鏈霉菌FJS31-2外分泌物的挖掘及活性分析

李鈺宇,郭雨悅,王雪梅,王卓靈,蘇夏雨,劉冰欣,韓繼明*,楊 夢,岳昌武*

(1.巴中市中醫院,四川 巴中 636000;2.延安大學基礎醫學院,陜西 延安 716000;3.成都醫學院基礎醫學院,四川 成都 610500)

濫用抗生素導致耐藥菌感染成為人類第3大死亡原因,也給后抗生素時代新抗生素開發帶來極大挑戰[1]。現階段抗生素的開發需要在全新的策略指引下,綜合運用基礎醫學、生命科學、組合生物化學、化學生物學以及各種現代組學技術有目的地開發重點菌株,才能有效提高新抗生素發現效率,避免低水平重復發現[2]。鏈霉菌(Streptomycessp.)FJS31-2是從貴州梵凈山土壤中分離的一株具有極大新型活性產物挖掘潛力的菌株,在該菌株中已先后發現了Zunyimycin A～C系列抗生素[3-4]、米爾貝霉素系列衍生物[5]、UK-78623[6]等多種活性產物。基因組分析表明, 鏈霉菌FJS31-2基因組中包含7類共計約23個次級代謝產物合成基因簇,其中3個萜類基因簇、3個鐵離子載體類基因簇、2個Ⅱ型聚酮類基因簇、4個NRPS類基因簇、7個Ⅰ型聚酮類基因簇、3個羊毛硫抗菌肽類基因簇、1個ectoine基因簇,具有很大的挖掘潛力[7]。

作者通過培養基優化[8]、核糖體工程[9]對鏈霉菌FJS31-2外分泌物產生條件進行優化,對其主要活性產物的成分進行初步分析,并對其抗肝癌細胞MHCC97H活性進行分析,以期為鏈霉菌活性產物的開發提供物質基礎和技術積累。

1 實驗

1.1 菌株與試劑

鏈霉菌(Streptomycessp.)FJS31-2,從貴州梵凈山20 cm深地表土壤中分離得到,保存于中國普通菌種保存中心(菌保號:CGMCC 4.7321)。

萃取用試劑乙醇、異丙醇、乙酸乙酯、甲醇等均為分析純,成都科龍公司;抗生素,北京索萊寶公司;實驗用標準品,西格瑪-奧德里奇(上海)貿易有限公司;色譜用試劑,德國默克(Merck)集團;培養基,碧迪醫療器械(上海)有限公司。

1.2 外分泌物產生條件優化

1.2.1 培養基優化

在確定培養基種類后,通過調整碳源、氮源的組成和比例設計7種發酵培養基(表1),分別在培養7 d、14 d后觀察菌落形態、顏色及外分泌物積累情況,采用高效液相色譜法測定外分泌物產量,以確定鏈霉菌FJS31-2產生外分泌物的最優培養基。

表1 7種發酵培養基組成/(g·L-1)Tab.1 Components of 7 fermentation media/(g·L-1)

1.2.2 核糖體工程

核糖體工程激活活性產物生物合成。根據預實驗考察鏈霉菌FJS31-2對不同抗生素(鏈霉素、卡那霉素、利福平、慶大霉素,終濃度分別為5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1)的耐受量,最后選擇鏈霉素制備抗生素平板。在確定的最優培養基中加入不同濃度(2 μg·mL-1、4 μg·mL-1、6 μg·mL-1、8 μg·mL-1、10 μg·mL-1、12 μg·mL-1)的鏈霉素,以優化出可篩選出核糖體突變的亞致死量的最合適的鏈霉素濃度,劃線接種鏈霉菌FJS31-2,28 ℃靜置培養,挑取在亞致死量抗生素平板上存活的單菌落(可能是核糖體突變的菌落),繼續在含合適濃度抗生素的培養基平板上劃線培養,繼代3代后大規模接種,28 ℃靜置培養,分別在培養4 d、10 d時觀察菌落生長及外分泌物產生情況。每個濃度做3個平行。

1.3 外分泌物發酵及純化

待菌落發酵后,在固體培養基中加入等量乙酸乙酯,抽提3次,旋蒸后得到固體浸膏,加入甲醇或丙酮并與硅膠粉混勻,使溶劑揮發呈細沙狀。濕法裝柱,二氯甲烷-丙酮(體積比10∶1)洗脫。外分泌物過Sephadex LHS20(MeOH)柱(內徑2.5 cm,長75 cm),甲醇洗脫。RP-HPLC(XBridge BEH C18 Prep column,130 ?,10 mm×250 mm,5 μm)純化,在純度達到98%時,旋蒸,甲醇重溶。通過MS(Thermo-Finnigan LCQ DECA XP)和NMR(Bruker AV 600 MHz)對外分泌物進行分析。

1.4 外分泌物抗肝癌細胞MHCC97H活性分析

收集鏈霉菌FJS31-2外分泌物,于冷凍干燥機中凍干,稱重,將凍干物溶于超純水中配制成2 mg·mL-1的母液,備用。然后將肝癌細胞MHCC97H以1×104個/孔接種于96孔板中,待細胞長至80%融合度時,分別加入終濃度為32 μg·mL-1和50 μg·mL-1的外分泌物,并以50 μg·mL-1的順鉑(cisplatin)為陽性對照,分別于6 h、12 h、18 h、48 h、72 h、91 h測定細胞活性,考察培養時間對外分泌物抗肝癌細胞MHCC97H活性的影響,確定最適的培養時間。

