基于網絡藥理學和分子對接的補氣通絡顆粒抗心血管疾病作用機理研究

邢炎華 張建 黃壯壯， 王程 李煒 劉峰，

根據世界衛生組織的統計，全世界每年約有1 750 萬人死于心血管疾病（Cardiovascular disease，CVD），而這一數字到2030 年將會達到2 420 萬[1]。CVD 的發病機制比較復雜，研究顯示其致病因素涉及遺傳、環境等諸多方面，所以單一的用藥治療方式難以取得理想效果。中藥復方在預防和治療CVD 方面具有很大的潛力[2，3]，因為其具有多靶點和多通道整體調節作用。

補氣通絡顆粒為證候類中藥新藥復方制劑，由紅芪、三七、澤瀉、當歸、川芎、蟬蛻組成，主要治療氣虛血瘀證，具有化毒通絡、補氣活血的功效。該藥為步長公司目前在研的治療證候類疾病的一款新藥，前期通過動物藥效學試驗研究，結果也表明補氣通絡顆粒具有補氣活血，化毒通絡之功效，可用于心肌缺血、腦梗死、糖尿病腎病等多種疾病中氣虛血瘀證的治療。

網絡藥理學融合了藥理學、生物信息學、計算機等多門學科的技術和內容，系統地闡明了藥物在機體中的作用機制。網絡藥理學重在強調系統性，與中醫理論的“整體觀”相一致[4，5]。臨床顯示中醫補氣活血法治療冠心病、糖尿病、高血壓等療效較好[6]。本研究采用網絡藥理學探究補氣通絡顆粒治療CVD 的藥效成分及其作用機制，以期為證侯類中藥復方的藥效成分探析提供一種研究路徑。

1 材料與方法

1.1 補氣通絡顆粒化學成分數據庫建立前期利用UPLC-Q-TOF-MSE 技術對補氣通絡顆粒的化學成分進行定性分析，共鑒定72 個化合物。使用中藥網絡藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP）收集其化學成分，建立其成分數據庫。

1.2 ADME 潛在活性成分預測利用計算機技術對補氣通絡顆粒成分數據庫中的物質進行ADME 預測和初篩，同時利用王永華等[7]建立的obioavail 1.1和pre-Caco-2 預測模型對成分數據庫中的物質口服生物利用度（OB，OB ≥30%）和Caco-2（Caco-2≥-0.40）進行計算和篩選，預測出潛在活性成分。

1.3 靶點-疾病從UniProt 數據庫篩選出與CVD相關的基因信息，再通過TTD 數據庫篩選出與CVD 基因信息相關的藥物作用靶點，從而得到補氣通絡顆粒抗CVD 的靶標。

1.4 成分-靶點構建與蛋白互作（PPI）分析基于篩選的活性物質與相關靶點，利用生物信息學（Cytoscape3.6.1）軟件構建成分與靶點之間的網絡關系，同時利用軟件相關插件對成分與靶點互作網絡關系的參數（度、介數中心數）進行優化。將所篩選的靶點導入String 11.0 數據庫，生物種類設為“Homo sapiens”，互作評分設置為＞0.9，其余設置默認并對游離節點進行隱藏，構建靶點PPI 網絡。

1.5 KEGG 和GO 富集分析利用DAVID 在線數據庫對KEGG 和GO 進行富集分析，最后篩選出補氣通絡顆粒抗CVD 的相關作用機制。

1.6 分子對接基于上述篩選出的關鍵靶點與度值靠前排名的活性物質，用分子對接軟件（Sybyl-X）進行分子對接。在PDB 數據庫中選擇已篩選出的關鍵蛋白，利用Sybyl-X 中的Sulflex 模型與候選化合物進行模擬對接。選用Sybyl/Sketch 模塊構建底物分子，選擇Powell's 能量梯度方法進行優化，選擇Tripos進行能量最小化，能量收斂設定為0.005 kcal/mol，化合物電荷類型選擇Gasteiger-Hückle，最佳構象重復次數設定為1 000 次。

