紅柳黃酮提取工藝優(yōu)化及其抗氧化、抑菌活性初探

李金芳,陳婷玉,付金環(huán),范可欣,高祎婷

(新疆第二醫(yī)學(xué)院,新疆 克拉瑪依 834000)

紅柳(TamarixchinensisLour)又名檉柳、西河柳等,為檉柳科檉柳屬植物的干燥細(xì)嫩枝葉,夏季花未開時采摘,陰干后入藥[1-2]。《本草綱目》中記載其“消痞,解酒毒,利小便”,《本經(jīng)逢原》記載其“去風(fēng),煎湯浴風(fēng)疹身癢效”,《本草備要》記載其“治痧疹不出,喘嗽悶亂”;另外,《東醫(yī)寶鑒》和《現(xiàn)代實用中藥》中也有相關(guān)記載。一些中亞國家自古以來也將紅柳用作民間醫(yī)藥[3]?，F(xiàn)代研究表明,紅柳含有黃酮類、萜類、有機酸類、酯類、揮發(fā)油類等成分[4],具有抗炎、抗氧化、抗菌、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、保肝等多種生理活性[5-11]。

目前,紅柳黃酮的提取方法主要有溶劑提取法、溶劑快速提取法、超聲提取法、微波提取法、超臨界提取法、仿生提取法等[12-13]。其中溶劑提取法操作簡單,較為常用,但存在提取率較低、提取時間較長、溶劑消耗量較大等缺點[14-15]。鑒于此,作者以紅柳黃酮得率為評價指標(biāo),先通過單因素實驗確定3因素3水平,再利用響應(yīng)面法優(yōu)化紅柳黃酮的提取工藝,通過測定紅柳不同部位黃酮提取物對DPPH自由基的清除率評價其抗氧化活性,并考察其對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌的抑菌活性,擬為紅柳藥用價值的開發(fā)提供依據(jù)。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

紅柳,采自新疆克拉瑪依。

無水乙醇(批號20230106)、乙酸乙酯(批號20221028),天津鑫鉑特化工有限公司;石油醚(批號2022128),天津富宇精細(xì)化工有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(批號P1646784)、維生素C(批號20220320)、蘆丁(批號1009H022),上海源葉生物科技有限公司;營養(yǎng)瓊脂(批號20230106),上海博微生物科技有限公司;氫氧化鈉顆粒(批號20161220),天津北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司;硝酸鋁(批號20161010)、亞硝酸鈉(批號20151109),天津盛奧化學(xué)試劑有限公司。

DK-98-Ⅱ型水浴鍋、SPX-250BⅢ型生化培養(yǎng)箱,天津泰斯特儀器有限公司;SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵,鄭州長城科工貿(mào)有限公司;YP202N型電子天平,上海菁海儀器有限公司;YXQ-50A型壓力蒸汽滅菌鍋,上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司;ZHJH-C1112B型智誠超凈工作臺,上海智誠分析儀器制造有限公司;分析天平,梅特勒-托利多科技(中國)有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠;可見分光光度計,上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確移取蘆丁對照溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL,分別置于25 mL容量瓶中,加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL,搖勻,靜置6 min;加入10%硝酸鋁溶液1 mL,搖勻,靜置6 min;加入4%氫氧化鈉溶液10 mL,用蒸餾水定容至刻度,靜置20 min后,測定510 nm處吸光度。以蘆丁對照溶液濃度(c,mg·mL-1)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1),擬合得線性回歸方程:A=10.471c+0.004,R2=0.9969。

圖1 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

1.3 紅柳黃酮得率的測定

取干燥的紅柳藥材,用粉碎機粉碎后,過40目金屬篩。稱取紅柳粉末,置于250 mL圓底燒瓶中,按一定料液比加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇,在一定溫度下提取一定時間;趁熱抽濾,旋蒸去除濾液中的乙醇,加入重蒸水、等量的石油醚,用分液漏斗萃取,棄去石油醚層;將水層用20 mL乙酸乙酯萃取2次后,合并乙酸乙酯層,旋蒸至干,用70%乙醇定容至100 mL;吸取2 mL,按1.2方法測定510 nm處吸光度,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算提取液中黃酮質(zhì)量。按式(1)計算紅柳黃酮得率:

