I型神經(jīng)纖維瘤病一家系基因檢測(cè)

余佳琳 梁嘉莉 劉翌菲 蔡 妍 張辰希 張曉穎 劉 成 李榮華

1廣東省東莞市大朗醫(yī)院皮膚科,廣東東莞,523770;2南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院皮膚科,廣東廣州,510515;3廣州醫(yī)科大學(xué)附屬武警廣東省總隊(duì)醫(yī)院皮膚科, 廣東廣州, 510517;4福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院皮膚科,福建泉州,362000

I型神經(jīng)纖維瘤病(neurofibromatosis type 1,NF1)是一種較常見的遺傳性神經(jīng)皮膚綜合征,發(fā)病率為1/3500,主要表現(xiàn)為皮膚牛奶咖啡斑、腋窩雀斑、虹膜lisch結(jié)節(jié)及神經(jīng)纖維瘤。本研究收集臨床診斷NF1的患兒,經(jīng)過二代測(cè)序及Sanger測(cè)序技術(shù)鑒定了NF1基因突變。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 患兒,女,10歲。因“全身多發(fā)咖啡斑10年,左眼瞼及上顎腫物3年”就診。患兒自出生起出現(xiàn)腋窩雀斑,牛奶咖啡斑,逐漸增多。3年前患兒出現(xiàn)左眼瞼及上顎腫物,逐漸增長(zhǎng),無疼痛,無視力下降,無進(jìn)食及吞咽困難。出生史無特殊,查體身高134.5 cm,體重28 kg,語言、運(yùn)動(dòng)及智力發(fā)育正常。皮膚科查體:全身散在皮膚咖啡牛奶斑,以軀干、腋窩、四肢等部位為主(圖1a)。左眼上瞼外側(cè)瞼板增厚,局部軟組織增生,邊界不清,表面組織無破潰,質(zhì)韌、無壓痛(圖1b)。右側(cè)上頜腭部一1 cm×0.8 cm粉色不規(guī)則腫物生長(zhǎng),質(zhì)地柔軟,邊界不清,與周圍組織粘連(圖1c)。患兒父母正常,均無皮膚咖啡牛奶斑和腫物。檢驗(yàn)檢查:血常規(guī)、肝腎功能、凝血四項(xiàng)、術(shù)前四項(xiàng)及頭顱MRI未見明顯異常。右側(cè)上頜牙齦腫物切除送病理活檢,鏡下見瘤細(xì)胞長(zhǎng)梭形,細(xì)胞胞漿嗜伊紅,細(xì)胞核長(zhǎng)梭形,部分細(xì)胞核卵圓形,染色質(zhì)細(xì)膩,未見核分裂象(圖1d)。免疫組化示EMA(-)、Actin(SMA)(部分+)、S-100(+)、SOX-10(+)、CD34(+)、NP(局灶+)、Ki-67(+,約1%),符合神經(jīng)纖維瘤。

1a:左眼眶腫物;1b:上顎腫物;1c:腋窩雀斑;1d:組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE,×200)

1.2 研究方法

1.2.1 基因組DNA 經(jīng)患兒及家屬知情同意,采集患兒及其父母外周靜脈血,使用Qiagen DNA Mini Kit試劑盒(Qiagen,中國(guó),上海)提取基因組DNA。

1.2.2 DNA文庫(kù)制備 通過S220 Focused-ultrasonicator儀器(Covaris, Massachusetts, 美國(guó))將1～3 μg的基因組DNA片段化至150 bp平均大小。使用文庫(kù)制備試劑盒(MyGenotics,中國(guó),北京),通過末端修復(fù)、接頭連接和PCR擴(kuò)增樣本,制備DNA文庫(kù),通過DNBSEQ(DNBSEQ-T7)進(jìn)一步測(cè)序。

1.2.3 目標(biāo)基因捕獲 使用骨骼疾病相關(guān)基因捕獲試劑盒(MyGenostics Inc,中國(guó),北京)對(duì)打斷的DNA文庫(kù)進(jìn)行捕獲。生物素標(biāo)記的捕獲探針設(shè)計(jì)包含所有基因的編碼外顯子以及外顯子上下游50 bp側(cè)翼區(qū)域,探針長(zhǎng)度為100 bp。利用Illumina Nextseq 500第二代測(cè)序儀對(duì)捕獲到的區(qū)域進(jìn)行雙端測(cè)序。

1.2.4 數(shù)據(jù)篩選與生物信息學(xué)分析 用cutadapt篩選MGI測(cè)序適配器和低質(zhì)量讀取(<80 bp)。在質(zhì)量控制之后,使用Sention將讀數(shù)映射到UCS hg19人類參考基因組。去除重復(fù)讀取,使用參數(shù)驅(qū)動(dòng)程序校正堿基,以便最終輸出BAM文件讀取中堿基的質(zhì)量值更接近與參考基因組,使用映射讀取來檢測(cè)變異。最后通過Sentieon軟件的參數(shù)驅(qū)動(dòng)程序檢測(cè)SNP和InDel的變異。將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為VCF格式,使用ANNOVAR軟件對(duì)變體進(jìn)行了進(jìn)一步注釋(http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/),并與多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)關(guān)聯(lián),如千人基因組、ESP6500、dbSNP、EXAC、內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)(Mygenotics)、HGMD,并用REVEL、SIFT、PolyPhen-2、MutationTaster等進(jìn)行變異有害性預(yù)測(cè)。

