基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS 技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法的不同干燥處理杜仲葉成分分析

李淑芳，王會(huì)鋒，郝學(xué)飛，胡永建，李圓圓，馬風(fēng)蓮，馮書惠，楊亞琴，于永杰

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所，河南 鄭州 450002；2.寧夏醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，寧夏 銀川 750004）

杜仲葉（Eucommiae Folium）為杜仲科植物杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）的干燥葉，由《中華人民共和國藥典》（2005 年版）首次收載并以綠原酸的含量為其質(zhì)量控制指標(biāo)［1］。與杜仲皮類似，杜仲葉富含環(huán)烯醚萜類、有機(jī)酸類、黃酮類、木質(zhì)素類等活性成分，具有降壓、降脂、降糖、保肝、消炎殺菌、抗氧化、抗疲勞、抗骨質(zhì)疏松等多種藥理作用和保健價(jià)值［2-7］。杜仲葉的再生能力強(qiáng)，易于采集，可作為杜仲皮的替代資源，具有廣闊的應(yīng)用前景。杜仲葉作為傳統(tǒng)“既是食品又是中藥材”的物質(zhì)，已開發(fā)出杜仲茶、復(fù)合飲料、保健食品、飼料添加劑等多種功能性產(chǎn)品［2-4］。新鮮杜仲葉不便長時(shí)間保存，采收后需進(jìn)行干燥處理。目前，杜仲葉常用的干燥處理方式主要有陰干、曬干、低溫烘干、炒制等傳統(tǒng)方法，以及熱風(fēng)干燥、遠(yuǎn)紅外干燥、微波干燥和冷凍干燥等現(xiàn)代干燥方法［8-12］。干燥處理是影響杜仲葉化學(xué)成分含量，決定其藥用品質(zhì)及經(jīng)濟(jì)價(jià)值的關(guān)鍵因素之一。開展不同干燥處理杜仲葉中的化學(xué)成分差異研究對于杜仲葉的深度開發(fā)和質(zhì)量控制具有重要意義。

現(xiàn)有針對不同干燥方法影響杜仲葉質(zhì)量的研究工作［8-12］通常以綠原酸、京尼平苷酸、京尼平苷、總黃酮等功能成分的含量作為評價(jià)依據(jù)。如陳書明等［8］采用曬干、陰干、熱風(fēng)干燥、超聲與熱風(fēng)結(jié)合干燥、遠(yuǎn)紅外及微波干燥6 種方法對杜仲葉進(jìn)行干燥，以綠原酸、總黃酮、總多酚、總多糖的含量為指標(biāo)比較6種方法的效果。嚴(yán)瑞娟等［12］采用5種初加工方式（蒸制、燙制、炒制、烘制、微波制）對杜仲葉處理后再進(jìn)行陰干，通過指紋圖譜、綠原酸及京尼平苷酸的含量比較分析不同初加工方式對杜仲葉品質(zhì)的影響。杜仲葉成分復(fù)雜，僅采用少量成分或利用指紋圖譜進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)存在局限性，亟待建立基于杜仲葉化學(xué)成分物質(zhì)基礎(chǔ)的分析手段及評價(jià)模式。

