改良Videman法構建兔膝骨關節炎模型的探索

羅嬈珊 唐青梅 龔 廣 余立志 羅三彤 梁偉明

廣西科技大學第一附屬醫院，廣西柳州 545000

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是多種因素引起的退行性疾病，以關節軟骨退化變性、軟骨增生、骨贅形成和軟骨下骨硬化為主要病理特征；以關節疼痛、關節活動障礙為主要臨床表現[1-2]。任何年齡段均可發病，但以中老年多見，多發于活動負重過度或承重失衡的關節，隨著我國老齡化人口的增加，發病率也隨之增高[3]。KOA尚無徹底治愈的方法，其發病機制也尚未完全闡明。因此，積極探索KOA發病機制和防治措施，開發新治療技術、方法，對提高臨床療效具有重要的作用[4]。制作穩定的、符合疾病發展規律的KOA動物模型是保證成功開展KOA研究的關鍵環節[5]。

研究人類KOA發病機制、治療策略時，經常會使用KOA動物模型。關節制動是KOA動物造模的常用方法之一，它是通過各種方法固定關節，使關節應力發生改變，從而造成關節損傷[6]。經典的Videman造模法通過伸直位固定建立KOA模型，是關節制動造模法的一種[7]。本研究參考經典的Videman造模法，經過一定的改良，探索出一種膝關節伸直位夾板固定法構建兔KOA模型，并從多個方面對兔KOA模型進行綜合評價，為構建KOA動物模型提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑、儀器

健康新西蘭兔12只，雄性，體重2.5～3.0 kg，由湖南太平生物科技有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2020-0005。室溫條件下分組飼養，自由飲食，本研究經廣西科技大學第一附屬醫院（本院）醫學倫理委員會審查批準（倫理審批號：2023-DW023）。10%甲醛、10%硝酸、番紅O軟骨染色液（北京索萊寶科技有限公司），兔子飼養架、兔專用固定盒、醫用夾板、卡扣自鎖式尼龍塑料扎帶，RM2235型輪轉式切片機（德國Leica公司），BX53型正置熒光生物顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 動物分組

健康雄性新西蘭兔按照隨機數表法分為對照組、模型組，每組各6只。對照組：室溫正常飼養，不做任何處理；模型組：室溫正常飼養1周后，使用醫用夾板將兔右膝關節伸直位固定，每次固定60 min，每天2次，持續4周。

1.3 造模方法

選取并裁剪寬、長合適的醫用夾板。將兔的右下肢膝關節完全伸直，使用一層醫用棉墊包裹右下肢防止皮膚壓傷。在右下肢前、后、內、外四周各放置一塊醫用夾板，夾板近端靠近大腿根部，遠端靠近小腿遠端。用5根卡扣自鎖式尼龍塑料扎帶均勻捆綁4塊醫用夾板并扣緊，將右下肢膝關節固定在伸直位。足部及腳趾端露出以便于觀察血流是否通暢，防止缺血性壞死。固定后將兔放入兔專用固定盒，防止兔劇烈掙扎或啃咬導致醫用夾板松動。固定60 min后拆卸醫用夾板，每天上午、下午各操作1次，共計4周。

1.4 測量及觀察指標

1.4.1 行為學評估 造模結束后，將每只兔子分別放于水平地板上自由活動，參照Lequesne MG評分標準[8]分別對兔子的局部疼痛、步態改變、關節活動、關節腫脹情況進行觀察并記錄、評分。

1.4.2 取材及膝關節標本大體形態觀察 行為學評估結束后，采用空氣栓塞法處死兩組兔子，剪開皮膚、分離肌肉，充分暴露膝關節軟骨，截斷并取膝關節標本。觀察并記錄膝關節大體形態、膝關節間隙及軟骨的改變。取脛骨、股骨端，放入體積分數為10%的甲醛溶液中固定12 h，經固定后的標本，放入10%硝酸脫鈣48 h，以矢狀面將脛骨、股骨端（包含軟骨下骨）分別切取4塊骨組織（每塊厚2 mm）做石蠟包埋。

1.4.3 作病理切片及改良Mankin’s關節軟骨病理評分 取每一塊骨組織石蠟標本于石蠟切片機上連續切取3 μm厚的矢狀切面，每隔5張取兩張制片做番紅O染色，每一塊骨組織石蠟標本制片1～2張，在光鏡下對軟骨各層結構進行觀察并記錄。每張切片選取3個不同視野，參照改良Mankin’s關節軟骨病理評分標準[9]，對軟骨結構、軟骨細胞、基質染色及潮線完整性進行評分并統計。番紅O染色：骨組織切片常規脫蠟、水化，放入軟骨染色液（番紅O法）內侵染1～2 min，蒸餾水洗1 min；分別用95%乙醇、無水乙醇脫水；二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.5 統計學處理

采用SPSS 26.0統計學軟件處理數據，不符合正態分布的計量資料用[M（P25，P75）]表示，采用秩和檢驗。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組兔子行為學Lequesne MG評分比較

對照組無局部疼痛，無關節腫脹，步態、關節活動均處于正常狀態，各項評分為0；模型組患肢步態不正常，觸碰突然收縮、關節活動障礙、有輕度腫脹、骨性標志模糊，綜合得分為[2.00（0.00，8.00）]分，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表1。

