超高效液相色譜-三重四極桿質譜法測定化妝品中8種替丁類禁用藥物

張秋炎，梁維維，羅輝泰，廖均濤，黃 芳，吳惠勤

（廣東省科學院測試分析研究所（中國廣州分析測試中心），廣東省化學測量與應急檢測技術重點實驗室，廣東省中藥質量安全工程技術研究中心，廣東 廣州 510070）

化妝品產(chǎn)業(yè)高質量發(fā)展的同時，其安全問題也日益引起消費者的重視。藥物非法添加行為屢禁不止，給消費者的使用帶來潛在風險［1］。以西咪替丁、雷尼替丁為代表的替丁類藥物是組胺H2受體拮抗劑，能有效降低胃酸，多用于治療消化性潰瘍，如十二指腸潰瘍和胃潰瘍等。此外，替丁類藥物具有阻斷雙氫睪酮與受體結合的作用，可抑制皮脂分泌，故常單獨或聯(lián)合應用治療帶狀皰疹、蕁麻疹、過敏性紫癜、濕疹、痤瘡等皮膚病［2-3］。西咪替丁已被國家藥品監(jiān)督管理局列為化妝品中主要檢測物質之一，并公布了其檢測方法，但該方法僅對西咪替丁進行分析，并未針對其他替丁類藥物［4］。不法企業(yè)為了規(guī)避政府監(jiān)管，可能添加與西咪替丁功能相似的其他替丁類藥物替代西咪替丁。常見替丁類藥物包括雷尼替丁、羅沙替丁等8種，化學結構式如圖1所示。目前針對化妝品中替丁類藥物的測定方法主要有液相色譜法［5-6］、液相色譜-質譜聯(lián)用法［7-9］等，但上述方法涉及的替丁類化合物最多僅3 種，未包括常見的替丁類藥物。因此，建立涵蓋種類更齊全的替丁類化合物檢測方法尤為迫切，對保障化妝品質量安全具有重要的現(xiàn)實意義。

圖1 8種替丁類藥物的化學結構式Fig.1 Chemical structures of eight tidine drugs

本文首次建立了可同時測定5種不同類型化妝品基質（包括水劑類、膏霜類、乳液類、凝膠類和粉劑類）中8 種替丁類藥物的超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法（UHPLC-MS/MS）。本方法簡單高效、易操作、靈敏度高、可行性強，目前已成功應用于分析檢測工作中。本法可作為政府部門有效的技術支持和補充方案，為化妝品中非法添加藥物監(jiān)測提供科學依據(jù)，便于化妝品市場的監(jiān)管。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1290 Ⅱ UHPLC/6470A Triple Quard MS超高效液相色譜/串聯(lián)四極桿質譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；AS 3120 超聲波發(fā)生器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；TP-114 電子天平（美國Sartorious 公司）；XW-80A 快速混勻器（海門市麒麟醫(yī)用儀器廠）；1850R 高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；YMC-Triart C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，3.0 μm，日本株式會社YMC）。

乙酸、甲酸、乙酸銨及甲酸銨為LC-MS 級（美國Sigma 公司）；乙腈（ACN）及甲醇（MeOH）為LCMS級（德國Merck公司）；實驗用水為二次蒸餾水，其余所用試劑為分析純。

8 種對照品：西咪替丁（純度99.8%）、雷尼替丁（純度99.9%）、法莫替丁（純度99.5%）、尼扎替丁（純度99.6%）、拉呋替丁（純度99.8%）及鹽酸羅沙替丁醋酸酯（純度100%）購于中國食品藥品檢定研究院；乙溴替丁及硫替丁（質量濃度100 μg/mL）購于天津阿爾塔科技有限公司。所用化妝品樣品來源于市場購買或客戶委托送檢。

1.2 標準溶液配制

分別稱取西咪替丁、雷尼替丁、法莫替丁、尼扎替丁、拉呋替丁、鹽酸羅沙替丁醋酸酯約10.0 mg至10 mL容量瓶中，以甲醇作為溶劑超聲定容至刻度，制得質量濃度約為1 000 μg/mL的單標標準儲備液，轉移至棕色儲液瓶中，4 ℃保存。另分別量取乙溴替丁和硫替丁各1 mL 至10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，渦旋均勻得到10 μg/mL的單標標準儲備液，轉移至棕色儲液瓶中，4 ℃保存。