代謝組學(xué)表征生物體整體功能狀態(tài)的特點(diǎn)與中藥多組分協(xié)同作用的整體性特點(diǎn)相吻合，已廣泛應(yīng)用于藥用植物質(zhì)量控制及其物質(zhì)基礎(chǔ)分析等研究領(lǐng)域。超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜分析技術(shù)（UHPLC-HRMS）為海量代謝物信息提供了高精度分析工具平臺(tái)，在非靶向代謝組學(xué)研究中扮演著重要角色。目前，已有文獻(xiàn)［13-16］基于UHPLC-HRMS的非靶向代謝組學(xué)技術(shù)對杜仲產(chǎn)品中的化學(xué)成分開展研究。如Liu 等［13］采用基于超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF MS）平臺(tái)的非靶向代謝組學(xué)與基于超高效液相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜（UPLC/QDa）平臺(tái)的選擇性檢測相結(jié)合的策略對杜仲（皮、葉、花、籽）相關(guān)原料及產(chǎn)品進(jìn)行差異分析與鑒別，多元統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果揭示25 種差異性成分可用于不同部位的判別，并選出8 種成分用于UPLC/QDa 系統(tǒng)定量分析。Chen 等［14］采用基于UHPLC-Q-TOF MS的非靶向代謝組學(xué)技術(shù)與多元統(tǒng)計(jì)分析相結(jié)合揭示杜仲不同組織（葉、皮、籽）的代謝物差異與相關(guān)性。結(jié)果表明，杜仲葉代謝物組成與樹皮相似，但不同組織間存在顯著差異。嚴(yán)穎等［15］利用液相色譜-串聯(lián)三重四極桿飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜法（LC-Triple TOF MS/MS）結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析開展了杜仲、杜仲葉與杜仲雄花的成分差異及變化研究。申夢園等［16］通過超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（UPLC-Q-Orbitrap HRMS）與化學(xué)模式識別技術(shù)結(jié)合對喬林與葉林2種栽培方式的杜仲葉進(jìn)行次生代謝產(chǎn)物差異分析。基于UHPLC-HRMS 的非靶向代謝組學(xué)技術(shù)顯示出強(qiáng)大的成分分析潛力，然而在進(jìn)行復(fù)雜植物樣本分析時(shí)，仍面臨著如何實(shí)現(xiàn)高效率、高通量、智能化地提取與識別化合物信息等難題［17］。AntDAS［18-19］為近期發(fā)表的非靶向代謝組學(xué)數(shù)據(jù)自動(dòng)化分析處理軟件，具有準(zhǔn)確提取與解析提取離子色譜圖（EIC）、化合物鑒定、多樣本批處理及化學(xué)計(jì)量學(xué)分析等功能，為復(fù)雜植物樣本UHPLC-HRMS 數(shù)據(jù)提供了新的分析工具。本研究以杜仲初生嫩葉為研究對象，通過基于液質(zhì)聯(lián)用的非靶向代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)自動(dòng)化分析軟件AntDAS-LCHRMS 對不同干燥處理獲得的杜仲葉中的差異性化合物進(jìn)行分析。使用層次聚類分析（HCA）、主成分分析（PCA）、熱圖分析等方法對不同干燥處理的杜仲葉樣本進(jìn)行判別分析，評價(jià)了不同干燥處理杜仲葉的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)差異，以期為杜仲葉產(chǎn)品綜合開發(fā)和資源利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Ultimate 3000 超高效液相色譜-Q Exactive-Orbitrap 靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國賽默飛世爾科技公司）；Eppendorf 5810 R 型臺(tái)式高速大容量冷凍離心機(jī)（德國艾本德公司）；KQ-500DE 型臺(tái)式數(shù)控超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）；久品JP-300C型高速多功能粉碎機(jī)（浙江永康市久品工貿(mào)有限公司）；Sartorius BS224S 電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；Axygen 2 mL 離心管（愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司）；Aibensen MixOne 數(shù)顯漩渦振蕩器（合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司）；Milli-Q Synthesis超純水系統(tǒng)（德國默克公司）。

甲醇（質(zhì)譜純）、乙腈（色譜純）及甲酸（98%~100%，質(zhì)譜純）購自德國Merck 公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水（經(jīng)Milli-Q Synthesis 超純水系統(tǒng)獲得）。賴氨酸、谷氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、色氨酸等標(biāo)準(zhǔn)品（純度均為99%）均購于Sigma-Aldrich公司。腺苷（≥99.9%）、鳥苷（≥93.2%）、蔗糖（≥99.8%）、腺苷酸（≥98%）購自CATO Research Chemicals Inc.。維生素B5（≥99.5%）、兒茶素（≥98.56%）購自Stanford Analytical Chemicals Inc.。阿魏酸（≥99%）及維生素B2（≥98.2%）購自中國食品藥品檢定研究院。表兒茶素（≥98.01%）、原花青素B1（≥95.86%）及原花青素B2（≥97.06%）等標(biāo)準(zhǔn)品購自四川省維克奇生物科技有限公司。秦皮乙素（≥98%）、對香豆酸（≥99.9%）、丁香脂素二葡萄糖苷（≥98%）、蘋果酸（≥98.2%）、檸檬酸（98.9%）、原兒茶酸（≥98%）、綠原酸（≥99.39%）、異綠原酸A（≥98%）、咖啡酸（≥99.7%）、桃葉珊瑚苷（≥98%）、京尼平苷酸（≥98%）、京尼平苷（≥98%）、車葉草苷酸（≥99.6%）、車葉草苷（≥98%）、蘆丁（≥98%）、山奈酚（≥98%）、金絲桃苷（≥99.8%）、異槲皮苷（≥98%）、煙花苷（≥98%）、紫云英苷（≥98%）、槲皮苷（≥98.63%）、圣草酚（≥98%）、槲皮素（≥98%）、柚皮素（≥98%）等標(biāo)準(zhǔn)品購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 樣本采集與制備

