低氧對炎性環境下髓核細胞凋亡的作用及機制

李 磊 ，王一范2，施強慧，鐘華建，曹佳實

1.溫州醫科大學附屬衢州醫院（衢州市人民醫院）骨科，衢州 324000

2.海軍軍醫大學長征醫院健康管理科，上海 200003

3.中國人民解放軍63680 部隊醫院骨科，江陰 214400

4.海軍軍醫大學長征醫院骨科，上海 200003

5.海軍軍醫大學海軍特色醫學中心，上海 200433

椎間盤是脊柱內包含髓核、纖維環及軟骨終板的“三明治”結構，與相鄰椎體組成脊柱運動單元，在維持脊柱穩定性及活動度中發揮重要作用［1］。椎間盤退行性變表現為炎性反應，髓核細胞凋亡，細胞外基質代謝紊亂，神經、血管長入椎間盤等，其中炎性反應尤為重要［2-3］。退行性變早期，炎性反應由髓核組織中的髓核細胞或免疫細胞引發，通過增加促炎因子分泌誘導髓核細胞凋亡、細胞外基質降解等，加劇椎間盤退行性變進程；退行性變晚期血管長入椎間盤，循環血液中免疫細胞被募集至椎間盤，進一步加劇炎性反應［4］。

椎間盤是人體內最大的無血管區域，其氧氣供應依賴于附著在軟骨終板和纖維環外層的毛細血管網，循環血液攜帶的氧分子通過毛細血管網經椎體終板的滲透作用運輸至椎間盤［5］，導致椎間盤內（尤其髓核區域）形成生理性低氧環境。當椎間盤發生退行性變時，軟骨終板鈣化進一步削弱髓核區域的氧供［6］，同時，低氧可誘導附著在纖維環外圍的毛細血管向椎間盤內部生長，當血管穿透纖維環蔓延至髓核區域時，循環血液中的氧分子可直接進入椎間盤內部，影響低氧環境，該階段患者通常會出現頸腰痛等臨床癥狀，提示椎間盤退行性變發展至病程晚期［7］。因此，椎間盤內部髓核組織從健康到退行性變中晚期均處于低氧環境，為進一步探究椎間盤退行性變的生物學過程，須明確低氧與炎性反應的相互作用及對髓核細胞的影響。NLRP3 炎性小體是目前已知炎性小體中研究最為透徹的一種，對炎性反應啟動具有重要作用，其對椎間盤退行性變的促進作用已基本明確［8］。本研究擬通過體外實驗，對大鼠原代髓核細胞施加低氧和炎性刺激雙重干預，觀察髓核細胞凋亡及NLRP3 炎性小體改變，為闡明低氧對炎性環境下髓核細胞的影響及作用機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 試劑

NLRP3 抗體（ab270449）、促炎因子白細胞介素-1β（IL-1β）抗體（ab254360）、Caspase-1 抗體（ab207802）、Caspase-3 抗體（ab13585）、BAX 抗體（ab32503）、Bcl-2 抗體（ab182858）均購自Abcam公司；IL-1β 購自Peprotech 公司，NLRP3 炎性小體激活劑QS-21（HY-101092）購自MedChemExpress公司；大鼠IL-1β ELISA 試劑盒（ab235646）、大鼠IL-18 ELISA 試劑盒（ab213909）購自Abcam 公司，大鼠IL-8 ELISA 試劑盒（ml037351）購自上海酶聯生物科技有限公司，Annexin V FITC/PI 流式凋亡試劑盒（APCC101）購自杭州聯科生物技術股份有限公司，TB Green? Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒（RR820A）及反轉錄試劑盒（RR047A）購自TaKaRa 公司，TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。CCK-8 試劑盒（CK04）購自日本同仁化學研究所。

1.2 髓核細胞分離和培養

采用大鼠原代髓核細胞進行實驗，髓核細胞提取參照Risbud 等［9］的方法。經分離、消化后獲得的髓核細胞采用含10%胎牛血清（Gibco 公司）的DMEM 高糖培養基制備細胞懸液并均勻鋪在T25 細胞培養瓶中，置于常規細胞培養箱培養，72 ～ 96 h后更換細胞培養基，之后每3 d更換一次培養基，待細胞生長至約80%匯合時進行鋪板、傳代或凍存，取2 ～ 3 代的髓核細胞進行實驗。