表1 兩組兔子行為學Lequesne MG評分比較[分，M（P25，P75）]

2.2 兩組兔子膝關節標本形態觀察比較

對兩組膝關節標本行肉眼觀察，對照組大體標本無明顯腫大，軟骨結構正常，表面光滑；模型組腫大明顯，關節腔隙變窄，軟骨部分磨損，表面質地粗糙，見圖1。

圖1 兩組大體標本比較

2.3 兩組兔子番紅O染色及改良Mankin’s關節軟骨病理評分比較

如圖2所示，對照組軟骨表層平整光滑，軟骨細胞形態、大小、數量正常，分布均勻，排列整齊，軟骨4層細胞結構清晰可見，由淺到深各層細胞呈逐漸增大，基質染色正常，潮線完整；模型組軟骨表層不平整，軟骨明顯增生，軟骨細胞增加且簇集，細胞形態、大小呈多樣性、細胞排列不規則，全層軟骨組織結構紊亂，基質染色減少，潮線不完整。根據改良Mankin’s關節軟骨病理評分標準對兩組分別進行評分并統計。對照組各項評分為0，模型組各項評分均高于對照組，其中模型組綜合得分為[3.00（0.00，7.50）]分，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表2。

表2 兩組兔子改良Mankin’s關節軟骨病理評分比較[分，M（P25，P75）]

圖2 兩組兔子番紅O染色膝關節軟骨病理形態學比較（400×）

3 討論

哺乳動物的關節、半月板、韌帶和軟骨在相對尺寸上與人類相似，但不同的實驗動物有不同的優點和缺點[10]。兔子易飼養、易獲取，建模操作方便，膝關節軟骨薄，適合早期骨關節炎模型的研究。本研究選擇兔子探索一種簡便、易控的KOA動物造模方法，旨在為KOA的病理研究創造基礎。KOA動物模型分為自發模型、手術模型和非手術模型[11]。關節制動法是非手術KOA動物造模法的常用方法之一，其中最經典的關節制動法是Videman造模法。

本研究預實驗采用Videman法構建兔KOA模型，用管型石膏固定兔膝關節于伸直位，但兔子活動過程中石膏容易脫落，最終造模失敗。后經改良，使用醫用夾板替代管型石膏，卡扣自鎖式尼龍塑料扎帶來替代繃帶，操作更為簡便、牢靠、省時。將固定膝關節于伸直位的兔子，置于兔專用固定盒，避免兔子劇烈活動致使醫用夾板固定不牢，進而提高造模成功率。改良Videman法構建KOA模型也存在不足之處，兔膝關節固定后對肢體造成腫脹、僵硬，骨性突起部位、下肢皮膚等容易壓傷，兔子啃咬固定部位，致固定不牢靠等情況也會有發生，無法避免。

易強等[12]的研究結果顯示，與正常組比較懸吊組Lequesne MG評分均顯著升高（P＜ 0.01），懸吊組膝關節軟骨大體觀察可見典型的軟骨破壞符合膝骨關節炎病理學改變，懸吊組Mankin’s評分均顯著升高（P＜ 0.01），達到輕中度骨關節炎的評分等級。李東東等[13]的研究結果表明，與假手術組相比模型組動物行走困難，膝關節軟骨組織損傷嚴重，局部軟骨面缺損，軟骨細胞排列紊亂，軟骨細胞數量減少，部分軟骨層丟失，缺失區域存在纖維組織增生情況，Lequesne MG評分、Mankin評分高于假手術組，經骨痹散治療后評分均降低，且差異有統計學意義（P＜ 0.05）。張勁等[14]的研究顯示，新型組、傳統組均可見關節囊明顯增厚，關節液黃色渾濁，關節軟骨呈灰黃色，表面凹凸不平，部分有壞死脫落。姜鈴霞等[15]在觀察實驗性軟骨損傷（實驗性骨關節炎）病理分期的結果表明，造模術后第2、4、8、12、16、20周Mankin’s評分均比對照組（術前）高，且術前為0.33分，術后20周得分最高13.00分。

本研究持續造模4周后結束。研究結果顯示，模型組Lequesne MG評分較對照組明顯升高，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與對照組比較，模型組膝關節腫大，關節腔隙變窄，軟骨部分磨損，表面質地粗糙；番紅O染色模型組呈基質染色明顯減少，軟骨表層不平整，軟骨組織結構紊亂，軟骨增生，軟骨細胞增加、簇集，細胞形態多樣、排列不規則等病理特征；模型組改良Mankin’s關節軟骨病理評分較對照組明顯升高，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。本研究雖未開展HE染色、免疫組織化學等其他病理學相關實驗。但模型組膝關節形態特征、番紅O染色、Lequesne MG評分及改良Mankin’s關節軟骨病理評分的結果與上述研究結果一致。因此，改良Videman法構建KOA模型，使用膝關節伸直位醫用夾板固定建立兔KOA模型可行，且操作簡便、高效。這為構建KOA動物模型提供了參考，有利于膝骨關節炎發生發展機制以及治療的研究，并為其提供建模依據。