科羅索酸調控FGF15逆轉NAFLD抑制ALPPS誘導肝再生的研究

邢 琳,石佳成,葉方旺,趙金偉

(吉林大學第二醫院 肝膽胰外科,吉林 長春130022)

聯合肝臟分隔和門靜脈結扎二步肝切除術(ALPPS)是肝臟外科領域的新技術,為剩余肝體積(FLR)過小的病人提供再次手術機會,改善了手術的制約性[1]。脂肪肝病人經歷肝臟大部切除術后肝臟體積恢復較慢,發生并發癥及死亡率的風險較高[2],另外,動物實驗研究表明,非酒精性脂肪肝(NAFLD)降低了ALPPS術后肝臟再生能力[3]。研究表明,成纖維細胞生長因子(FGFs)可維持膽汁酸代謝平衡,增加胰島素的敏感性,降低血清膽固醇及甘油三酯水平,降低體重,可通過增加糖原及蛋白質合成來調節細胞能量代謝,也可增強細胞增殖和肝臟再生。肝部分切除術后膽汁酸減少,上調腸源性細胞因子FGF15(鼠源性)或FGF19(人源性)對肝臟再生有明顯的損傷作用[4]。科羅索酸(CA)目前已作為治療和預防肥胖和II型糖尿病的藥物,在動物實驗和臨床試驗中取得了極佳的效果。因此,我們推測,CA可通過調控FGFS逆轉NAFLD抑制ALPPS誘導肝再生作用。本文采用建立NAFLD大鼠ALPPS模型,探討CA上調FGF15改善NAFLD,進而促進ALPPS誘導肝再生。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗動物采用56只4～6周齡(體重180～200 g)雄性SD大鼠,購于吉林大學實驗動物中心,按照動物的標準飲食(SD)及高脂飲食(HFD):42% 脂肪,14%蛋白質和44%糖類) 及飼養條件飼養6周。

1.2 實驗方法

1.2.1麻醉、手術及分組 SD大鼠采用0.3%戊巴比妥鈉1 ml/kg行腹腔注射麻醉,麻醉生效后,常規腹部脫毛消毒,正中切口開腹,分離肝周韌帶,游離肝臟。分別分離結扎右肝葉門靜脈支,分離結扎左外側葉和左中葉的門靜脈支共干,切除尾狀葉,執行中肝葉沿著缺血線原位劈離,完成ALPPS操作。每組12支大鼠分別于術后第3天,第10天腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉1 ml/kg麻醉下處死大鼠,針刺心臟采血,肝臟標本稱重后并留取部分肝臟組織標本,保存于-80℃冰箱,備用。部分肝臟組織浸泡于4%福爾馬林溶液24 h,心臟穿刺收集血液標本,血清保存于-80度冰箱中,保存備用。第3組大鼠術后第三天起,按20 mg/kg給予CA,腹腔注射給藥,隔日給藥。所有實驗在手術顯微鏡下完成,肝臟實質離斷采用雙極電凝刀完成。實驗分為3組:(1)標準飲食SD大鼠ALPPS組(12只);(2)HFD大鼠ALPPS組(12只);(3)HFD大鼠ALPPS+CA組(12只)。

1.2.2肝臟再生率 建立NAFLD模型后,標準飲食及高脂飲食大鼠各10支麻醉后處死,離體取出FLR,使用實驗微量電子秤稱重(Ohaus Corporation,Pine Brook,NJ USA).肝臟右中葉再生率(HRR)采用如下公式計算:HRR=(WA-WI)/WI×100%,WA:死亡時右中葉的實際重量WI:手術前右中葉的初始重量,右中葉的初始重量采用如下公式計算:WI=體重×0.97%(0.85%)。

0.97%;0.85%分別代表10只標準飲食SD雄性大鼠(體重240～290 g)右中葉與體重平均百分比和10只高脂飲食SD雄性大鼠(體重410～500 g)右中葉與體重平均百分比。

表1 正常大鼠,NAFLD大鼠及CA治療后大鼠相關因子及生化指標水平變化

1.2.3生化分析 TCHO,TGs,AST,ALT采用血清生化分析儀,使用商用檢測試劑盒檢測(南京建成生物公司)。FGF15(ABclonal,A1013)濃度使用ELISA 試劑盒檢測。

1.2.4組織化學分析 福爾馬林浸泡后的組織標本采用石蠟處理,使切片成4 μm并經脫蠟處理,采用處理程序進行脫蠟及水化處理:使用降濃度的乙酸(100% 95% 75%)處理后于二甲苯內20 min,然后采用雙蒸餾水進行洗脫,拉伸修復,采用商用試劑盒提供的緩沖液處理,切片使用3%過氧化氫溶液和含有5%小牛血清進行封閉。試劑盒購于AB公司,為鑒定壞死組織區域,肝臟組織采用HE染色。所有切片均由有經驗的病理學專家評估。