(1)

1.4 紅柳黃酮的鑒別

鹽酸-鎂粉反應(yīng):在樣品溶液中加入少量鎂粉,再滴加1～2滴濃鹽酸,在沸水浴中加熱3 min,觀察溶液顏色變化。

Molish反應(yīng):取樣品溶液2 mL于試管中,滴加10%的α-萘酚2滴,振搖,沿試管壁滴加濃硫酸2 mL,觀察溶液界面顏色變化。

AlCl3反應(yīng):取樣品溶液點在濾紙上,滴加1%AlCl3乙醇溶液,晾干,觀察樣品斑點在可見光下及紫外光下的顏色。

聚酰胺層析:將紅柳莖、葉、花及全草提取液和蘆丁對照品分別點樣于聚酰胺薄層板上,飽和5～10 min后展開,展開劑為乙醇-水(體積比7∶3),噴以1%的AlCl3乙醇溶液,紫外燈下觀察。

1.5 紅柳黃酮提取工藝優(yōu)化

1.5.1 單因素實驗

采用單因素實驗,分別考察提取溫度(50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃)、料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30,g∶mL,下同)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%、80%、90%)、提取時間(0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h)對紅柳黃酮得率的影響。

1.5.2 響應(yīng)面實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上,選取對黃酮得率影響較大的3個因素:提取溫度(A)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)和提取時間(C),各取高(1)、中(0)、低(-1)3個水平,根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計進(jìn)行響應(yīng)面實驗,使用Design Expert 13.0.1.0軟件分析實驗數(shù)據(jù),進(jìn)一步優(yōu)化紅柳黃酮的提取工藝。

1.6 紅柳黃酮提取物的抗氧化活性評價

1.6.1 樣品溶液的制備

紅柳不同部位樣品溶液的制備:分別取紅柳的莖、葉、花及全草黃酮提取液適量,將其濃度調(diào)至2.00 mg·mL-1;再用蒸餾水依次稀釋至濃度分別為0.04 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1、0.12 mg·mL-1、0.16 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1的樣品溶液。

VC樣品溶液的制備:精密稱取200.0 mg VC粉末,置于100 mL容量瓶中,用蒸餾水溶解并定容至刻度,搖勻,得2.00 mg·mL-1的VC樣品溶液;再用蒸餾水依次稀釋至濃度分別為0.04 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1、0.12 mg·mL-1、0.16 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1的樣品溶液。

1.6.2 DPPH自由基清除能力的測定

精確稱取6.5 mg DPPH粉末置于100 mL棕色容量瓶中,加適量無水乙醇溶解并定容至刻度,即得DPPH自由基溶液,4 ℃保存,備用。

精密移取不同濃度的樣品溶液各3.00 mL置于10 mL試管中,加入DPPH自由基溶液3.00 mL,混勻,暗處放置30 min,用紫外可見分光光度計測定517 nm處吸光度(A1);以3.00 mL無水乙醇代替DPPH自由基溶液,同法操作,測定其吸光度(A2);以3.00 mL無水乙醇代替樣品溶液,同法操作,測定其吸光度(A0)。按式(2)計算DPPH自由基清除率:

(2)

1.7 紅柳黃酮提取物的抑菌活性評價

1.7.1 培養(yǎng)基、菌懸液和樣品溶液的制備

培養(yǎng)基的制備:取營養(yǎng)瓊脂33 g,置于1 000 mL蒸餾水中,加熱至完全溶解,121 ℃高壓滅菌15 min,取出冷卻,將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中,待其冷卻凝固,備用。

菌懸液的制備:分別取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白色念珠菌菌液各0.1 mL,加生理鹽水100 mL,稀釋成1 000倍菌懸液,備用。