2 結果

2.1 ADME 潛在活性成分篩選利用pre-Caco-2和obioavail 1.1 模型按照設置條件對自建數據庫中的72 個化合物進行篩選，最終獲得15 個具有較好潛在活性的化合物。見表1。

表1 ADME 性質較好的化合物

2.2 靶點-疾病對篩選出的15 個化合物進行“成分-靶點”構建，去重復后得到135 個關聯靶點，同時將135 個靶點和15 個化合物關聯至TCMSP 數據庫中，以心血管相關疾病種屬為篩查目標，對上述化合物和靶點進行二次篩選，最終篩選出10 個化合物，分別為異甘草素、甘草素、芒柄花黃素、Z-藁本內酯、蛇床內酯、新蛇床內酯、丙氨酸、酪氨酸、異莪術醇、肉桂醛。并篩選出與化合物相關的26個靶點，見表2。

表2 補氣通絡顆粒與抗CVD 相關的26 個潛在靶點

2.3 成分-靶點構建與PPI 分析利用Cytoscape3.6.1 軟件進行“成分-靶點”網絡構建，網構圖共有36 個節點，54 條邊，黃色節點代表10 個化合物，藍色節點代表26 個靶點，每條邊代表成分與靶點之間的聯系（見圖1）。使用Cytoscape3.6.1 軟件對“成分-靶點”網構圖進行分析，以度值和介數中心度值為指標進行計算（見表3），36 個節點的平準度值為3，介數中心度值平準值為0.048，二者均值在平均值以上的確定為關鍵化合物和靶點，包括4 個關鍵化合物分別為異苷草素、芒柄花黃素、Z-藁本內脂、酪氨酸；3 個關鍵靶點分別為PTGS1、PTGS2、ADRB2。PPI 分析結果表明，補氣通絡顆粒的成分作用于多個靶點，且各靶點之間具有相互協同作用（見圖2）。

圖1 補氣通絡顆粒抗CVD 的“藥效成分-靶點”網絡關系圖

圖2 補氣通絡顆粒抗CVD 相關靶點PPI 圖

表3 活性成分及靶點網絡分析結果

2.4 KEGG 通路和GO 富集分析26 個靶點共富集于7 條與CVD 相關的通路上。KEGG 通路分析顯示，補氣通絡顆粒抗CVD 的主要通路為Insulin signaling pathway、Calcium signaling pathway、Neuroactive ligand-receptor interaction 等（見圖3）。靶點GO 富集結果顯示，補氣通絡顆粒抗CVD 的靶點在blood circulation、circulatory system process、regulation of blood pressure 等心血管方面有明顯的富集作用，靶點富集的數量分別為13、13 和10 個（見圖4）。

圖3 補氣通絡顆粒抗CVD 的KEGG 信號通路圖

圖4 補氣通絡顆粒抗CVD 的靶點GO 富集通路圖

2.5 分子對接3 個關鍵靶蛋白ADRB2（PDB ID：3NYA）、PTGS1（PDB ID：6Y3C）和PT-GS2（PDB ID：5IKQ）與度值排名前三的化合物酪氨酸、異甘草素和芒柄花黃素分子對接結果顯示，ADRB2 與酪氨酸對接的打分值為5.4932，PTGS1 與異甘草素的打分值為5.1074，PTGS2 與芒柄花黃素的打分值為4.1662，結果表明關鍵靶蛋白和對應的化合物對接良好，這與網絡藥理學篩選的實驗結果一致，進一步驗證了網絡藥理學篩選的結果準確性。其中ADRB2 和酪氨酸對接打分值最高，表明其對接效果最好。三組對接實驗獲得靶蛋白與分子相互結合的活性位點見圖5，其中黃色線條為氫鍵作用力，是靶蛋白與活性分子相結合的主要作用力。

