河北省圈養(yǎng)貉子隱孢子蟲(chóng)流行現(xiàn)狀調(diào)查

陳東前, 張玉瑾, 王建秋, 王明星, 祝玉巧, 羅 輝, 王秋悅, 劉欣超, 李文超*

(1.安徽科技學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,安徽 鳳陽(yáng) 233100;2.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)調(diào)控與健康安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 鳳陽(yáng) 233100;3.河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 秦皇島 063000)

隱孢子蟲(chóng)病(Cryptosporidiosis)是由隱孢子蟲(chóng)(Cryptosporidiumspp.)引起的一種呈全球性分布的人獸共患原蟲(chóng)病,主要感染脊椎動(dòng)物,其癥狀表現(xiàn)為腹瀉、營(yíng)養(yǎng)不良、生長(zhǎng)發(fā)育受阻等[1-3]。該蟲(chóng)通過(guò)糞-口途徑傳播,人或動(dòng)物通過(guò)攝入被隱孢子蟲(chóng)卵囊污染的水或食物,或直接接觸隱孢子蟲(chóng)病患者或患病動(dòng)物而引起感染,嚴(yán)重會(huì)導(dǎo)致死亡[4-5]。

貉子(NyctereutesprocyonoidesGray)為食肉目(Carnivoraes)、犬科(Canidae)、貉屬(Nyctereutes)動(dòng)物,其作為一種珍貴的毛皮動(dòng)物,具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。寄生蟲(chóng)病嚴(yán)重威脅貉子健康的一類(lèi)疾病,尤其是人工飼養(yǎng)的貉子,其飼養(yǎng)密度較高,活動(dòng)范圍窄,易引起寄生蟲(chóng)病流行。目前,已報(bào)道貉子可感染犬隱孢子蟲(chóng)(C.canis)、微小隱孢子蟲(chóng)(C.parvum)和安氏隱孢子蟲(chóng)(C.andersoni)等3種常見(jiàn)人獸共患隱孢子蟲(chóng)蟲(chóng)種,其中C.parvum還是人最常感染的兩種隱孢子蟲(chóng)之一[6-12]。

目前中國(guó)貉子養(yǎng)殖主要分布在東北三省及山東、河北等省份[13]。迄今,中國(guó)山東[6]、河南[7]、新疆維吾爾自治區(qū)[14]、東北三省[8,15]等省份已有貉子隱孢子蟲(chóng)感染的相關(guān)報(bào)道,河北省作為貉子養(yǎng)殖大省之一,目前僅見(jiàn)昌黎地區(qū)有貉子隱孢子蟲(chóng)感染的報(bào)道[7],因此相關(guān)研究不能很好地反映河北省貉子隱孢子蟲(chóng)感染與蟲(chóng)種/基因型分布的真實(shí)情況。鑒于此,本研究對(duì)河北省多地人工養(yǎng)殖的貉子進(jìn)行隱孢子蟲(chóng)的分子流行病學(xué)調(diào)查,了解貉子中隱孢子蟲(chóng)流行情況并評(píng)估其可能蘊(yùn)含的公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn),為相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2022年6—12月,分別從河北省石家莊市、邯鄲市、秦皇島市和張家口市等地區(qū)的5家貉子場(chǎng)共采集389份新鮮糞便樣品。上述養(yǎng)殖場(chǎng)中,貉子均飼養(yǎng)在聯(lián)排金屬籠子中,糞便直接漏到籠子下方的地面上。成年貉子(6月齡以上)一般一籠單只飼養(yǎng),幼齡貉子分窩前(45～60日齡斷奶分窩)和母貉子合籠飼養(yǎng),分窩后多只合并飼養(yǎng)一段時(shí)間后再分籠飼養(yǎng)。采樣時(shí)從籠具下方的糞堆上部采集新鮮糞便10～20 g,每個(gè)籠子僅采1次。糞便裝入潔凈自封塑料袋中,編號(hào)并記錄對(duì)應(yīng)采樣場(chǎng)、貉子年齡及糞便狀況等信息,放置于4 ℃冰箱內(nèi)冷藏待檢。