樣品溶液的制備:取紅柳莖、葉、花及全草黃酮提取物干燥浸膏粉末各10 mg,溶于1 mL提取溶劑中,備用。

1.7.2 抑菌實驗

使用無菌移液槍分別吸取200 μL金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白色念珠菌菌懸液,分別置于3個裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中,用滅菌涂布棒均勻涂布,將每個培養(yǎng)皿劃分為5部分,均放置無菌的6 mm濾紙圓片;吸取紅柳莖、葉、花及全草黃酮提取液各20 μL,滴加至濾紙圓片上,并滴加20 μL生理鹽水作為空白對照,倒置于培養(yǎng)箱中,37 ℃培養(yǎng)24 h后取出,用十字交叉法測量抑菌圈直徑,重復(fù)操作3次,結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅柳黃酮的定性鑒別

通過鹽酸-鎂粉反應(yīng)、Molish反應(yīng)、AlCl3反應(yīng)和聚酰胺層析對紅柳提取物進(jìn)行定性鑒別(表1)。結(jié)果表明紅柳提取物中含黃酮類化合物。

表1 定性鑒別結(jié)果Tab.1 Results of qualitative identification

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 提取溫度對黃酮得率的影響(圖2)

圖2 提取溫度對黃酮得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on yield of flavonoids

從圖2可以看出,隨著提取溫度的升高,紅柳黃酮得率緩慢上升,當(dāng)提取溫度為80 ℃時,黃酮得率達(dá)到最高;繼續(xù)升高提取溫度,黃酮得率先緩慢下降而后急劇下降,當(dāng)升至100 ℃時,黃酮得率下降尤為明顯。這可能是由于,高溫下,黃酮類成分分解,導(dǎo)致黃酮得率下降。因此,選擇80 ℃作為響應(yīng)面實驗提取溫度的中心點。

2.2.2 料液比對黃酮得率的影響(圖3)

圖3 料液比對黃酮得率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on yield of flavonoids

從圖3可以看出,隨著料液比的減小,即提取溶劑用量的增加,紅柳黃酮得率緩慢上升,當(dāng)料液比為1∶20時,黃酮得率達(dá)到最高;繼續(xù)增加提取溶劑用量,黃酮得率逐漸下降。這可能是由于,提取溶劑過多,其它成分溶出量增多,導(dǎo)致黃酮得率下降。考慮到料液比對紅柳黃酮得率的影響較小,后續(xù)響應(yīng)面實驗中選擇料液比為1∶20。

2.2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮得率的影響(圖4)

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ethanol volume fraction on yield of flavonoids

從圖4可以看出,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加,紅柳黃酮得率逐漸升高,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時,黃酮得率達(dá)到最高;繼續(xù)增加乙醇體積分?jǐn)?shù),黃酮得率迅速下降。這可能是由于,乙醇體積分?jǐn)?shù)過大時,醇溶性雜質(zhì)的溶出量增加,導(dǎo)致黃酮得率降低。因此,選擇70%作為響應(yīng)面實驗乙醇體積分?jǐn)?shù)的中心點。

2.2.4 提取時間對黃酮得率的影響(圖5)

圖5 提取時間對黃酮得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on yield of flavonoids

從圖5可以看出,隨著提取時間的延長,紅柳黃酮得率緩慢上升,當(dāng)提取時間為2.0 h時,黃酮得率達(dá)到最高;繼續(xù)延長提取時間,黃酮得率下降。這可能是由于,在一定溫度下,提取時間過長,黃酮類化合物結(jié)構(gòu)被破壞,導(dǎo)致黃酮得率下降。因此,選擇2.0 h作為響應(yīng)面實驗提取時間的中心點。

2.3 響應(yīng)面實驗結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

響應(yīng)面實驗的因素與水平見表2,實驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面實驗的因素與水平Tab.2 Factors and levels of response surface methodologies

表3 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果Tab.3 Design and results of response surface methodologies