杜仲葉新鮮樣本為初生嫩葉，取自河南省鄭州市新密地區(qū)（北緯34°35'35"，東經(jīng)113°10'1"）20 年樹齡的杜仲樹植株，取樣日期為2022 年4 月1 日。將杜仲葉新鮮樣本平均分成4 份，分別以凍干（G1：將樣本置于SCIENTZ-18N/C型冷凍干燥機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司），-50 ℃凍干）、熱泵烘干（G2：將樣本置于天赫偉業(yè)WKD430N 型熱泵干燥箱（河南天赫偉業(yè)能源科技有限公司），50 ℃烘干）、電熱烘干（G3：將樣本置于DHG-9030A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），50 ℃烘干）以及曬干（G4：將樣本置于托盤放在陽光直射處晾干）4種干燥處理方式制成干燥葉，每種干燥處理設(shè)8 個(gè)重復(fù)，共32 個(gè)樣本。將不同干燥處理獲得的杜仲葉樣本研磨成粉，并于-80 ℃避光保存。從32份杜仲葉粉末樣本各取出0.5 g，混合均勻制備成質(zhì)量控制樣本（QC）。圖1為不同干燥處理獲得杜仲葉樣本的分析流程。

1.3 樣本分析

通過比較不同前處理及儀器條件下得到的峰數(shù)量、峰面積及一級、二級質(zhì)譜數(shù)信息，優(yōu)化得到樣本前處理、液相色譜條件及質(zhì)譜條件。

1.3.1 樣本前處理稱取20.0 mg杜仲葉樣本于2 mL離心管，加入1.5 mL 80%甲醇-水提取溶劑，充分渦旋2 min 后于室溫下超聲提取30 min，以12 000 r/min 離心10 min。上清液轉(zhuǎn)移至色譜瓶中用于高分辨質(zhì)譜分析。

1.3.2 UHPLC-HRMS 儀器分析條件液相色譜條件：進(jìn)樣量：2 μL；Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm，美國安捷倫科技有限公司）；柱溫：40 ℃；流速：0.2 mL/min；流動(dòng)相：A相為水（含0.1%甲酸），B相為乙腈（含0.1%甲酸）；梯度洗脫程序：0~1 min，5%~8% B；1~7 min，8%~12% B；7~13 min，12%~20% B；13~20 min，20%~35% B；20~24 min，35%~55% B；24~25 min，55%~97% B；25~30 min，97%~100% B；30~35 min，100% B；35~35.5 min，100%~5% B。后運(yùn)行4.5 min。

