可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）（Bektas & Eulgem，2014），例如苯丙噻二唑（閆濤 等，2009；Wei et al.，2011）、β-氨基丁酸（Hamiduzzaman et al.，2005）、殼寡糖（商文靜，2006）、水楊酸（Li et al.，2012）、單萜（Riedlmeier et al.，2017）等。隨著食品安全和環(huán)境安全越來(lái)越受到人們的關(guān)注，作為綠色生物防治劑的植物免疫誘抗劑將會(huì)成為開(kāi)發(fā)和應(yīng)用防治產(chǎn)品的新趨勢(shì)。

目前市場(chǎng)上還沒(méi)有專門(mén)針對(duì)葫蘆科作物尤其西瓜防治病毒病害的誘抗劑，而且由于不同寄主間免疫抗性機(jī)制的差異，當(dāng)同種誘抗劑應(yīng)用于不同作物及不同病害時(shí)，防治極可能無(wú)效。小西葫蘆黃花葉病毒（zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）引起的病害是西瓜生產(chǎn)中常見(jiàn)的病毒病害，危害非常嚴(yán)重，全球范圍內(nèi)均有發(fā)生，是目前危害中國(guó)葫蘆科作物最主要的流行病害之一（古勤生，2002）。本研究針對(duì)西瓜ZYMV，開(kāi)展了6 種不同濃度和類(lèi)型的誘抗劑及其復(fù)配組合對(duì)ZYMV 的防治效果試驗(yàn)，以期篩選出防效較好的化學(xué)誘抗劑組合，為瓜類(lèi)病毒病害的綠色防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與病毒

試驗(yàn)于2021 年5—11 月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所進(jìn)行。供試西瓜品種：紅和平，購(gòu)自浙江勿忘農(nóng)種業(yè)股份有限公司。將西瓜種子在水中浸泡6 h，用濕紗布包裹置于28 ℃培養(yǎng)箱中催芽，待芽長(zhǎng)出后播種于裝有營(yíng)養(yǎng)土的營(yíng)養(yǎng)缽中，每缽1粒，置于培養(yǎng)室中（23～27 ℃），常規(guī)管理，植株長(zhǎng)到兩葉一心時(shí)，待用。試驗(yàn)期間西瓜幼苗的生長(zhǎng)和處理均在培養(yǎng)室中進(jìn)行。

ZYMV 侵染性克隆：由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所西甜瓜病蟲(chóng)害防控實(shí)驗(yàn)室采用ZYMVCH87 分離物構(gòu)建（劉莉銘 等，2021）。

供試藥劑：殼寡糖購(gòu)于北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司，沒(méi)食子酸（gallic acid，GA）購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司，L-哌啶酸（Pip）購(gòu)于上海賢鼎生物科技有限公司，β-氨基丁酸（BABA）購(gòu)于上海麥克林生化科技股份有限公司，N-羥基哌啶酸（NHP）購(gòu)于MCE 生物科技有限公司，2，1，3-苯丙噻二唑（BTH）購(gòu)于西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司，阿泰靈購(gòu)于河北中保綠農(nóng)作物科技公司。

1.2 藥劑處理

將藥劑按照試驗(yàn)濃度進(jìn)行配制，其中藥劑對(duì)照（CK+ ）溶液為阿泰靈粉末稀釋40 倍液。BABA溶液：先加入少量無(wú)水乙醇，待藥劑完全溶解后，加入蒸餾水配制成50 mmol · L-1的母液，4 ℃保存；噴施前用蒸餾水稀釋成濃度梯度分別為5 mmol · L-1和1 mmol · L-1的工作液。BTH 溶液：先加入少量無(wú)水乙醇，待藥劑完全溶解后，加入蒸餾水配制成5 mmol · L-1母液，4 ℃保存；噴施前用蒸餾水稀釋成濃度梯度分別為0.5 mmol · L-1和0.1 mmol · L-1的工作液。殼寡糖溶液：蒸餾水溶解，并在水浴鍋中加熱助溶，配制成5 g · L-1的母液，室溫保存；噴施前用蒸餾水稀釋成濃度梯度分別為2.5 g · L-1和1 g · L-1的工作液。沒(méi)食子酸溶液：蒸餾水溶解，配制成1 g · L-1的母液，室溫保存；噴施前用蒸餾水稀釋成濃度梯度分別為0.5 g · L-1和0.1 g · L-1的工作液。Pip 溶液：蒸餾水溶解，配制成100 mmol ·L-1的母液，4 ℃保存；噴施前用蒸餾水稀釋成濃度分別為2 mmol · L-1和1 mmol · L-1的工作液。NHP溶液：蒸餾水溶解，配制成10 mmol · L-1的母液，-20℃保存；噴施前用蒸餾水稀釋成濃度梯度分別為0.5 mmol · L-1和0.1 mmol · L-1的工作液。