1.3 細胞干預

①采用MIC101低氧密閉小室（Billups-Rothenberg公司）進行低氧干預，將髓核細胞置于小室中并關閉小室，留有進、出氣管道，將三元氣（1%氧氣、5%二氧化碳和94%氮氣）經進氣孔輸注到低氧小室，5 min后，待小室內空氣全部被三元氣置換后關閉小室進、出氣管道，使小室內維持密閉狀態，干預24 ～72 h。干預結束后，采用CCK-8 法檢測細胞活性，采用流式細胞術及TUNEL 染色檢測細胞凋亡情況，采用蛋白質印跡法檢測凋亡相關蛋白表達水平。②采用25 ng/mL 的促炎因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）干預髓核細胞模擬椎間盤退行性變時髓核細胞所處的炎性環境，同時施加低氧或常氧干預24 ～ 72 h，采用上述相應方法檢測髓核細胞活性及凋亡水平。③采用TNF-α 聯合低氧或常氧干預髓核細胞48 h，以低氧或常氧干預48 h 的髓核細胞作為對照，通過實時熒光定量PCR 檢測髓核細胞內炎性因子白細胞介素（IL）-1β、IL-8、IL-18 mRNA 表達水平，通過ELISA 檢測細胞上清中炎性細胞因子含量，通過蛋白質印跡法檢測NLRP3 炎性小體相關蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-1β 表達水平。④采用NLRP3 炎性小體激動劑QS-21 刺激炎性環境下髓核細胞，并置于常氧或低氧條件下干預48 h，通過流式細胞術及TUNEL 染色檢測細胞凋亡情況，采用蛋白質印跡法檢測凋亡相關蛋白表達水平。

1.4 檢測方法

①蛋白質印跡法：預冷PBS 緩沖液洗滌髓核細胞2 遍，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液，冰上反應10 min 后用細胞刮收集細胞及細胞裂解液，離心取上清，即得蛋白液；取部分蛋白液經BCA 法測定蛋白濃度；剩余蛋白液加入上樣緩沖液，95℃加熱5 min；根據蛋白濃度計算各組蛋白上樣體積，根據目的蛋白分子量配制相應濃度SDS-PAGE膠，進行上樣、電泳、轉膜、封閉，孵育一抗、二抗，ECL 顯影后觀察，通過條帶灰度值計算目的蛋白相對表達量。②實時熒光定量PCR：采用總RNA 提取試劑盒（DP419，Tiangen 公司）提取細胞總RNA，測定濃度后取2 μg RNA 添加到反轉錄體系中合成樣本cDNA。隨后配制20 μL 的反應體系，包含cDNA 模板、目的基因特異性PCR 引物、滅菌水和TB Green? Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒（RR820A）。PCR反應條件：95℃ 30 s、95℃ 5 s、60℃ 10 s、72℃ 25 s，40 個循環。采用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量。③CCK-8、流式細胞術、TUNEL和ELISA：根據試劑盒說明書進行操作。

1.5 統計學處理

采用Graphpad 9.0 軟件對數據進行統計分析，符合正態分布的計量資料以±s表示，采用 Studentt檢驗或單因素方差分析進行比較；以P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 低氧對正常環境下髓核細胞凋亡無顯著影響

與常氧組相比，低氧組髓核細胞在干預24 ～ 72 h后活性無明顯變化（圖1a）。隨著干預時間延長，常氧組和低氧組髓核細胞凋亡率逐漸增加，72 h 時凋亡細胞比例與24 h 相比，差異均有統計學意義（P＜ 0.05，圖1b、c）；細胞內凋亡相關蛋白Cleaved caspase-3 和BAX 表達水平逐步升高、Bcl2 表達水平逐步降低，48 h、72 h 時與24 h 相比，差異均有統計學意義（P＜ 0.05，圖1d、e）；TUNEL 染色陽性細胞占比逐漸增加，72 h 時與24 h 時相比，差異有統計學意義（P＜ 0.05，圖1f、g）。值得注意的是，各時間點上述指標常氧組和低氧組之間相比，差異無統計學意義（P＞ 0.05），說明正常環境下髓核細胞凋亡與氧濃度無關，即低氧對正常髓核細胞凋亡無明顯影響。

圖1 低氧對正常環境中髓核細胞凋亡影響Fig. 1 Effect of hypoxia on nucleus pulposus cell apoptosis in normal condition

