HPLC法測(cè)定溴芬酸鈉滴眼液中聚合物的含量

吳永芹 薛 雯 孟 龍 王 軍 韓 勇 張 瑩

1.山東省濟(jì)寧市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，山東濟(jì)寧 272073；2.山東省食品藥品審評(píng)查驗(yàn)中心，山東濟(jì)南 250014

溴芬酸鈉,即[2-氨基-3-（4-溴苯甲酰基）苯基]乙酸鈉，其制劑0.1%溴芬酸鈉滴眼液于2000年在日本上市，于2015年在國(guó)內(nèi)批準(zhǔn)生產(chǎn)上市。0.1%溴芬酸鈉滴眼液臨床應(yīng)用較廣，主要用于外眼部及前眼部的炎癥的治療，如眼部手術(shù)后的炎癥、結(jié)膜炎等癥狀，其作用強(qiáng)度是其他非甾體抗炎藥的十倍，臨床效果顯著[1-6]。配方中的增稠劑聚維酮K30在儲(chǔ)存過(guò)程中與溴芬酸鈉發(fā)生聚合反應(yīng)，生成聚合物雜質(zhì)U-Ⅱ，會(huì)降低主藥含量，同時(shí)使藥液黏性下降，療效降低，聚合物雜質(zhì)U-Ⅱ的產(chǎn)生同時(shí)增加了使用過(guò)程中的不良反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。本研究建立HPLC對(duì)溴芬酸鈉滴眼液中產(chǎn)生的聚合物的含量進(jìn)行測(cè)定，為控制其藥品質(zhì)量提供方法依據(jù)。

1 儀器與試藥

LC-2030C型高效液相色譜儀（DAD檢測(cè)器）（日本島津）；流動(dòng)相吸附柱（4.6 mm×50 mm）（中譜科技），色譜柱：Waters C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；TE214S型電子天平、BS21S型電子天平[賽多利斯科學(xué)院儀器（北京）有限公司]；FE28酸度計(jì)（梅特勒-托利多儀器有限公司）、磷酸氫二鉀（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，優(yōu)級(jí)純）；乙腈（天津四友，HPLC級(jí)）；磷酸（阿拉丁，HPLC級(jí)）；超純水（實(shí)驗(yàn)室自制，電阻率18.2 MΩ）；溴芬酸鈉對(duì)照品（LGC，W1008660）；聚維酮對(duì)照品（中檢院，批號(hào)：190070-201501），溴 芬 酸 鈉 滴 眼 液[批 號(hào)：0A0021M10、0A0011M10（A廠 家），1907033101、1907053101、1912073102、2001013101、2001033101、2006043101、2007063101、2007083101（B廠家），P432（C廠家）]。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

流動(dòng)相A為0.05 mol/L磷酸氫二鉀溶液（pH 4.5）-乙腈（75∶25），流動(dòng)相B為乙腈；梯度洗脫：0～5 min（0%B），5～10 min（0%→28%B），10～30 min（28%B），30～30.1 min（28%→0%B），30.1～60 min（0%B）；柱溫30℃，流速1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)400 nm，進(jìn)樣量20 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取溴芬酸鈉對(duì)照品10.01 mg，置100 ml棕色量瓶中，加入30 ml流動(dòng)相A，振搖使對(duì)照品溶解，用流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液①，精密量取1 ml，置100 ml棕色量瓶中，用流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取溴芬酸鈉滴眼液2 ml，置10 ml棕色量瓶中，加入流動(dòng)相A振搖并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 聚維酮K30陰性對(duì)照溶液的制備 制備不含聚維酮K30的陰性供試品，精密量取2 ml，置10 ml棕色量瓶中，加流動(dòng)相A振搖并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 聚維酮K30對(duì)照溶液的制備 取聚維酮K30原料，加流動(dòng)相A制成濃度為2 mg/ml的溶液。精密量取2 ml，置10 ml棕色量瓶中，加流動(dòng)相A振搖并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 專屬性試驗(yàn)考察

精密吸取上述溶液各20 μl進(jìn)樣測(cè)定，見(jiàn)圖1，結(jié)果表明，聚合物峰與相鄰色譜峰分離良好，出峰時(shí)間約為10 min，陰性對(duì)照無(wú)干擾，在400 nm波長(zhǎng)處聚維酮K30無(wú)吸收，對(duì)聚合物的測(cè)定無(wú)干擾。

圖1 專屬性試驗(yàn)色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取2.2.1下不同體積的對(duì)照品溶液①，置50 ml棕色量瓶中，用流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，制備得到濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、5.0、10.0 μg/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密吸取20 μl，進(jìn)樣測(cè)定，以濃度C（μg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積A（μv·ms）為縱坐標(biāo)作圖，得到其回歸方程為A=11463.95C-130.90，r=0.9995，結(jié) 果 表 明 在 進(jìn) 樣 量 為20 μl時(shí)，在0.1～10.0 μg/ml濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。見(jiàn)圖2。

圖2 線性關(guān)系曲線圖

2.5 精密度試驗(yàn)