1.2 主要儀器與試劑

T100型PCR儀(伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司),Tanon1600凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。糞便DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司),rTaq DNA聚合酶(上海澤葉生物科技有限公司);BIOWESTE瓊脂糖(北京沃比森科技有限公司)。本研究所用引物均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 糞便基因組提取

依照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,提取的DNA保存于-20 ℃冰箱待檢。

1.4 隱孢子蟲(chóng)SSU rRNA基因擴(kuò)增

參照Xiao等[16]的研究,用巢式PCR方法擴(kuò)增隱孢子蟲(chóng)SSUrRNA基因,引物見(jiàn)表1。2輪PCR反應(yīng)體系體積相同,依次加入38.55 μL超純水、5 μL 10×PCR緩沖液、1 μL DNA模板(首輪PCR用提取的貉子糞便基因組DNA,第2輪PCR用首輪PCR產(chǎn)物)、0.6 μL 20 mol/L各正反引物、4 μL 1.25 mmol/L dNTP和0.25 μL 5 U/μL rTaq酶。首輪PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為94 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s,55 ℃ 45 s,72 ℃ l min,共35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。第2輪PCR除退火溫度調(diào)整為58 ℃外,其余參數(shù)同首輪PCR。用感染隱孢子蟲(chóng)的豬糞便基因組DNA作陽(yáng)性對(duì)照,隱孢子蟲(chóng)陰性豬糞便DNA提取物作陰性對(duì)照。

表1 本研究中所用引物Table 1 PCR primers used in the present study

1.5 隱孢子蟲(chóng)gp60基因擴(kuò)增

參照J(rèn)iang等[17]的引物與方法,對(duì)獲得的隱孢子蟲(chóng)SSUrRNA陽(yáng)性樣本進(jìn)行隱孢子蟲(chóng)gp60基因的擴(kuò)增,引物見(jiàn)表1。2輪PCR反應(yīng)體系體積相同,含1 μL貉子糞便基因組DNA(首輪PCR)或2 μL首輪PCR產(chǎn)物(第2輪PCR)、0.6 μL 20 mol/L各正反引物、5 μL 10×PCR緩沖液、4 μL 1.25 mmol/L dNTP、0.3 μL 5 U/μL rTaq酶、38.50 μL超純水。2輪PCR反應(yīng)擴(kuò)增反應(yīng)的參數(shù)相同,為94 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s,52 ℃ 45 s,72 ℃ 80 s,共35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。

1.6 測(cè)序與分析

第2輪PCR擴(kuò)增后,產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分離,所獲陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物送相關(guān)公司,分別用擴(kuò)增基因的第2對(duì)引物從正方和反方進(jìn)行雙向測(cè)序。測(cè)序序列用Dnaman軟件進(jìn)行編輯,在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中經(jīng)Blast搜索。為評(píng)價(jià)所獲隱孢子蟲(chóng)蟲(chóng)種/基因亞型的遺傳關(guān)系,所獲序列經(jīng)Clustal X軟件比對(duì),采用最大似然法(Maximum-likelihood Method)在Mega軟件中構(gòu)建進(jìn)化樹(shù),可逆取代模型用于替代率的計(jì)算,自展值設(shè)為1 000。新發(fā)現(xiàn)的隱孢子蟲(chóng)基因亞型根據(jù)既定的命名系統(tǒng)命名[15]。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 20.0軟件對(duì)本研究中的數(shù)據(jù)進(jìn)行Fisher's 精確檢驗(yàn)分析,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 河北省貉子隱孢子蟲(chóng)感染情況