質(zhì)譜條件：離子傳輸毛細(xì)管溫度為320 ℃。電噴霧離子源（ESI源），分別在正離子（ESI+）、負(fù)離子（ESI-）掃描模式運(yùn)行。噴霧電壓為3 500 V（ESI+）、3 000 V（ESI-）。鞘氣和輔助氣均為氮?dú)猓魉俜謩e為30 arb、10 arb（ESI+）；35 arb、16 arb（ESI-）。采用FULL MS/DD-MS2（TOP4）模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。一級質(zhì)譜掃描范圍為120~1 000 Da。一級、二級質(zhì)譜分辨率分別為35 000 FWHM、17 500 FWHM。兩級質(zhì)譜的自動(dòng)增益控制（AGC）均為5e6。一級、二級質(zhì)譜的最大注入時(shí)間分別為100 ms、25 ms。二級碎裂方式選擇高能碰撞誘導(dǎo)裂解（HCD）模式，碰撞能量為20 eV，隔離窗口為0.4 Da，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為4.5 s。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Xcalibar（美國賽默飛世爾科技公司）完成UHPLC-HRMS 原始數(shù)據(jù)的采集。將數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入AntDAS-LCHRMS 分析軟件，自動(dòng)實(shí)現(xiàn)EIC 峰構(gòu)建、峰提取、峰對齊、峰注釋、化合物注冊等，最終獲得EIC 峰面積×化合物樣本的化合物信息列表。借助于方差分析（ANOVA）、層次聚類分析（HCA）和主成分分析（PCA）等化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法對上述化合物信息進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得到具有差異性的化合物質(zhì)譜譜圖。將其與第三方公開的數(shù)據(jù)庫（http：//prime.psc.riken.jp/compms/msdial/main.html）進(jìn)行比對實(shí)現(xiàn)化合物的鑒別。其中，部分化合物使用對照品進(jìn)一步得到驗(yàn)證。此外，對差異性化合物進(jìn)行熱圖分析以評價(jià)不同干燥處理杜仲葉中的化學(xué)成分變化。

2 結(jié)果與討論

圖2 為4 種不同干燥處理杜仲葉樣本的總離子流色譜（TIC）圖。由圖可見，在正、負(fù)離子模式下均能夠采集到杜仲葉樣本中豐富的化學(xué)物質(zhì)信息，在整個(gè)流出范圍內(nèi)TIC 峰的分離效果良好。然而，僅從TIC 色譜圖上看，不同干燥處理下的杜仲葉無顯著差異。因此，借助于代謝組學(xué)數(shù)據(jù)解析工具對獲得的高通量數(shù)據(jù)進(jìn)一步挖掘非常必要。將儀器采集的UHPLC-HRMS 原始數(shù)據(jù)直接導(dǎo)入AntDASLCHRMS 進(jìn)行色譜峰的自動(dòng)化提取。以正離子模式下的QC 樣本為例，圖3 給出了AntDAS-LCHRMS 軟件平臺(tái)的數(shù)據(jù)分析過程。

圖2 不同干燥處理杜仲葉樣本在正離子模式（A）與負(fù)離子模式（B）的總離子流色譜圖Fig.2 TIC chromatograms of E. ulmoides Oliv. leaves in various drying treatments under the positive mode（A） and negative mode（B）

圖3 利用AntDAS-LCHRMS進(jìn)行UHPLC-HRMS數(shù)據(jù)分析示例Fig.3 Illustration of UHPLC-HRMS data analysis by AntDAS-LCHRMS

2.1 AntDAS-LCHRMS平臺(tái)中化合物色譜峰的自動(dòng)化提取

AntDAS-LCHRMS 可以完成所有EIC 峰提取及其m/z值的精確注釋，進(jìn)而識別［M+H］+、［M-H］-、［M+Na］+、［M-H2O+H］+、［M+FA-H］-等。利用AntDAS-LCHRMS 提取其中一個(gè)EIC（m/z291.088 8 Da）下所有色譜峰的示例見圖3A。經(jīng)解析提取1 個(gè)信號強(qiáng)度高的色譜峰（8 號）、2 個(gè)信號較高的色譜峰（2號、9號）和8個(gè)強(qiáng)度較低的色譜峰，共11個(gè)色譜峰。圖3A（a）為4個(gè)強(qiáng)度較低的色譜峰（3~6號）的局部放大圖，展示了AntDAS-LCHRMS 能夠有效識別化合物信息，實(shí)現(xiàn)EIC 中色譜峰的高質(zhì)量提取。提取EIC 對應(yīng)的化合物注冊表信息見圖3B。利用AntDAS-HRMS 分別對不同干燥處理的杜仲葉樣本在正、負(fù)離子模式下的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，可獲得兩個(gè)大小分別為16 980 × 37（ESI+）和8 823× 37（ESI-）的化合物信息列表。信息表示EIC 峰數(shù)量分別為16 980 和8 823，樣本數(shù)量為37（即不同干燥處理的杜仲葉樣本32個(gè)和QC樣本5個(gè)）。