精密量取對(duì)照品溶液（濃度為1 μg/ml），進(jìn)樣6次，峰面積（μv·ms）分別為14 484、14 433、14 459、14 535、14 499、14 382，RSD為0.38%。取 供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，峰面積（μv·ms）分別為14 753、14 684、14 293、14 574、14 154、14 982，RSD為2.1%。試驗(yàn)結(jié)果表明，儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

考察溶液24 h穩(wěn)定性，峰面積（μv·ms）分別為18 468（0 h）、17 463（2 h）、18 132（4 h）、18 088（8 h）、16 268（12 h）、12 543（24 h），結(jié)果樣品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定，8 h內(nèi)RSD為2.9%。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取溴芬酸鈉滴眼液，按照供試品溶液制備方法制備供試品溶液，共6份，進(jìn)樣測(cè)定，峰面積（μv·ms）分別為13 489、13 198、13 734、13 216、13 324、13 148，以峰面積計(jì)算，RSD為1.7%，試驗(yàn)結(jié)果表明，樣品的重復(fù)性試驗(yàn)良好。

2.8 檢出限和定量限

取溴芬酸鈉對(duì)照品溶液，逐步稀釋，按照信噪比S/N=3確定檢出限溶液的濃度，檢出限溶液濃度為0.02 μg/ml，按照信噪比S/N=10確定定量限溶液的濃度，定量限溶液濃度為0.05 μg/ml。將供試品溶液稀釋5倍，精密吸取20 μl，進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖中聚合物峰的信噪比S/N=10，計(jì)算聚合物含量，定量限濃度相當(dāng)于溴芬酸鈉標(biāo)示量的0.03%。

2.9 測(cè)定結(jié)果

按照建立的測(cè)定方法，測(cè)定三個(gè)廠家的11批樣品，聚合物含量按照溴芬酸鈉標(biāo)示量計(jì)算，結(jié)果范圍為0.1%～1.5%，分別按照各自現(xiàn)行法定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果范圍為0.1%～3.2%，聚合物測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 聚合物測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

本研究考察了不同pH值的0.1%三乙胺-乙腈體系、不同pH值的0.0025 mol/L庚烷磺酸鈉-乙腈體系、不同pH值的0.05 mol/L磷酸氫二鉀溶液-乙腈體系；考察了C8色譜柱、C18色譜柱、凝膠色譜柱G-10、TSKgel SuperMultiporePW-M尺寸排阻色譜柱；考察了蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、紫外檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器。當(dāng)采用C18色譜柱，紫外檢測(cè)器，以0.05 mol/L磷酸氫二鉀溶液-乙腈體系為流動(dòng)相時(shí)，聚合物與其他組分分離效果最好，可以進(jìn)行準(zhǔn)確定量。由于聚維酮K30為大分子物質(zhì)，在C18色譜柱上出峰峰型較寬，且在色譜柱有殘留，需提前進(jìn)行色譜柱的飽和[7-17]。

聚合物是溴芬酸鈉與聚維酮K30在藥品的儲(chǔ)存期間聚合產(chǎn)生的，無(wú)法分離純化得到聚合物雜質(zhì)純品，市面上無(wú)聚合物雜質(zhì)對(duì)照品出售，無(wú)法用對(duì)照品進(jìn)行定量。現(xiàn)行國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)中聚合物的計(jì)算方式，采用樣品峰面積直接扣除空白溶液中聚維酮K30峰面積，取峰面積差值，按外標(biāo)法進(jìn)行計(jì)算。聚維酮K30對(duì)照品的稱樣量或者峰面積值大小直接影響計(jì)算結(jié)果，甚至?xí)霈F(xiàn)負(fù)值，測(cè)定結(jié)果與聚維酮K30投料的多少和聚維酮K30對(duì)照品取樣量的多少直接相關(guān)，存在監(jiān)控風(fēng)險(xiǎn)。經(jīng)比較分析溴芬酸鈉對(duì)照品和聚維酮K30原料的紫外吸收光譜圖，溴芬酸鈉在400 nm波長(zhǎng)處有較大的吸收，而聚維酮K30在400 nm波長(zhǎng)處無(wú)紫外線吸收，不影響聚合物的定量，故檢測(cè)波長(zhǎng)選擇為400 nm。

現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法的供試品色譜圖中聚合物峰型極不規(guī)則，基線不平，且計(jì)算方式不合理，含量測(cè)定的結(jié)果不準(zhǔn)確，測(cè)定結(jié)果值差異較大。本研究選擇在無(wú)干擾的400 nm波長(zhǎng)處采集信號(hào)，以外標(biāo)法直接計(jì)算含量，與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法比較，結(jié)果更準(zhǔn)確可靠。但由于各個(gè)批次供試品聚合物的形成具有不確定性，結(jié)果差異也較大。

本研究建立了溴芬酸鈉滴眼液中聚合物的含量測(cè)定方法，方法簡(jiǎn)便、快速，可用于控制溴芬酸鈉滴眼液聚合物的含量，也為其質(zhì)量控制方法的研究提供了參考。