389份貉子糞便樣本中,基于SSUrRNA基因的巢式PCR方法共檢出6份隱孢子蟲(chóng)陽(yáng)性樣品,河北省圈養(yǎng)貉子隱孢子蟲(chóng)感染率為1.5%(6/389)(表2)。隱孢子蟲(chóng)陽(yáng)性樣本分布在邯鄲、秦皇島和張家口貉子養(yǎng)殖場(chǎng),感染率分別為2.9%(3/103)、2.0%(2/100)和1.2%(1/86),石家莊未檢出隱孢子蟲(chóng)陽(yáng)性樣品,不同地區(qū)感染率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.059,P=0.063)。6月齡以上貉子隱孢子蟲(chóng)感染率為1.2%,6月齡以下貉子隱孢子蟲(chóng)感染率為1.6%,二者差異不顯著(χ2=0.096,P=0.384)。糞便正常和非正常貉子隱孢子蟲(chóng)感染率分別為0.6%和11.1%,差異顯著(χ2=23.18,P=0.001)(表3)。

表3 河北省圈養(yǎng)貉子隱孢子蟲(chóng)感染在不同年齡、糞便類(lèi)型中的分布情況Table 3 Prevalence of Cryptosporidium spp. among different age, and feces form groups of raccoon dogs in Hebei Province

2.2 貉子隱孢子蟲(chóng)遺傳分析情況

對(duì)所獲得的6份隱孢子蟲(chóng)SSUrRNA基因PCR陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和比對(duì),顯示本研究中得到的6個(gè)隱孢子蟲(chóng)SSUrRNA基因序列完全一致,Blast分析顯示其均為C.canisSSUrRNA基因,與GenBank中參考序列AF112576有100%同源性。進(jìn)化構(gòu)建樹(shù)顯示分離得到的隱孢子蟲(chóng)SSUrRNA基因與已報(bào)道的多個(gè)C.canis分離株聚為一支,進(jìn)一步表明本研究中所獲得的隱孢子蟲(chóng)蟲(chóng)種為C.canis(圖1)。

圖1 基于SSU rRNA基因構(gòu)建的隱孢子蟲(chóng)進(jìn)化樹(shù)(最大似然法,可逆取代模型)Fig.1 Phylogeny of Cryptosporidium spp. based on the partial SSU rRNA gene (the maximum-likelihood method, and the general time-reversible model)注:▲為本研究所獲犬隱孢子蟲(chóng)SSU rRNA基因序列。

6份隱孢子蟲(chóng)SSUrRNA基因陽(yáng)性樣本中,5份樣本gp60基因被成功擴(kuò)增和測(cè)序,序列經(jīng)比對(duì),剔除相同序列,得到兩個(gè)隱孢子蟲(chóng)gp60序列,Blast分析顯示其分別與C.canis基因亞型XXa2(登錄號(hào)為MT954605)和XXa4(登錄號(hào)為MT954607)序列一致。構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)顯示分離得到的兩個(gè)隱孢子蟲(chóng)gp60基因分別與已報(bào)道的C.canis基因亞型XXa2(登錄號(hào)為ON863566和MT954605)和C.canis基因亞型XXa4(登錄號(hào)為ON863565和MT954607)聚為一支,進(jìn)一步表明本研究中所獲得的兩個(gè)C.canis其基因亞型分別為XXa2和XXa4(圖2)。

圖2 基于gp60基因構(gòu)建的犬隱孢子蟲(chóng)亞型家族進(jìn)化樹(shù)(最大似然法,可逆取代模型)Fig.2 Phylogenetic relationship of C. canis gp60 nucleotide sequences (the maximum-likelihood method, and the general time-reversible model)注:▲為本研究所獲犬隱孢子蟲(chóng)gp60基因序列。

2.3 貉子隱孢子蟲(chóng)蟲(chóng)種/基因亞型分布情況

本次調(diào)查在河北省圈養(yǎng)貉子中共發(fā)現(xiàn)2種C.canis基因亞型,即XXa2和XXa4,分別占總樣本的0.5%(2/389)和0.8%(3/389)。除石家莊未檢出隱孢子蟲(chóng)陽(yáng)性樣品以及張家口貉子養(yǎng)殖場(chǎng)所獲陽(yáng)性樣本測(cè)序不成功外,邯鄲和秦皇島貉子養(yǎng)殖場(chǎng)均檢出這2種C.canis基因亞型(表2)。