1.2.5 Sanger測(cè)序驗(yàn)證 獲得所有可用家族成員的基因組DNA,根據(jù)需要測(cè)序的DNA片段合成引物,用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)法進(jìn)行擴(kuò)增。將得到的產(chǎn)物進(jìn)行純化,純化后的PCR產(chǎn)物經(jīng)Sanger測(cè)序法(Biosune)測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用DNASTAR(Madison)軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)分析 患兒基因檢測(cè)平均測(cè)序深度為180.12,目標(biāo)區(qū)域覆蓋度為99.48%。

2.2 致病基因突變分析 全外顯子測(cè)序顯示患者17號(hào)染色體NF1基因內(nèi)含子2發(fā)生c.204+2T>G位點(diǎn)雜合突變(圖2a),導(dǎo)致第2個(gè)堿基由T變?yōu)镚,為剪切突變,經(jīng)過Sanger測(cè)序驗(yàn)證。根據(jù)ACMG指南,該變異初步判定為致病性變異(Pathogenic:PVS1+PS2+PS4+PM2_Supporting+PP4)。患兒母親(圖2b)和父親(圖2c)無該位點(diǎn)變異,患兒為自發(fā)雜合突變。

2a:先證者;2b:先證者的母親;2c:先證者的父親

3 討論

NF1是一種常染色體顯性遺傳性腫瘤性疾病,50%為自發(fā)突變[2]。NF1以咖啡牛奶斑、神經(jīng)纖維瘤和Lisch結(jié)節(jié)為特征,主要為皮膚、神經(jīng)、眼、骨骼及血管等器官及系統(tǒng)受累的一種易患腫瘤綜合癥。

NF1臨床癥狀主要為多發(fā)皮膚結(jié)節(jié)、咖啡牛奶斑、虹膜結(jié)節(jié)、腋下和腹股溝雀斑等特征性表現(xiàn)。根據(jù)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院制定及Legius更新的NF1診斷標(biāo)準(zhǔn),滿足以下2點(diǎn)即可診斷:(1)全身≥6處咖啡色斑,青春期前直徑>5 mm,青春期后直徑>15 mm;(2)≥2處任何類型的神經(jīng)纖維瘤或1處叢狀神經(jīng)纖維瘤;(3)腋窩和(或)腹股溝雀斑;(4)視神經(jīng)膠質(zhì)瘤;(5)≥2個(gè)虹膜結(jié)節(jié);(6)骨骼異常;(7)一級(jí)親屬患有NF1[3,4]。在本研究中,結(jié)合患兒臨床體征及影像學(xué)檢查資料,初步診斷為NF1。我們采用二代測(cè)序檢測(cè)患者的全外顯子,發(fā)現(xiàn)患者NF1基因內(nèi)含子2發(fā)生雜合突變,c.204+2T>G雜合突變,導(dǎo)致氨基酸發(fā)生剪切突變。該患者父母未發(fā)生該位點(diǎn)突變,提示該突變?yōu)樾掳l(fā)突變。

NF1基因定位于染色體17q11.2,跨越350 kb,包含60個(gè)外顯子(其中3個(gè)為選擇性剪接外顯子),編碼由2818個(gè)氨基酸組成的神經(jīng)纖維蛋白[5]。神經(jīng)纖維蛋白與RAS GTPase激活蛋白具有同源性,可通過加速Ras結(jié)合的GTP水解來負(fù)性調(diào)控RAS蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)[6]。當(dāng)NF1基因突變,神經(jīng)纖維蛋白表達(dá)下調(diào), Ras過度活化,下游通路持續(xù)激活,施萬細(xì)胞過度增殖,形成神經(jīng)纖維瘤[7]。NF1相關(guān)神經(jīng)纖維瘤可發(fā)生于全身各個(gè)部位。例如本研究NF1患兒的神經(jīng)纖維瘤發(fā)生于眼眶及上顎,影響患兒正常生活,首先手術(shù)治療,上顎及眼眶中午經(jīng)過手術(shù)治療切除了腫物,但并不能預(yù)防復(fù)發(fā)。其他傳統(tǒng)的治療方法如激光治療、放射療法和化學(xué)療法等,但效果有限且伴隨著較大的創(chuàng)傷性[8,9]。這些方法無法阻止瘤體的新發(fā)[10],因此在臨床上難以常規(guī)應(yīng)用,需要探討新的治療方法。

NF1基因突變引起Ras/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路異常激活是目前較為認(rèn)可的致病機(jī)制之一。因此,靶向抑制絲裂原活化蛋白激酶(MEK)是一種有效的靶向治療方法。司美替尼是一種高度選擇性口服小分子MEK抑制劑,能與MEK1/2的變構(gòu)抑制結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合,阻止MAPK通路異常活化[11,12]。于2020年4月獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn),用于治療2～18歲,有癥狀和/或進(jìn)行性、不可手術(shù)的NF1相關(guān)神經(jīng)纖維瘤[13]。還有許多MAPK處于研發(fā)及臨床試驗(yàn)中,為NF1患者帶來希望的曙光。

在本文中,我們對(duì)一例散發(fā)性的NF1患兒進(jìn)行了基因檢測(cè),明確了致病基因,并鑒定出一個(gè)國(guó)內(nèi)未曾報(bào)道過的新突變位點(diǎn)。這一發(fā)現(xiàn)豐富了NF1基因突變庫(kù),為NF1的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供了理論依據(jù)。另外,本研究患兒采用手術(shù)切除的方式去除了眼眶及上顎神經(jīng)纖維瘤,此后仍需要門診密切隨訪及多學(xué)科協(xié)助治療,以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)其他NF1臨床特征,進(jìn)而對(duì)疾病的嚴(yán)重程度做出評(píng)估,并較早采取合理的綜合干預(yù),提高患兒生存質(zhì)量。