AntDAS-LCHRMS 的數(shù)據(jù)分析性能通過QC 樣本進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)研究。通過計(jì)算各EIC 峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），在正、負(fù)離子模式下分別對5 個(gè)QC 樣本進(jìn)行評估，結(jié)果如圖4 所示。由圖可見，正離子模式下，RSD 小于等于20%和30%的色譜峰數(shù)量分別為7 852 個(gè)和8 889 個(gè)，分別占總峰數(shù)量的46.2%和52.3%。負(fù)離子模式下，RSD小于等于20%和30%的色譜峰數(shù)量分別為4 632個(gè)和5 025個(gè)，分別占總峰數(shù)量的52.5%和57.0%。即使在RSD 低于10%的水平下，正、負(fù)離子模式下的峰數(shù)量分別達(dá)到總峰數(shù)量的22.9%和31.9%，表明該方法穩(wěn)定可靠。負(fù)離子模式盡管在總峰數(shù)量上略低，但從RSD來看數(shù)據(jù)質(zhì)量略優(yōu)于正離子模式。

圖4 基于質(zhì)控樣本的色譜峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Fig.4 The relative standard deviations of chromatographic peak area based on QC samples

2.2 化合物鑒定

當(dāng)同時(shí)分析多個(gè)樣本時(shí)，AntDAS-LCHRMS 能夠識別屬于同一個(gè)化合物的源內(nèi)碎片離子，并實(shí)現(xiàn)多樣本信息的整合，給出化合物的一級（MS1）、二級（MS/MS）質(zhì)譜譜圖，與標(biāo)準(zhǔn)譜圖比對可實(shí)現(xiàn)化合物鑒定。圖3C 以兒茶素為例展示了基于AntDAS-LCHRMS 的化合物鑒別過程。通過AntDAS-LCHRMS解析對應(yīng)圖3A 中正離子模式下m/z291.088 7 Da 的注冊化合物（#8），獲得的EIC 峰有m/z123.045 5、139.040 4、147.045 5、165.056 3、207.067 3、273.078 0、291.088 7 等。AntDAS-LCHRMS 能夠通過EIC 峰形（圖3D）相似度計(jì)算來判別這些碎片離子是否來自同一成分，并完成化合物的質(zhì)譜譜圖構(gòu)建（圖3C）。由圖可知，母離子為m/z291.088 7（［M+H］+），該離子斷裂后主要形成m/z139.040 4、123.045 5、147.045 5、207.067 3等碎片離子。將MS1、MS/MS譜圖與第三方標(biāo)準(zhǔn)譜庫中的譜圖進(jìn)行比對，化合物鑒定結(jié)果為兒茶素，其MS1、MS/MS的匹配度分別為0.962 3、0.998 1。

2.3 不同干燥處理杜仲葉樣本的HCA和PCA分析

在AntDAS-LCHRMS平臺(tái)中分別完成正、負(fù)離子模式下采集的UHPLC-HRMS原始數(shù)據(jù)分析后，對所獲得的色譜峰注冊表進(jìn)行ANOVA 分析，得到不同干燥處理的杜仲葉樣本中具有顯著性差異的色譜峰，正離子模式下有6 253 個(gè)，負(fù)離子模式下有3 878 個(gè)。基于篩選出的所有差異性色譜峰，分別在兩種模式下對不同干燥處理的杜仲葉樣本進(jìn)行HCA 和PCA 分析，如圖5 所示。HCA 分析結(jié)果（圖5A1、B1）顯示，4 種干燥處理的杜仲葉樣本聚類效果明顯，各成一類。其中，凍干、熱泵烘干、曬干3 種方式更為相似。PCA 分析結(jié)果（圖5A2、B2）中前兩個(gè)主成分代表了樣本中約70%的信息。樣本分布表明不同干燥處理的杜仲葉樣本分別聚成一類，各類之間的分布距離存在明顯不同，其中凍干、熱泵烘干、曬干3種干燥處理的杜仲葉樣本距離較為接近，電熱烘干與其它處理距離較遠(yuǎn)。圖5表明，不同干燥處理的杜仲葉樣本在正、負(fù)離子模式下的HCA和PCA 分析結(jié)果一致，凍干、熱泵烘干、曬干整體上更為接近，與電熱烘干存在較大差異。