西瓜幼苗兩葉一心時(shí)噴施藥劑，間隔24 h 噴施1 次，共噴施3 次，在第3 次噴施后12 h 人工接種病毒。設(shè)置無(wú)菌水處理為對(duì)照（Mock），每個(gè)處理10 株西瓜幼苗，重復(fù)3 次。接種病毒后第8天開(kāi)始觀察癥狀，記錄植株的顯癥率以及發(fā)病情況。

1.3 接種病毒

為保證接種效率，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染性克隆接種：將含有pXT1-ZYMV 質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101接種于LB 液體培養(yǎng)基（含有50 μg · mL-1卡那霉素、50 μg · mL-1利福平）中，28 ℃，220 r · min-1培養(yǎng)24 h 以上，菌體經(jīng)離心收集后，用相同體積的誘導(dǎo)緩沖液（含有10 mmol · L-1MgCl2、10 mmol ·L-1MES 和100 μmol · L-1乙酰丁香酮）重懸，室溫靜置誘導(dǎo)2～12 h，用1 mL 注射器將誘導(dǎo)后的農(nóng)桿菌注射接種于西瓜幼苗的子葉背面，待子葉葉片全部接滿即可（每株約接種0.4 mL）。

1.4 病情調(diào)查與統(tǒng)計(jì)

接種后第8 天開(kāi)始統(tǒng)計(jì)各處理植株的顯癥率，待對(duì)照植株的顯癥率達(dá)到100%時(shí)，調(diào)查各處理植株的病情級(jí)別，根據(jù)植株生長(zhǎng)狀態(tài)，調(diào)查心葉或心葉下方第1 片真葉。記錄植株顯癥率，并計(jì)算病情指數(shù)及相對(duì)防治效果。接種后15 d 調(diào)查顯癥率。

根據(jù)癥狀表現(xiàn)并參考古勤生（2001）的方法，將病情劃分為0～5 級(jí)：0 級(jí)，無(wú)癥狀；1 級(jí)，只表現(xiàn)褪綠斑或明脈；2 級(jí)，輕度花葉，無(wú)蕨葉；3 級(jí)，嚴(yán)重花葉，無(wú)蕨葉；4 級(jí)，嚴(yán)重花葉，輕微蕨葉；5 級(jí)，嚴(yán)重花葉和蕨葉，葉片畸形嚴(yán)重（圖1）。

圖1 西瓜ZYMV 病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

顯癥率 = 顯癥株數(shù)/調(diào)查總株數(shù) × 100%

病情指數(shù) = ∑（某病級(jí)株數(shù) × 病情級(jí)數(shù)）/（調(diào)查總株數(shù) × 最高級(jí)數(shù)） × 100

相對(duì)防治效果 = （對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù) × 100%

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)取3 次重復(fù)的平均值，用Microsoft Excel 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。在P＜ 0.05 水平上，用SPSS 軟件以單因素ANOVA 分析鄧肯氏新復(fù)極差法對(duì)病情指數(shù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 確定誘抗劑最適濃度

供試6 種藥劑分別采用2 個(gè)濃度噴施西瓜幼苗（表1），在對(duì)照（Mock）的顯癥率達(dá)到100.00%時(shí)（第11 天），統(tǒng)計(jì)處理組的發(fā)病情況。結(jié)果顯示，除0.5 mmol · L-1BTH 和1 mmol · L-1Pip 外，其余藥劑處理植株顯癥率均低于100%，且與對(duì)照植株都存在顯著差異；其中0.5 mmol · L-1NHP和2 mmol · L-1Pip 處理后植株顯癥率和病情指數(shù)均明顯低于對(duì)照，且0.5 mmol · L-1NHP 的相對(duì)防效最高，達(dá)到73.33%。根據(jù)植株的顯癥率和相對(duì)防效，篩選出各藥劑的最大適宜濃度，且按防效高低依次為：NHP（0.5 mmol · L-1）、Pip（2 mmol · L-1）、殼寡糖（1 g · L-1）、沒(méi)食子酸（0.5 g · L-1）、BABA（1 mmol · L-1）、BTH（0.1 mmol · L-1）。

