間充質干細胞膜包載5-氨基酮戊酸介導的光熱作用抑制皮脂分泌

趙天奇,于 然,王余海,朱明姬

(吉林大學中日聯誼醫院 皮膚科,吉林 長春130033)

尋常痤瘡是一種累及毛囊皮脂腺單位的炎癥性疾病,針對皮脂腺的選擇性光熱作用是目前該疾病的研究熱點。5-氨基酮戊酸(ALA)介導的光動力療法(ALA-PDT)能有效治療痤瘡[1],ALA是強光敏劑原葉啉IX(PpIX)的前體,可富集于增殖旺盛的細胞內,生成大量PpIX,介導能量從光轉移到分子氧,進而產生活性氧。這些活性氧具有非常短的壽命和擴散半徑,迅速引發細胞毒性作用,造成細胞損傷,從而發揮作用[2]。但是ALA的親水性限制其在組織和細胞膜間的通透性,可影響其介導的光動力治療效果。本課題組前期研究發現臍帶來源的間充質干細胞膜可包載小分子藥物和金銀納米顆粒等,既能提高藥物的治療效果,又能減少藥物的副作用[3,4]。本文擬探討臍帶來源的間充質干細胞膜包載5-氨基酮戊酸(ALA@STCM)介導的光熱作用對金黃地鼠皮脂腺斑和皮脂分泌的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

(1)細胞復蘇:取出在液氮中凍存的細胞,放入提前預熱(37℃)的水浴鍋中,不斷搖晃凍存管使細胞在1 min內解凍。隨后,用酒精消毒凍存管外壁,使用移液槍吸取細胞凍存液并轉移至離心管中,離心(1 000 rpm,3 min)并棄上清,加入1 ml含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養基重懸細胞。

(2)細胞培養:使用含有10% FBS和100 IU/mL青鏈霉素的DMEM培養基培養人皮脂腺細胞系(SZ95,來自德國 Prof.Christos C.Zouboulis實驗室),并置于37℃、含有5%CO2的恒溫箱中培養[5]。使用含有10% FBS和100 IU/mL青鏈霉素的DMEM培養基培養臍帶來源的間充質干細胞(MSC),并置于37℃、含有5%CO2的恒溫箱中培養[3]。

(3)細胞凍存:使用倒置顯微鏡觀察細胞生長形態,取生長良好、細胞匯合度達到70%～80%的細胞凍存。凍存步驟如下:使用PBS清洗細胞兩次,加入約2 ml含EDTA的0.25%胰酶消化細胞。消化完全后,加入2 ml含10%FBS培養基終止消化,離心(1 000 rpm,3 min)并棄上清,加入1 ml凍存液(10% DMSO+90% FBS)重懸細胞,并轉移至凍存管中。將凍存管置于細胞程序降溫盒后,存放于-80℃冰箱過夜后液氮保存。

1.2 間充質干細胞膜微粒的制備

根據Gao等人的方法制備MSC膜微粒[6]。將培養好的MSC用胰蛋白酶進行消化,隨后進行離心(1 000 r/min,3 min)并收集細胞。使用PBS(4℃,10 mM,pH=7.4)徹底清洗收集的細胞,并使用經高壓過的去離子水重懸細胞,使其脹破。將上述混合物置于冰浴中孵育15 min,隨后進行離心(3 000 r/min,10 min)。取上清液進一步離心(13 000 r/min,30 min)后取沉淀得到MSC膜,重懸后保存在-80℃冰箱中待用。

1.3 ALA@STCM的制備

取出約4×106個MSC制作的MSC膜,室溫放置備用。將MSC膜溶液(0.3 mL,0.5 mg/mL)添加至ALA溶液(0.5 mL,0.2 mg/mL)中,并在水浴超聲下處理30 min。隨后,將混合溶液進行離心(10 000 r/min,5 min),沉淀即為制備好的ALA@STCM,將其重懸并保存備用。待其融化后使用。

1.4 ALA和ALA@STCM的CCK-8細胞毒性實驗

使用含有10%FBS的DMEM培養基將ALA和ALA@STCM分別稀釋至0 mM、0.02 mM、0.1 mM、0.25 mM、0.5 mM和1 mM備用。將SZ95細胞按照1×104/孔的密度接種至96孔板中培養24 h。隨后,將不同濃度的ALA和ALA@STCM分別加入對應孔中繼續孵育24 h。孵育后向每孔中加入10 μL CCK-8試劑,使用酶標儀測定每個孔中在450 nm處的吸光度數值。

1.5 實驗動物分組和痤瘡丙酸桿菌感染動物模型的建立

本研究以金黃地鼠背部的皮脂腺斑(金黃地鼠購于遼寧長生生物技術股份有限公司,體重80～120 g,雄性)為研究對象。實驗動物分組如下:(A)空白組;(B)接種痤瘡丙酸桿菌(P.acnes);(C)接種痤瘡丙酸桿菌(P.acnes)+濃度為5%的ALA;(D)接種痤瘡丙酸桿菌(P.acnes)+濃度為5%的ALA@STCM。上述實驗動物在處理后均給予紅光照射20 min。

對金黃地鼠(購于遼寧長生生物技術股份有限公司)進行脫毛處理,按照上述的實驗動物分組于背部皮脂腺斑處皮下注射P.acnes(25 μL/100 g體重)構建痤瘡丙酸桿菌感染動物模型。

1.6 組織學分析

對實驗動物給予1.5所述處理后,在治療后第10、20、30天于每組分別隨機處死3只金黃地鼠,取材于雙側皮脂腺斑。將取下的組織用福爾馬林溶液進行固定,采用蘇木精-伊紅(H&E)染色和油紅O(ORO)染色,通過顯微鏡進行組織學分析。