圖5 不同干燥處理杜仲葉樣本的HCA（A1、B1）和PCA（A2、B2）分析結(jié)果Fig.5 HCA（A1，B1） and PCA（A2，B2） analysis results of E. ulmoides Oliv. leaves in various drying treatments

2.4 不同干燥處理的杜仲葉樣本中差異性化合物及其含量變化

基于“2.2”所述化合物鑒定流程，本研究融合正、負(fù)離子模式的識別結(jié)果共鑒定出71 種差異性化合物（見表1），進(jìn)一步通過標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證可確定40 種化合物。其中，正離子模式下識別出59 種化合物，經(jīng)驗(yàn)證的化合物為34 種，負(fù)離子模式下識別出56 種化合物，經(jīng)驗(yàn)證的化合物為29 種。正、負(fù)離子模式均識別出的化合物有44種，其中有25種經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證。識別的化合物類別包括有機(jī)酸、環(huán)烯醚萜、黃酮、氨基酸、核苷、維生素、糖、木質(zhì)素及香豆素類等，各類別化合物數(shù)量如圖6 所示。識別的黃酮類物質(zhì)數(shù)量在正離子模式下多于負(fù)離子模式，識別的有機(jī)酸類物質(zhì)數(shù)量在負(fù)離子模式下多于正離子模式。正、負(fù)離子模式下的化合物鑒定可以同時(shí)利用兩種模式下各自的優(yōu)勢，將碎片離子融合交叉驗(yàn)證避免錯(cuò)誤匹配，有效提高了化合物識別能力，增加了匹配結(jié)果的可信度。

表1 AntDAS-LCHRMS鑒定的不同干燥處理杜仲葉中的差異性化合物Table 1 The significant differential compounds in E. ulmoides Oliv. leaves from various drying treatments identified by AntDAS-LCHRMS

圖6 利用AntDAS-LCHRMS鑒定差異性化合物的數(shù)量Fig.6 The numbers of identified significant differential compounds by AntDAS-LCHRMS

根據(jù)識別的差異化合物的相對豐度，分別在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行熱圖分析（見圖7）。結(jié)果表明，不同干燥處理杜仲葉樣本中的化合物含量差異明顯，整體上兩種模式下的化合物均聚為兩大組別。正離子模式下，圖7A 中前33 種物質(zhì)聚為一組，整體趨勢為電熱烘干含量較高，凍干、熱泵烘干次之，曬干處理下含量最低；其余26種物質(zhì)聚為一組，整體趨勢為凍干含量較高，熱泵烘干、曬干次之，電熱烘干處理下含量最低。負(fù)離子模式下，圖7B 中前25 種物質(zhì)聚為一組，整體趨勢為電熱烘干含量較高，凍干、熱泵烘干及曬干含量較低；其余31種物質(zhì)聚為一組，凍干、熱泵烘干及曬干含量較高，電熱烘干含量較低。上述趨勢與HCA 和PCA 分析結(jié)果一致。其中，維生素B5、谷氨酸、阿魏酸、綠原酸、異綠原酸、咖啡酸以及車葉草苷、京尼平苷酸、原花青素B2、蘆丁、金絲桃苷、柚皮素等化合物在凍干下含量較高。車葉草苷酸、桃葉珊瑚苷、異槲皮苷、煙花苷、紫云英苷、槲皮苷、圣草酚、山奈酚、鳥苷、腺苷等化合物在電熱烘干下含量最高。蔗糖、甲硫腺苷、原花青素B1、櫻桃苷、木犀草素-4'-O-葡萄糖苷等在熱泵烘干下含量最高。賴氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、異綠原酸A、京尼平苷等化合物在曬干下含量最高。化合物含量變化與樣本在干燥過程的暴露時(shí)間、干燥溫度及干燥速度有關(guān)，凍干及曬干對溫度敏感的有機(jī)酸、維生素、氨基酸等成分的影響較小。研究表明，植物中黃酮類化合物在植物體內(nèi)的生物合成和代謝受多個(gè)酶的控制，如苯丙氨酸解氨酶（PAL）及查耳酮合成酶（CHS）的調(diào)控，較高的溫度可使酶失活，從而減少黃酮類成分的降解［20］。推測可能是電熱烘干溫度高且干燥速度較快，易使杜仲葉中的酶失活，所以在黃酮類物質(zhì)的積累上有較好保留。而曬干與其他干燥處理相比，溫度條件對酶活性更為友好，黃酮類成分更易分解，含量相對略低。