2.2 低氧抑制炎性環境下髓核細胞凋亡

隨著炎性刺激時間延長，常氧組髓核細胞活性降低（圖2a），凋亡比例增加（圖2b、c），凋亡相關蛋白Cleaved caspase-3 和BAX 表達水平升高、Bcl2表達水平降低（圖2d、e），TUNEL 染色陽性細胞占比增加（圖2f、g），48 h、72 h 時與24 h 時相比，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。低氧組髓核細胞上述指標隨炎性刺激時間變化不明顯。與常氧組相比，各時間點低氧組髓核細胞活性高，凋亡比例低，凋亡相關蛋白Cleaved caspase-3 和BAX 表達水平低，Bcl2 表達水平高，TUNEL 染色陽性細胞占比少，差異均有統計學意義（P＜ 0.05），說明低氧對炎性環境下髓核細胞凋亡具有抑制作用。

圖2 低氧對TNF-α誘導的炎性環境下髓核細胞凋亡影響Fig. 2 Effect of hypoxia on nucleus pulposus cell apoptosis in inflammatory environment induced by TNF-α

2.3 低氧抑制炎性環境下髓核細胞內NLRP3 炎性小體激活

未施加炎性刺激的低氧和常氧組髓核細胞表達及分泌的炎性細胞因子均處于低水平，組間差異無統計學意義（P＞ 0.05）；TNF-α刺激48 h 后，常氧組髓核細胞表達及分泌的IL-1β、IL-8、IL-18 均升高，而低氧組髓核細胞仍處于較低水平（圖3a ～ f），說明炎性環境下髓核細胞內炎性反應激活，而低氧對該激活過程具有阻礙作用。通過蛋白質印跡法檢測NLRP3 炎性小體相關蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-1β 的表達水平，結果顯示，炎性環境下髓核細胞內NLRP3、Caspase-1、IL-1β 表達增加，而低氧干預能夠削弱炎性環境所誘發的NLRP3 炎性小體相關蛋白表達（圖3g、h），提示低氧可抑制炎性環境下髓核細胞內NLRP3炎性小體激活。

圖3 低氧對炎性環境下髓核細胞內NLRP3 炎性小體激活的影響Fig. 3 Effect of hypoxia on NLRP3 inflammasome activation of nucleus pulposus cell in inflammatory environment

2.4 低氧通過NLRP3 炎性小體抑制炎性環境下髓核細胞凋亡

在炎性環境下，使用NLRP3 炎性小體激動劑QS-21激活NLRP3炎性小體后，常氧組髓核細胞凋亡比例無明顯變化，而低氧組髓核細胞細胞凋亡比例增加（P＜ 0.05，圖4a、b）；常氧組Cleaved caspase-3和BAX 蛋白表達無明顯變化、Bcl2 蛋白表達降低，而低氧組Cleaved caspase-3 和BAX 蛋白表達升高、Bcl2 蛋白表達降低（圖4c、d）；常氧組TUNEL 染色陽性細胞占比無明顯變化，而低氧組TUNEL染色陽性細胞占比增高（圖4e、f）。以上結果說明NLRP3炎性小體激活能夠削弱低氧對炎性環境下髓核細胞凋亡的抑制作用，提示NLRP3 炎性小體在低氧調控炎性環境下髓核細胞凋亡中發揮重要作用。

3 討 論

氧氣是真核細胞通過氧化磷酸化產生足量ATP，維持細胞活性的重要物質［10］。由于椎間盤內無血管生長，髓核細胞處于生理性低氧環境，導致其主要通過無氧糖酵解獲取ATP［11］。低氧作為椎間盤內最為重要的微環境特征，對髓核細胞具有多重影響，如Kim 等［12］發現低氧可通過調控髓核細胞自噬和凋亡維持細胞活性，Silagi 等［13］證實低氧可通過低氧誘導因子調控髓核細胞能量代謝、維持髓核細胞自身穩態，Novais 等［14］發現低氧可調控內質網應激，影響髓核細胞外基質成分表達及分泌。以上研究體現低氧對髓核細胞的重要調控作用，但均是針對低氧開展的單因素研究。髓核組織微環境復雜多樣，單因素體外研究無法有效模擬疾病進程，導致體外研究結果難以在體內獲得進一步驗證。因此，聯合多個因素，分析彼此相關性及對髓核細胞的影響是提升椎間盤退行性變體外研究可靠性的重要方法。截止目前，相應研究報道較少，Wang等［15］通過低氧和血清剝奪2 種干預方式探索低氧和低營養對髓核細胞外基質代謝的影響及二者之間的關系，發現低氧顯著緩解低營養導致的細胞外基質降解。低氧和低營養均是椎間盤生理環境的重要特征，故該研究初步闡明正常椎間盤微環境相互作用及對髓核細胞的影響；而發生退行性變的椎間盤微環境相互作用的研究暫未見報道。