1.3 樣品處理

稱取樣品約0.2 g（精確至0.01 g）于10 mL具塞比色管中，加入2 mL水，在旋渦混合器上高速振蕩30 s 后用乙腈定容至刻度，渦旋振蕩1 min 后超聲提取15 min，待提取液靜置至室溫，4 000 r/min 下離心10 min。取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，濾液上機分析。必要時用適量80%乙腈稀釋。

1.4 儀器測定條件

1.4.1 液相色譜條件色譜柱：YMC-Triart C18（100 mm×2.1 mm，3.0 μm）；流動相：A相為0.2%（體積分數(shù)，下同）甲酸溶液，B 相為乙腈；流速：0.35 mL/min；梯度洗脫程序：0~1.00 min，5% B；1.00~6.00 min，5%~20% B，6.00~9.00 min，20%~65% B；9.00~9.01 min，65%~95% B；9.01~10.50 min，95% B；10.50~10.51 min，95%~5% B；10.51~12.00 min，5% B。進樣量：0.5 μL；柱溫：30 ℃；分析時間：12.0 min。

1.4.2 質譜條件用噴射流電噴霧離子源（AJS ESI）在正離子模式下檢測；采集方式為多反應監(jiān)測（MRM）；干燥氣流速為10 L/min；干燥氣溫度為325 ℃；鞘氣流速為11 L/min；鞘氣溫度為350 ℃；霧化氣壓力為310 kPa；毛細管入口端電壓為4 000 V；噴嘴電壓為500 V。8 種替丁類藥物的化合物信息及質譜采集參數(shù)見表1。

表1 8種替丁類藥物的分子式、CAS號、保留時間及質譜采集參數(shù)Table 1 Molecular formula，CAS registration number（CAS No.） ，retention time and MS parameters of eight tidine drugs

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優(yōu)化

分別配制1 mg/L 的8 種替丁類藥物單標標準溶液，在正、負離子模式下進行一級全掃描分析，發(fā)現(xiàn)8 種替丁類藥物在［M+H］+加合方式下響應最高。原因可能是8 種替丁類藥物均為含氮化合物，氮原子的孤對電子易接受質子，形成［M+H］+的準分子離子峰。選擇儀器自帶的Optimizer軟件對各化合物的特征子離子、碰撞能量和碎裂電壓等質譜參數(shù)進行優(yōu)化以達到歐盟2002/657/EC 關于4 個識別點的要求［10］。8種替丁類藥物的質譜采集參數(shù)見表1。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇比較了5 種不同型號色譜柱YMC-Triart C18（100 mm×2.1 mm，3.0 μm）（A）、ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18（100 mm×3.0 mm，1.8 μm）（B）、ZORBAX SB-C8RRHD（100 mm×3.0 mm，1.8 μm）（C）、Poroshell 120 PFP（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）（D）和CORTECS UPLC@T3（150 mm×2.1 mm，1.6 μm）（E）的分離效果。結果表明：8 種替丁類藥物在D 柱上的保留差，出峰較早，分離效果較差；C 柱上雷尼替丁和尼扎替丁存在色譜峰過寬或分叉等情況；8 種替丁類藥物在A 柱、B 柱和E柱上有較好的保留，且分離效果理想，雷尼替丁和尼扎替丁的峰形均無拖尾現(xiàn)象，其他6 種替丁類藥物的峰形良好；此外8種替丁類藥物在A 柱上的響應最高，B 柱次之。綜合比較，最終選擇A 柱YMCTriart C18（100 mm×2.1 mm，3.0 μm）作為色譜分離柱。