將肝癌細胞MHCC97H以1×104個/孔接種于96孔板中,待細胞長至80%融合度時加入外分泌物,使終濃度分別為400 μg·mL-1、200 μg·mL-1、100 μg·mL-1、50 μg·mL-1、25 μg·mL-1、12.5 μg·mL-1,在培養72 h時中止培養,用顯微鏡觀察肝癌細胞MHCC97H形態及數量并拍照,采用磺酰羅丹明B(sulforhodamine B,SRB)比色法檢測細胞活性。

2 結果與討論

2.1 培養基對外分泌物的影響

鏈霉菌FJS31-2在7種培養基中分別培養7 d、14 d后的菌落形態、顏色及外分泌物積累情況如圖1所示。

圖1 不同培養基對鏈霉菌FJS31-2外分泌物的影響Fig.1 Effect of different media on extracellular secretion from Streptomyces sp.FJS31-2

由圖1可知,培養7 d,6#、7#培養基上的菌落顏色較1#～5#培養基上的明顯變黃(培養皿中黑點表示黃色或黃褐色菌落),同時菌落上開始有少量淡黃色外分泌物出現;培養14 d,6#、7#培養基上的菌落顏色變成明顯的黃褐色,同時菌落上開始有大量的黃褐色外分泌物出現,而2#～5#培養基上的菌落顏色沒有明顯變化,同時也未見外分泌物產生,1#培養基上的菌落開始部分變黃,同時有少量淡黃色外分泌物出現。表明,6#、7#培養基可促進鏈霉菌FJS31-2外分泌物的產生。

2.2 鏈霉素對外分泌物的影響

選擇7#培養基,分別添加2 μg·mL-1、4 μg·mL-1、6 μg·mL-1、8 μg·mL-1、10 μg·mL-1、12 μg·mL-1鏈霉素,分別培養4 d、10 d,考察鏈霉素對鏈霉菌FJS31-2外分泌物的影響,結果如圖2所示。

圖2 不同濃度鏈霉素對鏈霉菌FJS31-2外分泌物的影響Fig.2 Effect of different concentrations of Streptomycin on extracellular secretion from Streptomyces sp.FJS31-2

由圖2可知,在不同濃度鏈霉素的脅迫下,鏈霉菌FJS31-2外分泌物的生成情況不一樣;在2 μg·mL-1鏈霉素的脅迫下,鏈霉菌FJS31-2菌落數量最多,且培養4 d就開始有少量的淡黃色外分泌物出現,培養10 d有大量的黃褐色外分泌物出現。表明,2 μg·mL-1鏈霉素脅迫可促進鏈霉菌FJS31-2外分泌物的產生。

2.3 外分泌物的主要成分

將收集的鏈霉菌FJS31-2外分泌物用乙酸乙酯萃取,進行高分辨質譜(HRMS)分析(圖3),發現鏈霉菌FJS31-2外分泌物主要活性產物含有4種結構類似物,初步推斷其譜學特征符合四環萜類化合物,分子式為C28H40O2。

圖3 鏈霉菌FJS31-2外分泌物主要活性產物的HRMS圖譜Fig.3 HRMS spectrum of main active products in extracellular secretion from Streptomyces sp.FJS31-2

2.4 外分泌物的抗肝癌細胞MHCC97H活性

將鏈霉菌FJS31-2外分泌物與肝癌細胞MHCC97H共培養不同時間后,測定細胞活性,結果如圖4所示。

圖4 培養時間對外分泌物抗肝癌細胞MHCC97H活性的影響Fig.4 Effect of culture time on inhibition activity of extracellular secretion to hepatoma cell line MHCC97H

由圖4可知,外分泌物對肝癌細胞MHCC97H的抑制率隨著培養時間的延長逐漸升高,72 h后繼續延長培養時間,抑制率變化不大。因此,后續實驗在培養72 h后中止培養。

將鏈霉菌FJS31-2外分泌物與肝癌細胞MHCC97H共培養,外分泌物終濃度分別為400 μg·mL-1、200 μg·mL-1、100 μg·mL-1、50 μg·mL-1、25 μg·mL-1、12.5 μg·mL-1,培養72 h后中止培養,其顯微鏡照片如圖5所示,鏈霉菌FJS31-2外分泌物對肝癌細胞MHCC97H的抑制率如圖6所示。

圖5 鏈霉菌FJS31-2外分泌物與肝癌細胞MHCC97H共培養72 h后的顯微鏡照片Fig.5 Microscopic photos of extracellular secretion from Streptomyces sp.FJS31-2 co-cultured with hepatoma cell line MHCC97H for 72 h

由圖5、6可知,不同濃度的鏈霉菌FJS31-2外分泌物均能抑制肝癌細胞MHCC97H的生長,且大致呈濃度依賴性,200 μg·mL-1外分泌物對肝癌細胞MHCC97H的抑制率達到了84%(圖6)。

2.5 討論

通過培養基優化、核糖體工程對潛力菌株鏈霉菌FJS31-2的外分泌物進行了挖掘,盡管在其中發現了可能是新型結構的分子式為C28H40O2的四環萜類化合物,但由于產物產量較低、化合物結構較復雜,其結構的確定尚未完成;該化合物生物合成激活機制也有待進一步闡明;化合物雖然表現出抗肝癌細胞MHCC97H活性,但其它生物活性和作用機制尚需進一步研究。

3 結論

利用培養基優化、核糖體工程對鏈霉菌FJS31-2外分泌物進行了挖掘,并通過HRMS技術初步獲得了分子式為C28H40O2的四環萜類化合物,該化合物可抑制肝癌細胞MHCC97H的生長,并呈濃度依賴性。為從鏈霉菌FJS31-2中獲取新型抗生素奠定了基礎。