2.2 復(fù)配藥劑對(duì)病毒的防治效果

2.2.1 2 種藥劑復(fù)配對(duì)病毒的防治效果 根據(jù)單一組分藥劑對(duì)病毒的防治效果，將篩選出的藥劑濃度兩兩混合，共設(shè)置11 個(gè)藥劑組合進(jìn)行防效試驗(yàn)，結(jié)果顯示（表2）：不同誘抗劑組合都對(duì)ZYMV 有一定的抑制作用，各處理病情發(fā)展速度均較對(duì)照慢。在對(duì)照組顯癥率達(dá)到100.00%時(shí)，有5 個(gè)藥劑組合處理的植株顯癥率低于50%，組合2-Ⅶ的顯癥率最低，僅為10.00%，其次為2-Ⅰ、2-Ⅴ、2-Ⅸ和2-Ⅺ，顯癥率分別為40.00%、30.00%、33.33%和25.00%；各藥劑組合的病情指數(shù)均明顯低于對(duì)照，其中2-Ⅶ、2-Ⅴ病情指數(shù)明顯低于其他處理，兩處理相對(duì)防效分別為89.99%、75.72%，其次為2-Ⅸ，相對(duì)防效為73.34%。在病毒接種15 d 后，組合2-Ⅸ的顯癥率最低，仍有20.00%的植株沒(méi)有明顯癥狀（圖2）。結(jié)合顯癥率增加速度和相對(duì)防效，2-Ⅶ的防治效果優(yōu)于2-Ⅸ。雖然組合2-Ⅶ處理過(guò)的植株顯癥率增長(zhǎng)明顯較對(duì)照組緩慢，但是該組合處理后的植株相對(duì)于對(duì)照植株生長(zhǎng)明顯矮小，并且生長(zhǎng)速度相對(duì)緩慢（圖3）。

表2 2 種藥劑復(fù)配組合對(duì)西瓜ZYMV 的防治效果

圖3 噴施誘抗劑組合2-Ⅶ后植株的生長(zhǎng)狀態(tài)

2.2.2 3 種藥劑復(fù)配對(duì)病毒的防治效果 根據(jù)單一藥劑和2 種藥劑復(fù)配的試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步設(shè)置了3 種藥劑的復(fù)配組合進(jìn)行防效試驗(yàn)（表3）。結(jié)果顯示（圖4），接種后11 d 時(shí)，無(wú)菌水對(duì)照組植株顯癥率達(dá)到100.00%，而3-Ⅰ、3-Ⅱ和3-Ⅲ組合的植株顯癥率低于50%，分別為27.27%、33.33%和47.06%；供試7 個(gè)復(fù)配組合的相對(duì)防效均在40%以上，3-Ⅰ、3-Ⅱ、3-Ⅳ、3-Ⅵ組合病情指數(shù)明顯低于其他組合，且3-Ⅰ、3-Ⅱ組合的相對(duì)防效分別為79.49%、68.27%，顯著高于其他組合。其中3-Ⅱ組合顯癥率增長(zhǎng)最慢，并且比對(duì)照病癥輕、長(zhǎng)勢(shì)更好（圖5），到接種后17 d 時(shí)仍有25.00%的植株沒(méi)有明顯癥狀。綜合顯癥率和相對(duì)防效，組合3-Ⅱ防治效果最好，顯癥率低且效果持久。

表3 3 種藥劑復(fù)配組合對(duì)西瓜ZYMV 的防治效果

圖4 3 種誘抗劑復(fù)配組合后植株的顯癥率

圖5 噴施處理3-Ⅱ和無(wú)菌水后10 d 植株及葉片表型

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)噴施3-Ⅱ、3-Ⅲ和3-Ⅵ組合后，12～24 h 內(nèi)植株會(huì)出現(xiàn)輕微過(guò)敏性壞死斑（圖6），其中3-Ⅱ組合出現(xiàn)過(guò)敏性壞死反應(yīng)的植株比例最高，為63.7%，3-Ⅲ為35.2%，3-Ⅵ為11.1%，表明復(fù)配后的藥劑可能會(huì)誘導(dǎo)植株產(chǎn)生過(guò)敏性壞死反應(yīng)從而增強(qiáng)植株的抗性。

圖6 噴施處理3-Ⅱ后24 h 植株產(chǎn)生過(guò)敏性壞死反應(yīng)

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)中，噴施藥劑組合2-Ⅶ后植株長(zhǎng)勢(shì)相比對(duì)照明顯變緩。Kim 等（2009）研究指出，免疫系統(tǒng)過(guò)度激活會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生不利影響，因此推測(cè)噴施2-Ⅶ組合的植株生長(zhǎng)遲緩可能與過(guò)度免疫反應(yīng)有關(guān)。因此，雖然誘抗劑的使用明顯降低了植株的顯癥率，但是上述誘抗劑的施用濃度、噴施間隔時(shí)間仍需調(diào)整優(yōu)化，以平衡植株抗病與生長(zhǎng)之間的關(guān)系。

