一測多評法測定石菖蒲中β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚的含量

趙俊赫 霍志鵬 連玉姣 邱守昊 王 玉 張依倩▲

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.天士力醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司研究院 現(xiàn)代中藥創(chuàng)制全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300410

石菖蒲為天南星科石菖蒲（Acorus tatarinowii Schott）的干燥根莖，性辛、苦、溫，歸心、胃經(jīng)[1]，具有開竅豁痰、醒神益智、化濕開胃的功效，為開竅醒腦要藥[2-4]。石菖蒲中揮發(fā)性成分主要為β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚[5-7]，具有抗腫瘤、抗炎、抗癲癇、抗血栓、抗焦慮、抗癲癇、保護(hù)心腦血管等作用[8-13]。但石菖蒲藥材的主要活性成分β-細(xì)辛醚對照品價(jià)格昂貴，且對照品溶液不易配制。一測多評法（quantitative analysis of multi-components by singlemarke，QAMS）可以通過選擇一個(gè)成分為內(nèi)標(biāo)物，實(shí)現(xiàn)多個(gè)成分的定量分析，可減少成分定量分析的時(shí)間與成本，彌補(bǔ)對照品不足的問題，具有方便、易于操作等優(yōu)點(diǎn)[14]。因此，本試驗(yàn)嘗試以α-細(xì)辛醚為內(nèi)標(biāo)，采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）計(jì)算α-細(xì)辛醚與β-細(xì)辛醚的相對矯正因子，建立QAMS測定石菖蒲中β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚的含量。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Waters e2695-2998型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；昆山舒美KQ-500DE超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；XS-205DU電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

石菖蒲藥材（批號(hào)：20190101，安徽省永香中藥飲片有限公司）；β-細(xì)辛醚（天士力控股集團(tuán)有限公司研究院），α-細(xì)辛醚（批號(hào)：L1913066，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；色譜甲醇、色譜乙腈（德國默克公司）；無水乙醇（天津康科德科技有限公司）；超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色 譜 柱 為Agilent Eclipse XDB C18（5 μm，4.6 mm×150 mm）。流動(dòng)相：0.05%磷酸水（A）-乙 腈（B），梯 度 洗 脫：0～28 min，35%～42%B；28～31 min，42%～90% B；31～34 min，90%～35% B。流速：1 ml/min；柱溫30℃；進(jìn)樣體積10 μl；檢測波長254 nm。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖（254 nm）

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 稱取石菖蒲藥材粉末（過4號(hào)篩）0.2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 ml，稱重，超聲15 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，過0.2 μm微孔濾膜，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備 取對照品β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚適量，精密稱定，加甲醇制成濃度分別為92.20、21.32 μg/ml混合對照品溶液。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 取空白溶劑（甲醇）、2.2項(xiàng)下制備的各溶液按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣、測定，觀察各個(gè)待測物與對照品出峰時(shí)間是否一致。結(jié)果表明β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚兩成分與相鄰色譜峰均能達(dá)到分離，分離度均≥1.5，拖尾因子≤1.5，分離良好，且與對照品出峰時(shí)間一致。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取2.2項(xiàng)下配置的混合對照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測定待測組分的峰面積，計(jì)算其RSD。β-細(xì)辛醚峰面積的RSD為1.04%，α-細(xì)辛醚峰面積的RSD分別為1.09%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.3 線性關(guān)系考察 精密稱取β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚對照品適量，加甲醇配成濃度依次為461.00、106.62 μg/ml的混合對照品溶液，作為線標(biāo)溶液a，依次用甲醇稀釋2、4、8、16、32倍，制成β-細(xì)辛醚230.50、115.25、57.63、28.81、14.41 μg/ml，α-細(xì)辛醚53.31、26.66、13.33、6.66、3.33 μg/ml的混合對照品溶液，作為線標(biāo)溶液b～f。依次精密吸取線標(biāo)溶液a～f各適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄峰面積，以質(zhì)量濃度（X，μg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，并計(jì)算相關(guān)系數(shù)。β-細(xì)辛醚線性回歸方程為Y=30270.0X-4283.3，線 性范 圍14.41～461.00 μg/ml，α-細(xì) 辛 醚 的線性回歸方程為Y=44 614.8X-6967.2，線性范圍3.33～106.62 μg/ml，R2均為0.9999，表明兩成分線性關(guān)系良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取混合對照品溶液與同一份供試品溶液，分別于溶液制配制后0、2、4、8、12、16、24 h，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測定待測組分的峰面積，計(jì)算對照品溶液與供試品溶液中β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚峰面積的RSD。對照品溶液中β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚峰面積的RSD均為1.05%，供試品溶液中β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚峰面積的RSD分別為0.61%和0.56%。結(jié)果表明對照品溶液與供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次的石菖蒲藥材粉末適量，按2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄待測組分的峰面積，分別計(jì)算各成分含量。β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚含量平均值分別為20.1655 mg/g和5.5680 mg/g，RSD分別為0.94%和0.97%（n=6），結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率 取已知含量的石菖蒲藥材粉末適量，研細(xì)，取6份，每份約0.1 g，精密稱定，分別加入精密稱定的β-細(xì)辛醚對照品2.0440 mg，α-細(xì)辛醚對照品0.5468 mg，按2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法平行制備加標(biāo)溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚的加樣回收率及RSD值。β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚的平均加樣回收率分別為98.69%和100.24%，RSD分別為2.04%和2.06%。