相較于正常椎間盤，發生退行性變的椎間盤微環境突出表現為炎性反應和代謝廢物的積聚，導致髓核組織中炎性細胞因子IL-1、TNF-α、IL-6、IL-8、前列腺素 E2（PGE2）等表達及分泌增加［16］。炎性反應可能是引發椎間盤退行性變患者頸腰痛癥狀的關鍵因素，Pedersen 等［17］發現，腰椎椎間盤突出癥患者的腰痛癥狀與其血清內IL-6 及IL-8 含量密切相關；Krock 等［18］進一步研究發現，IL-8 可作為抗炎治療靶點用于緩解椎間盤退行性變患者頸腰痛癥狀。以上研究均說明炎性反應對椎間盤退行性變影響重大，是椎間盤退行性變的重要病理反應，而低氧是貫穿椎間盤生理到病理狀態的微環境特征。為探索低氧在發生退行性變的椎間盤內的作用，本研究針對低氧和炎性反應相互作用及對髓核細胞的影響進行研究，發現低氧對正常髓核細胞活性無明顯影響，而對炎性刺激誘導發生退行性變的髓核細胞具有保護效應，突顯低氧在發生退行性變的椎間盤內的重要作用。

關于低氧與炎性反應相互作用的研究在人體其他疾病中報道較多。有研究［19］發現，低氧可促進炎性反應發生，而炎性反應進一步加劇氧含量的丟失，二者呈相互促進關系。然而，近期基于基因敲除小鼠的炎性腸病相關研究結果顯示，低氧有助于小鼠腸道黏膜炎性反應的恢復［20-21］，提示低氧對炎性反應具有雙重作用，可能受作用部位影響［22］。椎間盤發生退行性變時，低氧與炎性反應同時存在，本研究基于大鼠髓核細胞開展體外實驗，發現低氧可保護炎性環境下髓核細胞免于凋亡，進一步研究發現低氧通過抑制NLRP3 炎性小體激活而抑制髓核細胞凋亡。

炎性小體是細胞啟動炎性反應的發動機，炎性小體的組裝或激活失調將導致人體多種疾病發生。目前研究較多的炎性小體包括NLRP1、NLRP3、NLRC4 和AIM2，其中NLRP3 研究最為廣泛。NLRP3 與炎性反應、細胞外基質降解、髓核細胞凋亡等密切相關，深刻影響椎間盤退行性變進程［8］。此外，NLRP3 在其他疾病研究中被證實受低氧調控，Cosin-Roger 等［23］發現低氧通過抑制NLRP3 炎性小體及下游自噬活性緩解腸道炎性反應，Yang等［24］發現低氧可促進人牙齦成纖維細胞中NLRP3炎性小體激活，說明低氧對NLRP3 及炎性反應的調控具有多樣性。本研究發現，低氧對NLRP3 炎性小體激活具有抑制效應，在調控炎性環境下髓核細胞凋亡中作用顯著。值得一提的是，本研究使用QS-21激活炎性環境下低氧及常氧組髓核細胞內NLRP3炎性小體活性后，僅促進低氧組髓核細胞凋亡，而對常氧組髓核細胞凋亡無明顯影響。該結果提示，在炎性環境下，常氧組髓核細胞內NLRP3 炎性小體活性足夠維持炎性反應，QS-21 進一步活化NLRP3炎性小體對炎性反應影響甚微，因而髓核細胞凋亡無明顯變化；而低氧組髓核細胞因NLRP3 炎性小體活性受低氧抑制，炎性反應啟動受阻，QS-21 活化NLRP3 炎性小體后釋放炎性反應活性，導致髓核細胞凋亡增加。

綜上，本研究通過體外研究，針對髓核組織特征性低氧和椎間盤退行性變時炎性反應之間的相互作用及對髓核細胞凋亡的影響展開探索，發現低氧可通過抑制NLRP3 炎性小體激活緩解炎性環境下髓核細胞凋亡，突顯低氧在椎間盤退行性變進程中的保護作用。