2.2.2 流動相的選擇流動相不僅會直接影響目標物的峰形，還會對目標物的保留行為產(chǎn)生影響，此外流動相也是影響質譜靈敏度的因素之一。在選定的色譜柱上，以乙腈為有機相，比較了鹽類緩沖體系（5 mmol/L 乙酸銨溶液、5 mmol/L 甲酸銨溶液）、5 mmol/L 乙酸銨溶液（含0.2%甲酸溶液）、5 mmol/L甲酸銨溶液（含0.2%甲酸溶液）、0.2%甲酸溶液和0.2%乙酸溶液6種水相對8種替丁類藥物的分離情況。結果顯示，雷尼替丁、法莫替丁及硫替丁的峰形可能是受銨鹽影響，在鹽類緩沖體系下存在色譜峰過寬或分叉等情況；鹽類緩沖體系中添加0.2%甲酸后，法莫替丁及硫替丁的峰形得到改善，但雷尼替丁的峰形無明顯改善，原因可能是替丁類化合物結構中N 原子上的孤電子對能接受質子，對流動相pH 值較敏感，其中以雷尼替丁最為明顯；0.2%甲酸溶液和0.2%乙酸溶液兩種水相體系下，雷尼替丁的峰形均得到改善，相對而言，0.2%甲酸溶液體系下雷尼替丁的峰形更尖更窄，推測是因為甲酸的酸性比乙酸強所致。經(jīng)反復實驗，以0.2%甲酸溶液為水相，乙腈為有機相，采用梯度洗脫，8 種替丁類藥物可獲得較佳分離效果且保留時間分布均勻，色譜峰無拖尾，質譜靈敏度良好。綜合考慮，最終確定的色譜分離條件如“1.4.1”所示。在該條件下，8種替丁類藥物的色譜峰形良好，色譜保留適中且靈敏度高（見圖2）。

圖2 8種替丁類藥物混合標準溶液的提取離子色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of mixed standard solution of eight tidine drugs

2.3 樣品前處理條件的優(yōu)化

本實驗前處理條件的優(yōu)化主要在于提取溶劑的選擇。待測化合物極性和樣品基質類型決定了提取溶劑的選擇［11］。實驗涉及的8種替丁類藥物結構和性質相近，易溶于甲醇和乙腈等；化妝品基質復雜，不同基質類型的化妝品適用的提取溶劑也不盡相同，通用型提取溶劑主要有甲醇和乙腈等。以乙腈作為提取溶劑時，膏霜類等復雜基質樣品不易分散，而用少量水分散后再加入乙腈則具有更好的潤濕性，增加了提取溶劑的滲透性，同時也使基質分散更均勻，對大部分化合物的提取效果更好［12］。此外，超聲波輔助提取廣泛用于化妝品的樣品前處理，水劑類、膏霜類、乳液類、凝膠類和粉劑類等絕大多數(shù)化妝品樣品均可用該法進行前處理［13-14］。在此基礎上，以5 種不同類型化妝品（包括水劑類、膏霜類、乳液類、凝膠類和粉劑類）為樣品基質，分別比較了甲醇和水-乙腈（2∶8，體積比）作為溶劑，超聲波輔助提取時，各替丁類化合物的回收率（見圖3）。結果顯示，采用兩種提取溶劑超聲提取15 min 條件下，8 種替丁類藥物的回收率相差不大，回收率均較高。考慮到乙腈沉淀大分子雜質（如硅油、蠟質等）、增溶劑（如色素及蓖麻油等）等的效果優(yōu)于甲醇，基于對儀器、色譜柱等的保護，選用水-乙腈（2∶8）作為提取溶劑。

圖3 提取溶劑對8種替丁類藥物回收率的影響Fig.3 Effect of extraction solvents on recoveries of eight tidine drugs

