UPLC-MS/MS法測(cè)定22種農(nóng)產(chǎn)品中殺螺胺乙醇胺鹽殘留

蔣舒帆，何 燕，李 備，張新忠，韓丙軍*

（1.天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津 300392；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部亞熱帶果品蔬菜質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 571101；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；4.海南省食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心 國家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（熱帶果蔬質(zhì)量與安全），海南 海口 570311）

殺螺胺乙醇胺鹽（Niclosamide-olamine）是一種酰胺類化合物，是世界衛(wèi)生組織唯一推薦使用的殺螺藥物，可有效阻止釘螺對(duì)氧的攝入從而減弱其呼吸作用，降低螺體內(nèi)多種酶的活性，使其各項(xiàng)生理功能紊亂和喪失，最終導(dǎo)致釘螺死亡［1-3］。我國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763-2021）將殺螺胺乙醇胺鹽的殘留標(biāo)示物定義為殺螺胺［4］。殺螺胺（Niclosamide）又名氯硝柳胺，是由5-氯水楊酸和鄰氯對(duì)硝基苯胺通過酰胺鍵結(jié)合而成的化合物，難溶于水。為增加其在水中的溶解度，提高滅螺效果，生產(chǎn)中通常將氯硝柳胺和極性較大的乙醇胺反應(yīng)形成殺螺胺乙醇胺鹽［5］。

殺螺胺乙醇胺鹽在基質(zhì)中可能以殺螺胺和乙醇胺離子共軛的形式存在（圖1A）。近年來，殺螺胺乙醇胺鹽廣泛作為除光劑、殺螺劑和農(nóng)藥用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，還可與飼料混合使用，控制白蟻的侵?jǐn)_［6］、治療魚類寄生蟲病［7-8］，控制蛞蝓和蝸牛等軟體動(dòng)物種群［9］，其在各類農(nóng)產(chǎn)品中殘留容易影響人體食用健康，因此開展不同農(nóng)產(chǎn)品中殺螺胺乙醇胺鹽的殘留分析具有重要意義。目前，殺螺胺乙醇胺鹽的檢測(cè)方法主要有滴定法［10］、紫外-可見分光光度法［11-12］、液相色譜法（HPLC）［13-15］、超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（UPLC-MS/MS）等［16-17］。其中，UPLC-MS/MS 的檢測(cè)靈敏度遠(yuǎn)高于其它3 種方法，在土壤［18］、水樣［19］等復(fù)雜環(huán)境樣品中殺螺胺乙醇胺鹽的檢測(cè)中得到良好應(yīng)用。而在農(nóng)產(chǎn)品中，由于不同基質(zhì)之間差異較大，缺乏較完善的提取檢測(cè)方法，例如茶葉基質(zhì)成分復(fù)雜，含有豐富的咖啡堿、色素和多酚，前處理相對(duì)復(fù)雜［20］，且高含水量、高含油或粉末樣品基質(zhì)各不相同，目前關(guān)于不同農(nóng)產(chǎn)品中殺螺胺乙醇胺鹽殘留的系統(tǒng)分析方法尚未見報(bào)道。

圖1 殺螺胺乙醇胺鹽的結(jié)構(gòu)式（A）及可能的裂解途徑（B）Fig.1 Structural formula（A） and possible cleavage pathway（B） of niclosamide-olamine

本研究通過對(duì)前處理方法和質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，采用改進(jìn)的QuEChERS 方法結(jié)合UPLC-MS/MS 建立了10大類共22種農(nóng)產(chǎn)品中殺螺胺乙醇胺鹽殘留的分析方法。所建方法成功用于實(shí)際樣品分析中，可為農(nóng)產(chǎn)品中殺螺胺乙醇胺鹽的殘留分析提供支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLC-MS/MS），Waters 超高壓液相色譜系統(tǒng)和AB SCIEX API4500+質(zhì)譜系統(tǒng)；離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；超純水儀（美國Millipore公司）；渦旋振蕩器（上海滬析實(shí)業(yè)有限公司）。

殺螺胺標(biāo)準(zhǔn)品（Dr. Ehrenstorfer GmbH，純度97.1%，CAS 為50-65-7）；殺螺胺乙醇胺鹽標(biāo)準(zhǔn)品（TMstandard，純度99.3%，CAS 為1420-04-8）；甲酸（賽默飛世爾科技有限公司，99.9%）；甲醇、乙腈（賽默飛世爾科技有限公司，色譜純）；弗羅里硅土（40~60 μm，上海安譜科學(xué)儀器有限公司）；氯化鈉（廣州化學(xué)試劑廠，分析純，99.5%）；冰醋酸（廣州化學(xué)試劑廠，分析純，99.8%）；GCB 吸附劑（乙二胺-N-丙基硅烷，粒徑40~60 μm，ANPEL 儀器（上海）有限公司）；C18吸附劑（50~120 μm，珠海艾譜瑞生物醫(yī)藥有限公司）。