2.4 待測組分色譜峰的定位

采用相對保留時(shí)間（t）對色譜峰進(jìn)行定位，即t待測組分/內(nèi)標(biāo)=t待測組分/t內(nèi)標(biāo)，計(jì)算不同儀器和不同色譜柱條件下β-細(xì)辛醚與α-細(xì)辛醚的相對保留時(shí)間平均值為0.8723，RSD為0.31%，結(jié)果見表1，結(jié)果表明不同品牌儀器及色譜柱檢測所得目標(biāo)峰的相對保留時(shí)間沒有明顯的差異。

表1 兩種成分的相對保留時(shí)間

2.5 相對校正因子的測定和計(jì)算

取2.3.3項(xiàng)下混合對照品溶液a～f各適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣，記錄兩種成分的峰面積，以α-細(xì)辛醚為內(nèi)標(biāo)，按照相對校正因子計(jì)算公式fis=fi/fs=（mi×As）/（ms×Ai）計(jì)算α-細(xì)辛醚對β-細(xì)辛醚的校正因子，其中i為某化合物，s為內(nèi)標(biāo)物，m為質(zhì)量，A為峰面積。計(jì)算所得相對校正因子平均值為1.4572，RSD為1.26%，結(jié)果見表2。

表2 相對校正因子

2.6 相對校正因子重現(xiàn)性考察

2.6.1 不同儀器和色譜柱對相對校正因子值的影響 考察了2種品牌高效液相色譜儀（Waters e2695、Agilent 1200）和3種不同品牌色譜柱[Agilent Eclipse XDB C18柱（5 μm，4.6 mm×150 mm）、Alltima C18柱（5 μm，4.6 mm×150 mm）、Kromasil C18柱（5 μm，4.6 mm×150 mm）]對相對校正因子的影響，結(jié)果見表3，RSD為0.64%，表明在不同液相色譜系統(tǒng)下所得的相對校正因子基本一致。

表3 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響

2.6.2 不同柱溫、流速、進(jìn)樣體積對相對校正因子值的影響 分別考察了不同柱溫（25℃、30℃、35℃）、不同流速（0.9、1.0、1.1 ml/min）、不同進(jìn)樣體積（8、10、12 μl）對相對校正因子的影響，結(jié)果表明在不同柱溫、流速、進(jìn)樣體積下所得的相對校正因子基本一致。

2.7 QAMS與外標(biāo)法（external standard method，ESM）結(jié)果比較

分別取14批石菖蒲藥材粉末（過4號(hào)篩），每批3份，按2.2項(xiàng)下平行制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣測定，記錄兩種成分的峰面積，分別采用ESM和QAMS計(jì)算所測各目標(biāo)成分含量，結(jié)果見表4，可知兩種方法計(jì)算各成分的含量無明顯差異。

表4 QAMS與ESM結(jié)果比較（n=3）

3 討論

3.1 檢測波長的考察

本試驗(yàn)對β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚進(jìn)行全波長掃描，最大吸收波長分別為252、258 nm，參考文獻(xiàn)[15-16]并兼顧兩種成分的紫外吸收情況，選擇254 nm作為檢測波長。結(jié)果表明在254 nm波長下，基線較為平穩(wěn)，β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚成分響應(yīng)值較高，干擾峰較少。

3.2 樣品制備方法的選擇

分別考察了不同流動(dòng)相（水-乙腈、0.05%磷酸水-乙腈、0.1%甲酸水-乙腈）、提取溶劑（無水乙醇、甲醇）與提取方式（超聲15、30、60 min）對兩種待測成分的影響，最終選定以0.05%磷酸水-乙腈溶液為流動(dòng)相、甲醇超聲提取15min為最優(yōu)方法。

3.3 內(nèi)參物的選擇

石菖蒲揮發(fā)性成分中β-細(xì)辛醚含量高于α-細(xì)辛醚，但由于β-細(xì)辛醚對照品極易揮發(fā)，且價(jià)格昂貴，考慮到α-細(xì)辛醚對照品價(jià)格較低，化學(xué)性質(zhì)較β-細(xì)辛醚更穩(wěn)定，故本試驗(yàn)選定α-細(xì)辛醚作為內(nèi)參物來計(jì)算β-細(xì)辛醚的相對校正因子。

4 小結(jié)

課題組前期建立了一個(gè)可以同時(shí)定量β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚的HPLC含測方法。本研究石菖蒲藥材種含量較高且性質(zhì)穩(wěn)定的α-細(xì)辛醚為內(nèi)標(biāo)物，建立了α-細(xì)辛醚與β-細(xì)辛醚的相對校正因子，對石菖蒲藥材中的β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚進(jìn)行含量測定，方法學(xué)結(jié)果均符合《中華人民共和國藥典》要求，在不同品牌儀器、流速、柱溫等條件下進(jìn)樣分析發(fā)現(xiàn)該方法具有較高的重現(xiàn)性。通過對多批次石菖蒲藥材中兩成分含量測定，比較QAMS計(jì)算的含量值與ESM所測的含量值，結(jié)果表明無顯著差異。說明建立的α-細(xì)辛醚與β-細(xì)辛醚之間的校正因子具有較高的可信度。一定程度上解決了石菖蒲揮發(fā)性成分含測時(shí)β-細(xì)辛醚對照品價(jià)格昂貴且不易配制的問題，為石菖蒲的質(zhì)量控制提供了有效的方法。