2 結果

2.1 大鼠NAFLD的誘導及CA(CA)的治療作用

在NAFLD大鼠肝臟可見小泡狀脂肪沉積,伴散在大泡狀脂質沉積,CA治療10天后脂肪沉積減少(如圖1所示);NAFLD大鼠血清FGF15,AST,TCHO 和 TG水平明顯高于普通飲食大鼠,而應用CA后,血清FGF15,AST,TCHO 和 TG水平下降接近普通飲食大鼠的水平(如表1所示)。

圖1 正常大鼠,NAFLD大鼠及CA治療后大鼠肝臟組織學變化(HE×200)

2.2 經歷ALPPS手術后的各組大鼠FLR的HRR

如圖2所示,正常組和NAFLD組及CA干預組大鼠ALPPS模型中,在術后(POD)3天(1),NAFLD組的肝細胞增值率(HRR)明顯低于正常組,但應用CA干預后,HRR升高,與正常組無明顯差異,提示CA可逆轉NAFLD所致的肝再生延遲(如圖3所示);同樣在POD7(2),NAFLD組的HRR明顯低于正常組,但應用CA干預后,HRR升高,與正常組無明顯差異,二者相比,差異顯著,P值均小于0.05.(如圖3所示)。

圖2 正常和NAFLD及CA干預組大鼠ALPPS模型

圖3 經歷ALPPS的正常和NAFLD及CA干預組大鼠HRR比較

3 討論

采用高脂飲食誘導SD大鼠NAFLD模型發現,NAFLD大鼠血清FGF15水平明顯低于正常大鼠血清FGF15水平,NAFLD大鼠血清膽固醇及甘油三酯水平明顯高于正常大鼠,CA的干預可逆轉肝臟脂肪沉積及下調血清膽固醇及甘油三酯水平及FGF15水平,提示CA可通過下調血清FGF15改善肝臟脂肪沉積。通過建立NAFLD大鼠ALPPS模型發現:脂肪沉積使ALPPS誘導的肝臟再生能力下降 CA可減少NAFLD大鼠的脂肪沉積并改善ALPPS誘導肝臟再生延遲;另外,CA逆轉FLR增殖延遲與血清FGF15水平變化相關。

研究表明,成纖維細胞生長因子19(FGF19)是一種回腸源性腸因子,成纖維細胞生長因子(FGFs)可維持膽汁酸代謝平衡,增加胰島素的敏感性,降低血清膽固醇及甘油三酯水平,降低體重,可通過增加糖原及蛋白質合成來調節細胞能量代謝,也可增強細胞增殖和肝臟再生。肝部分切除術后膽汁酸減少,上調腸源性細胞因子FGF15(鼠源性)或FGF19(人源性)對肝臟再生有明顯的損傷作用[4]。最近的數據表明FGF19在人類的代謝紊亂中發揮一定的作用,具有代謝綜合癥的病人血清FGF19水平可下降65%,同時FGF19也是代謝綜合癥的危險因素[5]。基于FGFs與代謝綜合癥的相關性,我們采用動物實驗也證實了NAFLD大鼠的FGF15水平明顯下降。我們前期的研究結果表明,NAFLD可延遲大鼠ALPPS誘導的肝再生[6],推測NAFLD大鼠肝再生能力下降可能與FGF15相關。科羅索酸,作為治療和預防肥胖和Ⅱ糖尿病的藥物在動物實驗和臨床試驗中取得了極佳的效果,本實驗采用CA干預NAFLD大鼠,發現CA減少了大鼠的脂肪沉積,下調外周血膽固醇及甘油三酯水平,隨之血清FGF15水平較用藥前明顯升高,這提示CA抑制大鼠NAFLD可能與上調FGF15水平密切相關。

為了進一步驗證CA逆轉NAFLD 延遲大鼠ALPPS誘導肝再生的能力,我們建立了NAFLD大鼠的APLLS模型,并采用CA予以干預治療,結果發現,術后第3天及第10天,ALPPS誘導肝再生的HRR在藥物治療組明顯高于非用藥組,提示CA可提高NAFLD大鼠的肝再生能力,可能與上調體內FGF15水平密切相關。

綜上所述,NAFLD大鼠血清FGF15水平下降,CA可逆轉大鼠的血脂水平及FGF15水平,提示CA可通過上調血清FGF15濃度來逆轉NAFLD進而促進ALPPS誘導肝再生的能力。本課題為CA治療NAFLD的臨床及基礎研究奠定了良好的實驗基礎。