Pip 及其衍生物NHP 是植物響應(yīng)病原體產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）的重要信號(hào)化合物。Návarová 等（2012）在研究擬南芥系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）時(shí)發(fā)現(xiàn)，丁香假單胞菌誘導(dǎo)的SAR 植株中能夠檢測(cè)到高濃度的Pip，而未接種葉片中則幾乎檢測(cè)不到。此外，Pip 還能夠誘導(dǎo)黃瓜增強(qiáng)對(duì)枯萎病菌的防御反應(yīng)，并加速上調(diào)SAR 相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄（Pazarlar et al.，2021）。除Pip 外，NHP 也是SAR 的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，可以從病原體侵染部位移動(dòng)至整個(gè)植株，并顯著累積，激活SAR 抗病系統(tǒng)（Schnake et al.，2020）。NHP 能夠誘導(dǎo)植物免疫基因的表達(dá)以增強(qiáng)防御能力，放大防御反應(yīng)，并且可以與防御激素水楊酸協(xié)同作用，促進(jìn)細(xì)胞過(guò)敏性壞死反應(yīng)，為植物在未來(lái)病原體攻擊的情況下有效地激活免疫系統(tǒng)做好準(zhǔn)備（Hartmann & Zeier，2018）。本研究中，Pip 及NHP 對(duì)西瓜ZYMV 具有較好的預(yù)防效果，可能與二者啟動(dòng)植株防御系統(tǒng)作用相關(guān)。

沒(méi)食子酸也在西瓜ZYMV 預(yù)防中展現(xiàn)出一定的作用。沒(méi)食子酸是一種多酚類(lèi)化合物，已被證明具有抗菌（Kang et al.，2018）、抗病毒（Mayela et al.，2016；You et al.，2018）、 抗 腫 瘤（Ho et al.，2010）、 抗 炎（Bai et al.，2021；Toyama et al.，2022）、抗氧化（Owumi et al.，2020；Nouri et al.，2021）等多種生物活性。前期研究發(fā)現(xiàn)，沒(méi)食子酸能夠誘導(dǎo)煙草植株的病程相關(guān)蛋白PRs 的表達(dá)（李紅霞，2010），并且沒(méi)食子酸的衍生物被證明能誘導(dǎo)植株產(chǎn)生抗病信號(hào)（李黔柱，2009），增強(qiáng)植物的系統(tǒng)抗病性。本研究結(jié)果也表明沒(méi)食子酸在西瓜ZYMV 的防治中具有潛在作用。

在本研究3 種藥劑復(fù)配的組合中，3-Ⅱ、3-Ⅲ和3-Ⅵ均不同程度地表現(xiàn)出HR 反應(yīng)，且這3 個(gè)組合均包含沒(méi)食子酸和Pip，進(jìn)一步表明這兩種誘抗劑可誘導(dǎo)西瓜植株產(chǎn)生抗病反應(yīng)。

除了Pip、NHP 和沒(méi)食子酸之外，BTH、殼寡糖和BABA 等其他誘抗劑在煙草花葉病毒（TMV）防治中也表現(xiàn)出良好的效果（趙淑請(qǐng)和郭劍波，2003；商文靜，2006；周程愛(ài) 等，2007）。然而，在本研究中BTH、殼寡糖和ABA 對(duì)于西瓜ZYMV的防效作用并不明顯，可能是因?yàn)椴煌参锛せ蠲庖呦到y(tǒng)的機(jī)制存在差異，并且處理時(shí)期、處理方法或處理濃度等因素也可能導(dǎo)致效果差異。因此，需要進(jìn)一步的試驗(yàn)來(lái)完善和優(yōu)化這些誘抗劑的使用，并深入研究其誘導(dǎo)植物抗病性的分子機(jī)理。

綜上所述，在瓜類(lèi)病毒病害的綠色防控中，Pip、NHP 和沒(méi)食子酸等誘抗劑具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。后續(xù)研究可以結(jié)合植物內(nèi)部抗性基因和生理生化指標(biāo)的變化，優(yōu)化藥劑復(fù)配比例、施用方法和施用部位，以實(shí)現(xiàn)最佳的誘導(dǎo)抗病效果，并為瓜類(lèi)病毒病害的有效防治提供方法和策略。