1.2 試樣制備

市場(chǎng)采購10 大類共22 種樣品基質(zhì)為試材。其中，谷物3 種（包括糙米、小麥和玉米）；油料作物1種（花生）；蔬菜8種（包括甘藍(lán)、芹菜、番茄、茄子、馬鈴薯、胡蘿卜、菜豆、韭菜）；水果4種（包括蘋果、桃、葡萄、柑橘）；堅(jiān)果1 種（核桃）；食用菌1 種（平菇）；植物油1 種（菜籽油）；茶葉1 種（綠茶）；香辛料1種（胡椒）；糖料作物1種（甘蔗）。

按照GB 2763-2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中附錄A食品類別及測(cè)定部位的規(guī)定要求，本研究中花生和核桃去除殼，芹菜去除根，番茄、茄子、蘋果、葡萄、柑橘去除柄，胡蘿卜去除頂部葉及葉柄，桃去除柄和果核，甘蔗去除頂部葉及葉柄后測(cè)定，菜豆帶莢測(cè)定，其余樣品均整株測(cè)定。將22種基質(zhì)的試樣分別進(jìn)行篩選和分裝，其中固體樣品加入干冰（1∶1）進(jìn)行粉碎，液體樣品直接分裝，裝入干凈的袋子做好標(biāo)簽，并在-20℃下冷藏備用。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取0.010 0 g 殺螺胺乙醇胺鹽標(biāo)準(zhǔn)品置于50 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度約200 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用甲醇逐級(jí)稀釋，配制10 mg/L和1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。將標(biāo)準(zhǔn)中間溶液用基質(zhì)空白樣品溶液稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.001、0.002、0.005、0.02、0.05、0.1 mg/L 的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，按參考色譜和質(zhì)譜條件測(cè)定。以殺螺胺乙醇胺鹽的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 樣品前處理

1.4.1 蔬菜、水果、食用菌及植物油稱取10 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL 離心管中，加入20 mL 1%甲酸乙腈溶液，渦旋振蕩5 min 后，加入5~7 g 氯化鈉，渦旋振蕩2 min，以8 000 r/min 離心5 min。取上層清液，待凈化。

1.4.2 谷物、油料、堅(jiān)果、香辛料及糖料稱取5 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL 離心管中，加5 mL水潤濕，靜置30 min。加入10 mL 1%甲酸乙腈溶液，渦旋振蕩5 min 后，加入5~7 g氯化鈉，渦旋振蕩2 min，以8 000 r/min離心5 min。取上層清液，待凈化。玉米和小麥樣品加入10 mL水潤濕。

1.4.3 茶 葉稱取2 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL 離心管中，加入5 mL 水潤濕，靜置30 min。加入10 mL 1%甲酸乙腈溶液，渦旋振蕩5 min 后，加入5 ~7 g 氯化鈉，渦旋振蕩2 min，以8 000 r/min 離心5 min。取上層清液，待凈化。

1.5 凈化與水解

分取上層清液5 mL，加入150 mg 弗羅里硅土，渦旋振蕩2 min 后，以8 000 r/min 離心5 min。取上層清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，供測(cè)定。

1.6 儀器分析條件

1.6.1 色譜條件色譜柱：C18柱（50 mm×2.1 mm，粒徑1.7 μm）；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水，B為乙腈。梯度洗脫程序?yàn)椋?.0～1.5 min，5% B；1.5～3.5 min，5% ~95% B；3.5～5 min，95% ~5% B；流速：0.25 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.6.2 質(zhì)譜條件電噴霧離子源；負(fù)離子電離掃描；噴霧電壓為-4 500 V；離子源溫度為600 ℃；碰撞氣（N2）；氣簾氣壓力為70 kPa，霧化氣壓力為350 kPa，輔助加熱氣壓力為350 kPa；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）。殺螺胺乙醇胺鹽的保留時(shí)間為2.24 min，母離子為m/z324.9，子離子為m/z170.9（定量離子）和m/z288.9（定性離子），碰撞能量分別為-37、-24 eV。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