3 結(jié)論與討論

迄今,全球有關(guān)貉子隱孢子蟲(chóng)的相關(guān)報(bào)道不多,且主要集中在中國(guó)、日本和波蘭等國(guó),已報(bào)道的貉子隱孢子蟲(chóng)感染率為2.5%～37.7%[6-8,10,14-15,18]。本研究中,河北省圈養(yǎng)貉子隱孢子蟲(chóng)感染率為1.5%,低于目前相關(guān)報(bào)道,但高于王步康等[9]關(guān)于河北昌黎地區(qū)貉子的報(bào)道(感染率為0)。本研究中,6月齡以上貉子和6月齡以下貉子隱孢子蟲(chóng)感染率間無(wú)顯著差異(χ2=0.096,P=0.384),這一結(jié)果與Zhang等[8]、Qian等[14]的研究結(jié)論一致,但與Wang等[6]、王步康等[9]的研究不一致,分析不同研究中結(jié)論不一致的原因,可能與不同研究中所用樣本量大小、采樣地點(diǎn)、飼養(yǎng)管理及樣本處理方法等不同有關(guān)。同時(shí),本研究中,糞便不正常貉子隱孢子蟲(chóng)感染率(11.1%)顯著高于糞便正常的貉子(0.6%)(χ2=23.18,P=0.001),分析其差異原因可能與動(dòng)物的飼養(yǎng)環(huán)境與衛(wèi)生管理等相關(guān)。

本研究中,C.canis是河北省圈養(yǎng)貉子檢出的唯一隱孢子蟲(chóng)蟲(chóng)種,這一結(jié)果與中國(guó)黑龍江[8]、新疆維吾爾自治區(qū)[14]、山東[6]等地的報(bào)道一致。C.canis是對(duì)人有致病性的5種最常見(jiàn)的隱孢子蟲(chóng)蟲(chóng)種之一,頻繁地發(fā)生于發(fā)展中國(guó)家人群[19]。從事貉子等毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖、銷(xiāo)售、加工的從業(yè)人員應(yīng)了解該蟲(chóng)種的傳播途徑等相關(guān)知識(shí),做好自身防護(hù),嚴(yán)防出現(xiàn)人畜共患傳播。

借助于新近開(kāi)發(fā)的基于gp60基因的分型工具,分析顯示河北省圈養(yǎng)貉子感染的C.canis共存在2個(gè)基因亞型,即XXa2和XXa4,顯示貉子源C.canis具有一定的遺傳多樣性[17]。此外,XXa2和XXa4基因亞型在美國(guó)、秘魯、埃塞俄比亞和牙買(mǎi)加的人群中已有報(bào)道,進(jìn)一步顯示貉子源C.canis具有人畜共患性,應(yīng)引起高度重視[17]。Wang等[6]等研究顯示不同的毛皮動(dòng)物感染的C.canis基因亞型不同,如貉子主要感染XXa,水貂只感染XXd和XXf,狐貍僅感染XXg,暗示毛皮動(dòng)物源C.canis如同其他人群中常見(jiàn)的隱孢子蟲(chóng)蟲(chóng)種C.parvum,C.hominis和C.ubiquitum一樣,存在明顯宿主適應(yīng)性[20]。未來(lái)尚需進(jìn)一步加大對(duì)毛皮動(dòng)物隱孢子蟲(chóng)流行蟲(chóng)種、傳播模式等的研究,以積累更多流行病學(xué)數(shù)據(jù),進(jìn)而闡明其隱孢子蟲(chóng)蟲(chóng)種遺傳多樣性和宿主適應(yīng)性等特征。