2.4 基質效應評價

基質效應是液相色譜-質譜分析過程中不可忽略的關鍵因素，不僅直接影響方法的靈敏度，還影響方法的準確度和精密度。基質效應通常采用公式ME=B/A進行計算，其中B為空白基質溶液作為溶劑配制的標準曲線的斜率，A為純?nèi)軇┡渲频臉藴是€的斜率［15］；ME值越接近100%，表明基質效應越可忽略不計。5種不同類型化妝品基質（包括水劑類、膏霜類、乳液類、凝膠類和粉劑類）中8種替丁類藥物的基質效應見表2。結果表明，乙溴替丁在大多數(shù)基質中存在一定的基質效應，硫替丁在水劑類基質中也存在一定的基質效應。減少基質效應的方法通常包括增加凈化步驟、稀釋樣品溶液、配制空白基質匹配標準溶液、采用同位素內(nèi)標物校正以及優(yōu)化色譜-質譜條件等［16］。為保證定量結果的準確性，綜合考慮成本、操作方便性，本文選擇基質匹配標準溶液法降低基質效應的影響。

表2 8種替丁類藥物的線性關系、檢出限、定量下限和基質效應Table 2 Linear relationship，LODs，LOQs and matrix effects of eight tidine drugs

2.5 線性范圍、檢出限與定量下限

用空白基質提取液將8 種替丁類藥物稀釋成系列混合標準溶液，按“1.4”的儀器條件進行測定，以各替丁類藥物的質量濃度為橫坐標（x，μg/L），峰面積為縱坐標（y），進行線性回歸分析。8種替丁類藥物均獲得良好的線性關系，相關系數(shù)（r2）為0.997 5~0.998 6。采用標準添加法確定各替丁類藥物的檢出限（S/N≥3）和定量下限（S/N≥10）分別為0.06~0.3 μg/L和0.2~1.0 μg/L（見表2）。

2.6 回收率與相對標準偏差

準確稱取空白水劑類、膏霜類、乳液類、凝膠類和粉劑類基質化妝品各0.2 g，進行3 個加標水平的回收實驗，每個水平按“1.3”和“1.4”方法平行測定6 次，計算各替丁類藥物的平均回收率和相對標準偏差（RSD，n=6）。由表3可見，水劑類、膏霜類、乳液類、凝膠類和粉劑類基質的平均回收率分別為80.7%~106%、90.1%~102%、82.6%~101%、82.0%~110%和86.6%~101%，均在80%~115%之間；RSD 分別為0.70%~7.0%、1.0%~5.7%、2.1%~6.9%、0.90%~7.4%和1.7%~ 7.9%，均小于10%。結果表明，本方法的準確度和精密度良好，適用于5種基質化妝品中8種替丁類藥物的檢測。

表3 8種替丁類藥物在不同基質中的平均回收率和相對標準偏差（n=6）Table 3 Average recoveries and relative standard deviations（RSDs） of eight tidine drugs in different matrixes（n=6）

2.7 穩(wěn)定性

分別在空白水劑類、膏霜類、乳液類、凝膠類和粉劑類基質化妝品中添加低、中、高3個水平的8種替丁類藥物，同一日內(nèi)連續(xù)6 次（0、5、10、15、20、24 h）測定，以峰面積計算8 種替丁類藥物在5種基質中的RSD。結果表明，5 種不同空白基質中，8 種替丁類藥物在3 個添加水平下的RSD 分別為1.2%～9.0%、0.80%～7.3%和1.1%～6.7%，本方法具有較好的穩(wěn)定性。

2.8 實際樣品測定

采用本文所建方法對客戶委托送檢的100批次化妝品進行分析，在某款祛痘凝膠中檢出西咪替丁，含量為28.2 μg/g。該陽性樣品的總離子流圖及西咪替丁的MRM色譜圖見圖4。

圖4 陽性樣品的總離子流圖（A）及西咪替丁的MRM色譜圖（B、C）Fig.4 TIC chromatogram（A） and MRM chromatograms（B，C） of cimetidine in a positive sample

3 結 論

本研究建立了同時快速測定5種不同類型化妝品基質（包括水劑類、膏霜類、乳液類、凝膠類和粉劑類）中8 種替丁類藥物的UHPLC-MS/MS 法。方法前處理簡單方便、靈敏度高、可行性強，可用于多種基質類型化妝品中替丁類藥物的檢測。該方法可作為政府部門有效的技術支持和補充方案，為監(jiān)測化妝品中非法添加藥物提供科學依據(jù)，便于化妝品市場的監(jiān)管。