配制0.5 mg/L 的殺螺胺乙醇胺鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用針泵持續(xù)直接進(jìn)樣的方式，對(duì)殺螺胺乙醇胺鹽的質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。分別在Q1MS、MS/MS模式下采集殺螺胺乙醇胺鹽的母離子和子離子參數(shù)，再經(jīng)基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液考查，確定其定量和定性離子對(duì)。電噴霧電離時(shí)，在一級(jí)質(zhì)譜中，殺螺胺乙醇胺鹽產(chǎn)生穩(wěn)定的［M-H］-離子，失去1 個(gè)電子生成分子離子峰m/z324.9。圖1B 列出了殺螺胺乙醇胺鹽母離子可能的質(zhì)譜裂解途徑及產(chǎn)生的二級(jí)質(zhì)譜碎片離子，酰胺是蛋白質(zhì)及多肽的基本組成單元，當(dāng)R 小于4個(gè)碳時(shí)，在氧原子上的游離基中心誘導(dǎo)下，發(fā)生酰胺鍵斷裂（α斷裂），生成酰基離子C6H4ClN2O2-（m/z170.9）。另一方面，在氮原子上的游離基中心誘導(dǎo)下，可發(fā)生α斷裂，再發(fā)生氫重排，失去中性分子HCl，形成碎片離子C13H7ClN2O4（m/z288.9）。經(jīng)離子對(duì)考查，殺螺胺乙醇胺鹽采用負(fù)離子源檢測(cè)模式，選擇［M-H］-作為母離子，m/z為324.9。進(jìn)一步優(yōu)化去簇電壓后，對(duì)母離子碎片進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，得到二級(jí)質(zhì)譜碎片的全譜信息，并對(duì)碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化，建立MRM采集模式。在最佳條件下，目標(biāo)化合物能夠進(jìn)行定性與定量檢測(cè)。

離子源溫度對(duì)部分農(nóng)藥的離子化效率影響很大，不同離子源溫度下的響應(yīng)相差幾倍甚至幾十倍。因此對(duì)離子源參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，分別考察了不同溫度（400、500、600、700 ℃）對(duì)殺螺胺乙醇胺鹽峰面積的影響。結(jié)果顯示，低溫時(shí)殺螺胺乙醇胺鹽的離子化程度較小，對(duì)峰面積的影響較大；600 ℃下其峰面積最大且較穩(wěn)定，因此選擇離子源溫度為600 ℃，可保證結(jié)果的靈敏度和穩(wěn)定性。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

在1 000 mL 超純水中加入1 mL 甲酸，配制成0.1%的甲酸水溶液。分別以0.1%甲酸水-乙腈、0.1%甲酸水-甲醇為流動(dòng)相，對(duì)比了殺螺胺乙醇胺鹽在不同流動(dòng)相下的出峰時(shí)間和峰面積。結(jié)果表明，以乙腈與0.1%甲酸水為流動(dòng)相梯度洗脫時(shí)，殺螺胺乙醇胺鹽與雜質(zhì)的分離明顯，峰面積信號(hào)響應(yīng)較高，0.005 mg/L殺螺胺乙醇胺鹽的峰面積達(dá)到4.0×106mAU，因此選擇乙腈和0.1%甲酸水作為流動(dòng)相。在最佳色譜和質(zhì)譜條件下，殺螺胺乙醇胺鹽22種基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖2。

圖2 殺螺胺乙醇胺鹽22種基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖（0.005 mg/L）Fig.2 Chromatograms of 22 kinds of food matrix standard solutions of niclosamide-olamine（0.005 mg/L）

2.3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的優(yōu)化以回收率為指標(biāo)，對(duì)比了4種提取溶劑（甲醇、乙腈、1%甲酸甲醇、1%甲酸乙腈）對(duì)不同樣品中殺螺胺乙醇胺鹽的提取效果。如圖3A所示，由于殺螺胺乙醇胺鹽易溶于有機(jī)溶劑，在酸化乙腈條件下的回收率較好，以甲醇、乙腈、酸化甲醇為提取溶劑時(shí)的回收率均不理想。為達(dá)到更好的回收效果，考察了在乙腈溶液中分別加入0.1%、1%、5%甲酸時(shí)的回收率，如圖3B 所示，加入1%甲酸后殺螺胺乙醇胺鹽的回收率進(jìn)一步升高，因此最終采用1%甲酸乙腈作為提取溶劑。

圖3 不同提取溶劑（A）與不同酸化程度提取劑（B）對(duì)殺螺胺乙醇胺鹽回收率的影響Fig.3 Effects of different extraction solvents（A） and extractants with different acidification degree（B） on recoveries of niclosamide-olamine