2.3.2 模型的建立及分析

對表3數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到二次多項式回歸方程:Y=4.888-0.155A+0.185B+0.5525C-0.5375AB+0.3675AC+0.1425BC-1.17025A2-1.10025B2-0.73525C2。

回歸模型的方差分析見表4。

表4 方差分析Tab.4 Analysis of variance

從表4可以看出,模型的P值<0.0001,說明模型極顯著;失擬項的P值>0.05,說明不顯著。模型的R2為0.978 1,表明該模型可靠。

2.3.3 響應(yīng)面分析

各因素交互作用對紅柳黃酮得率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖見圖6。

圖6 各因素交互作用對紅柳黃酮得率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.6 Response surface plots and contour plots for effect of interaction between various factors on yield of flavonoids from Tamarix chinensis Lour

通過響應(yīng)曲面坡度的陡峭程度,可以確定兩因素交互作用對響應(yīng)值的影響程度,坡度越陡峭說明交互作用越明顯。從圖6可以看出,等高線形狀均為橢圓形,響應(yīng)曲面均為開口向下的拋物面,其中提取溫度與乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度與提取時間的交互作用對紅柳黃酮得率的影響表現(xiàn)為比較陡峭的曲面,表明提取溫度與乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度與提取時間的交互作用對黃酮得率的影響顯著,與方差分析結(jié)果一致。

2.3.4 最佳工藝驗證

通過響應(yīng)面法優(yōu)化,得到紅柳黃酮的最佳提取工藝為:提取溫度79.666 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)71.162%、提取時間2.189 h,考慮到實際可操作性,將最佳提取工藝修正為:提取溫度79.7 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)71.0%、提取時間2.19 h,在此條件下進(jìn)行3次平行實驗,黃酮得率分別為5.29 mg·g-1、5.13 mg·g-1、5.31 mg·g-1,平均得率為5.24 mg·g-1,與預(yù)測值(5.01 mg·g-1)相差在5%以內(nèi),證實了預(yù)測值與實際值的良好相關(guān)性。

2.4 抗氧化實驗結(jié)果(圖7)

圖7 紅柳黃酮提取物對DPPH自由基的清除率Fig.7 Scavenging rate of DPPH free radicals by flavonoid extracts from Tamarix chinensis Lour

從圖7可以看出,隨著濃度的增加,紅柳不同部位黃酮提取物對DPPH自由基的清除率逐漸升高,但均低于VC;當(dāng)濃度為0.20 mg·mL-1時,紅柳莖、葉、花、全草黃酮提取物對DPPH自由基的清除率分別為90.32%、93.06%、92.42%、91.74%。

2.5 抑菌實驗結(jié)果(表5)

表5 抑菌實驗結(jié)果Tab.5 Results of antibacterial experiments

由表5可知,紅柳不同部位黃酮提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌均有一定的抑菌活性。其中,對金黃色葡萄球菌的抑菌活性強弱順序為:莖>全草>葉>花;對大腸桿菌的抑菌活性強弱順序為:花>全草>莖>葉;對白色念珠菌的抑菌活性強弱順序為:莖>葉>全草>花。這可能是由于,紅柳粗提物中含有多種其它成分,導(dǎo)致對不同菌株的抑菌活性不同。

3 結(jié)論

以紅柳黃酮得率為評價指標(biāo),通過單因素實驗和響應(yīng)面法優(yōu)化得到紅柳黃酮的最佳提取工藝為:提取溫度79.7 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)71.0%、提取時間2.19 h,在此條件下,紅柳黃酮得率為5.24 mg·g-1。紅柳不同部位黃酮提取物對DPPH自由基均有較強的清除能力,當(dāng)濃度為0.20 mg·mL-1時,對DPPH自由基清除率順序為:葉>花>全草>莖;紅柳不同部位黃酮提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白色念珠菌均有一定的抑菌活性。該研究為紅柳藥用價值的開發(fā)提供了新思路。