1.7 統計學分析

本研究的實驗數據以平均SD表示,圖表使用Graph Pad Prism制作,采用方差分析(ANOVA)或t檢驗進行統計分析,P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 ALA和ALA@STCM的CCK-8細胞毒性分析

如圖1所示,隨著ALA和ALA@STCM溶液濃度的升高,SZ95細胞的存活率有所減低,并且當濃度為0.02 mM時,可明顯抑制SZ95細胞的存活率。在相同濃度條件下,ALA@STCM溶液對于SZ95細胞活力的抑制作用低于ALA溶液,但差異無明顯的統計學意義。結果表明,使用MSC膜包載ALA未明顯增加細胞毒性,證明了MSC膜作為載藥工具的安全性。

圖1 ALA和ALA@STCM的CCK-8細胞毒性分析

制備濃度分別為0 mM、0.02 mM、0.1 mM、0.25 mM、0.5 mM和1 mM的ALA和ALA@STCM溶液。將不同濃度的藥物溶液與SZ95細胞共同孵育24小時,采用CCK-8試劑檢測細胞活力,實驗數據顯示為均值±SD。

2.2 ALA和ALA@STCM介導的光熱作用對于P.acnes感染的金黃地鼠皮脂腺斑和皮脂分泌的影響

圖2為空白組、模型組(接種P.acnes)、ALA組(接種P.acnes+ALA)和ALA@STCM組(接種P.acnes+ALA@STCM)于第10、20、30天時金黃地鼠背部皮脂腺斑情況,可觀察到模型組小鼠背部皮脂腺斑處出現腫脹,皮損表面粗糙。隨著時間的延長,ALA組和ALA@STCM組的小鼠背部皮脂腺斑的腫脹情況較前改善、皮脂腺斑面積較前減小,但ALA@STCM組的改善程度優于ALA組。

圖2 金黃地鼠背部皮脂腺斑情況

圖3為空白組、模型組、ALA組和ALA@STCM組于第10、20、30天時金黃地鼠背部皮脂腺斑H&E染色(40×)結果,可以觀察到給予光照后第10天ALA組和ALA@STCM組的金黃地鼠皮脂腺開始縮小,第20天和第30天時皮脂腺縮小程度更加明顯,并且ALA@STCM組的皮脂腺縮小程度顯著優于ALA組。

圖3 金黃地鼠背部皮脂腺斑H&E染色(40×)

圖4為空白組、模型組、ALA組和ALA@STCM組于光照后第10、20、30天時金黃地鼠背部皮脂腺斑ORO染色(40×)結果,可以觀察到ALA組和ALA@STCM組給予光照后明顯抑制金黃地鼠皮脂腺斑皮脂分泌,并且ALA@STCM組的抑制皮脂分泌的程度較ALA組更為顯著。

圖4 金黃地鼠背部皮脂腺斑ORO染色(40×)

3 討論

以甘油三酯(TGs)、角鯊烯和蠟酯為主要成分的皮脂分泌增加在促進痤瘡發生發展的過程中至關重要[7]。皮脂分泌的增加以及成分的改變不僅可誘導痤瘡皮損的形成,還會導致炎癥的產生等[8]。ALA所介導的光動力療法(ALA-PDT)可抑制皮脂分泌和縮小皮脂腺的大小[9-12]。ALA-PDT抑制皮脂分泌具體機制可能是通過AMPK/SREBP-1途徑抑制原代脂質分泌[11]。此外,ALA-PDT可以通過mTOR信號通路體外抑制SZ95細胞生長,從而減少脂質生成[12]。但是,5-ALA的親水性限制其在組織和細胞膜間的通透性,影響光動力療法的治療效果。

MSCs具有向潛在炎癥和病變附近的高度遷移的先天靶向能力[13-14],因此MSC膜包被納米顆?；蛩幬锸且环N具有選擇性、靶向特性的有效遞送方法[15],有望成為未來新的載藥工具。研究表明,MSC膜包載異維A酸具體提高異維A酸的透皮吸收效率、控制異維A酸的釋放、減小藥物的刺激性等特點,為痤瘡的的經皮給藥提供了新的選擇[4]。

本研究探討了新型的ALA給藥方式,利用臍帶來源的間充質干細胞(UC-MSCs)膜包載ALA進行體內、體外研究。首先,我們對比了不同濃度下ALA和ALA@STCM對于SZ95細胞存活率的影響,發現了MSC膜包載ALA未明顯增加細胞毒性,上述結果提示著MSC膜的應用具有安全性。隨后,我們構建了金黃地鼠痤瘡動物模型,通過組織學分析(H&E、ORO染色),發現了ALA@STCM組金黃地鼠縮小皮脂腺斑和抑制皮脂分泌作用顯著優于ALA組,上述結果提示著MSC膜包被的藥物遞送系統提高了ALA的效能。

本研究的結果為開發新的痤瘡藥物給藥工具提供了線索,但仍存在局限性,本文只探討了5-ALA@STCM的毒性和抑制皮脂分泌的能力,尚有許多值得研究的方向,如:5-ALA@STCM對于毛囊微生物、皮脂腺炎癥的影響等,未來仍需研究其長期有效性和安全性。

總之,間充質干細胞膜包載5-ALA介導的光熱作用抑制金黃地鼠皮脂腺斑的皮脂分泌以及縮小皮脂腺斑的作用顯著優于5-ALA組,值得未來進一步研究與探索。