2.3.2 凈化劑的優(yōu)化目前農(nóng)藥殘留分析的凈化方法主要是固相萃取柱和QuEChERS 法，其中固相萃取柱操作較復(fù)雜，且對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)的回收率不易滿足要求。本研究利用改進(jìn)的QuEChERS 方法進(jìn)行凈化處理，發(fā)揮其快速、簡捷、準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)。對(duì)比了C18、GCB（石墨化碳黑）、弗羅里硅土作為凈化劑對(duì)樣品的凈化效果。如圖4所示，在相同條件下，采用上述3種凈化劑的回收率均能滿足要求，其中弗羅里硅土的凈化效果更好、回收率高且成本更低，綜合考慮，最終選擇弗羅里硅土作為凈化劑。

圖4 不同凈化劑對(duì)殺螺胺乙醇胺鹽凈化效果的影響Fig.4 Effects of different purificants for niclosamide-olamine

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定農(nóng)藥殘留易受基質(zhì)效應(yīng)（ME）的影響，本研究采用下式計(jì)算樣品的基質(zhì)效應(yīng)：ME=（基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率-1）×100%。當(dāng)ME 值為正值，表示呈基質(zhì)增強(qiáng)作用，負(fù)值則表示呈基質(zhì)抑制作用。若|ME|≤20%，表示基質(zhì)效應(yīng)不顯著，可忽略；若20%<|ME|≤50%或|ME|>50%，則表示存在中等或較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)。本研究中，小麥、柑橘、平菇和桃子無顯著的基質(zhì)效應(yīng)，馬鈴薯、菜豆和胡蘿卜存在中等基質(zhì)效應(yīng)，其它基質(zhì)均存在較強(qiáng)的基質(zhì)抑制或增強(qiáng)效應(yīng)（表1）。因此，本方法采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量測(cè)定，保證方法的準(zhǔn)確性。

表1 不同樣品基質(zhì)中殺螺胺乙醇胺鹽的線性關(guān)系、基質(zhì)效應(yīng)、回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）Table 1 Linear relations，matrix effects，spiked recoveries and relative standard deviations of niclosamide-olamine in different sample matrixes（n=5）

2.5 線性關(guān)系、檢出限與定量下限

在0.005~0.10 μg/mL范圍內(nèi)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，標(biāo)樣溶液和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.99（見表1）。以定量離子響應(yīng)的3倍信噪比（S/N=3）確定檢出限，以定量離子響應(yīng)的10倍信噪比（S/N=10）確定定量下限，得到殺螺胺乙醇胺鹽在茶葉中的檢出限為0.003 mg/kg，定量下限為0.01 mg/kg，在其它基質(zhì)中的檢出限為0.002 mg/kg，定量下限為0.005 mg/kg。我國GB 2763-2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定殺螺胺乙醇胺鹽在稻谷、糙米和普通白菜中的最大殘留限量分別為2、0.5、2 mg/kg，美國、歐盟和日本等國家尚未制定其殘留限量，本方法可滿足相關(guān)限量分析的需求。

2.6 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

在空白基質(zhì)樣品中分別進(jìn)行0.01、0.05、0.1 mg/kg 3 個(gè)水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，重復(fù)處理5 次，測(cè)定回收率。由表1 可知，22 種基質(zhì)中殺螺胺乙醇胺鹽的加標(biāo)回收率為77.3%~115%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=5）小于10%，結(jié)果均滿足NY/T 788-2018《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》［21］的質(zhì)控要求。殺螺胺乙醇胺鹽在糙米基質(zhì)空白、加標(biāo)樣品和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中的典型色譜圖見圖5。

圖5 殺螺胺乙醇胺鹽的典型色譜圖Fig.5 Typical chromatograms of niclosamide-olamine

2.7 實(shí)際樣品測(cè)定

為驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性和適用性，將該方法應(yīng)用于水生蔬菜和陸生作物的樣品分析。在海南省海口市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)采集糙米、小麥、玉米、桃子等陸生作物樣品66個(gè)，從田間種植地采集水生蔬菜茭白、水芹、豆瓣菜等樣品15 個(gè)。結(jié)果在陸生作物樣品中未發(fā)現(xiàn)殺螺胺乙醇胺鹽殘留，在水生蔬菜豆瓣菜的2個(gè)樣品中檢出殺螺胺乙醇胺鹽，殘留量分別為0.028 mg/kg 和0.035 mg/kg，其余樣品均未檢出。本方法對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中殺螺胺乙醇胺鹽殘留分析具有良好的適用性。

3 結(jié) 論

本文通過改進(jìn)QuEChERS 前處理方法，建立了22 種農(nóng)產(chǎn)品中殺螺胺乙醇胺鹽的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。該方法簡單快速，耗時(shí)較短，適用于多種樣品基質(zhì)，回收率較好，能夠滿足各類農(nóng)產(chǎn)品中殺螺胺乙醇胺鹽殘留的分析需求，具有廣泛的適用性。