圖5 補氣通絡顆粒抗CVD 的關鍵靶點和關鍵活性成分的分子對接圖

3 討論

隨著對藥物研發要求的不斷提升，單靶點高選擇性的研發思路具有一定的局限性。網絡藥理學融合了多學科的技術和內容，利用系統觀和整體觀的思想，采用多靶點研究思路進行藥物的設計、篩選，為新藥研究提供了一種新方法，以達到增效減毒功效。由于疾病、藥物在生物信息相互關聯方面的復雜性，同時針對這一網絡研究缺少特異性，因此通過網絡模塊或子網絡將這一復雜網絡進行解構和降維，再將網絡模塊和子網絡作為有針對性、特異性的中藥靶點進行網絡互作分析。利用多靶點進行網絡互作分析的方法在研究中藥配伍、減毒增效等方面將發揮更大作用[8]。

本研究網絡構建與分析的關鍵化學物質中，異甘草素、芒柄花黃素、酪氨酸3 個化合物的度值大于10 并且遠高于其他化合物。異甘草素屬于異黃酮類物質，是甘草中主要藥效成分之一。李德芳等[9]綜述了異甘草素的藥理作用，發現異甘草素具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎作用，并對心血管系統有較好的保護作用。任歡歡等[10]采用Langendorff 建立離體心臟灌流模型的方法，發現異甘草素對心肌缺血再灌注損傷具有保護作用。芒柄花黃素也是一種異黃酮類化合物，廣泛存在于黃芪、甘草及葛根等豆科植物中，王健等[11]綜述了芒柄花黃素的現代研究進展，藥理研究表明該化合物具有抗腫瘤、降血脂、抗心律不齊、改善動脈粥樣硬化以及抑制血管平滑肌增殖等作用。王建康等[12]發現人體血清游離酪氨酸等氨基酸及血管內皮生長因子（VEGF）與冠心病關系密切，在疾病治療過程中應注意對其進行有效地干預。網絡靶標中度值位于前兩位的靶點PTGS2 能與9 個化合物相關聯，PTGS1 能與6 個化合物相關聯。汪圣等[13]研究發現蔥白可作用于MAPK8 和PTGS2 關鍵靶點，調控NF-κB 通路，起到抑制炎癥，改善機體血脂水平，從而起到防止動脈粥樣硬化作用。李楊等[14]發現活血化瘀中藥可通過抑制AS 小鼠PTGS2 的產生而發揮抗動脈粥樣硬化作用。Licis 等[15]發現冠狀動脈疾病患者心肌梗死發病率的降低與編碼PTGS1 基因中一種常見的啟動子變體有明顯相關性。上述關鍵化合物和關鍵靶點從文獻的角度驗證了補氣通絡顆粒抗CVD 的成分及作用機理。

補氣通絡顆粒中的活性成分通過作用于多個信號通路發揮抗CVD 的作用。鈣信號傳導通路與補氣通絡顆粒抗CVD 相關的靶點數量最多，有7 個，分別為ADRA1A、ADRB1、ADRB2、F2R、GRIN1、NOS2 和NOS3。Neuroactive ligand-receptor interaction 信號通路與補氣通絡顆粒抗CVD 相關的靶點有7 個，分別為ADRA1A、Adra2a、Adra2b、ADRB1、ADRB2、F2R、GRIN1。Insulin signaling pathway 信號通路與補氣通絡顆粒抗CVD 相關的靶點數量有4 個，分別為GSK3B、PDE3A、PYGM 和PTPN1。

本研究利用網絡藥理學對補氣通絡顆粒抗CVD 的藥效物質進行了篩選，同時對其作用機制進行了闡述。通過網絡藥理學篩選共獲得4 個與抗CVD 高度關聯的活性成分和3 個關鍵靶點，應用KEGG 通路分析獲得7 條抗CVD 的作用通路。本研究的結論體現了中醫藥理論“系統觀和整體觀”的思想，同時為補氣通絡顆粒抗CVD 藥效物質篩選以及證候類中藥復方藥效物質篩選提供了一種新的研究思路。