正、負(fù)離子模式下均準(zhǔn)確識別并經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證的25 種化合物，按類別包括糖類1 種、氨基酸類2 種、核苷類2 種、維生素類1 種、有機(jī)酸類2 種、環(huán)烯醚萜類5 種、黃酮類12 種。圖8 為經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證的差異性化合物在不同干燥處理杜仲葉中各類別物質(zhì)的含量分布情況。該圖清晰地展示了各類化合物在正、負(fù)離子模式下的響應(yīng)以及不同干燥處理中的變化。從不同離子模式看，正離子模式下響應(yīng)較高的物質(zhì)為糖類、氨基酸類、核苷類、維生素類化合物；負(fù)離子模式下響應(yīng)較高的物質(zhì)包括有機(jī)酸類、環(huán)烯醚萜類、黃酮類化合物。該結(jié)果可為靶向分析時(shí)選擇合適的離子模式提供指導(dǎo)。從不同干燥處理的樣本變化看，各干燥處理樣本在正、負(fù)離子模式下的含量變化趨勢一致。維生素類物質(zhì)在凍干樣本中含量最高，在熱泵烘干樣本中含量最低。氨基酸類物質(zhì)在曬干樣本中含量最高，在電熱烘干樣本中含量最低。環(huán)烯醚萜類、有機(jī)酸類、糖類等物質(zhì)在熱泵烘干時(shí)含量最高，凍干與熱泵烘干含量比較接近，電熱烘干下含量最低。核苷類、黃酮類物質(zhì)在電熱烘干處理下含量最高。黃酮類物質(zhì)在凍干、熱泵烘干及曬干中差異較小，略低于電熱烘干。

圖8 驗(yàn)證的差異性化合物在不同干燥處理杜仲葉中的峰面積分布Fig.8 Peak areas distribution of the confirmed significant differential compounds in E. ulmoides Oliv. leaves from various drying treatments

通過化學(xué)計(jì)量學(xué)數(shù)據(jù)分析軟件AntDAS-LCHRMS 結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對不同干燥處理的杜仲葉進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析，能夠準(zhǔn)確識別杜仲葉樣本中的化合物，有效區(qū)分不同干燥處理下的杜仲葉樣本。綜合利用正、負(fù)離子模式下的數(shù)據(jù)信息，提高了化合物識別能力和準(zhǔn)確度，為杜仲葉的成分分析提供了新的研究思路。

3 結(jié) 論

本文提出基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS 的非靶向代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合數(shù)據(jù)自動(dòng)解析軟件AntDAS-LCHRMS用于4種不同干燥處理杜仲葉樣本中的化合物分析，評價(jià)了不同干燥處理對杜仲葉中化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)及特定活性成分保留的影響。借助該策略最終鑒別出不同干燥處理下具有顯著性差異的71種化合物，其中40種化合物經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證。綜合正、負(fù)離子模式結(jié)果，氨基酸類物質(zhì)在曬干處理下含量高，環(huán)烯醚萜類、有機(jī)酸類、糖類等物質(zhì)在凍干及熱泵烘干處理下含量較高，核苷類、黃酮類物質(zhì)在電熱烘干處理下含量較高，黃酮類物質(zhì)在凍干、熱泵烘干及曬干中差異較小。本研究不僅為不同干燥處理的杜仲葉化學(xué)成分分析及其精深加工提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)表明AntDAS-LCHRMS 可為其他藥用植物干燥加工品質(zhì)的評價(jià)提供新的手段。