GTSE1在肝癌中的表達及其對預后和免疫浸潤的影響

譚程鵬 劉曉紅 李 錕

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原發性肝癌的主要病理組織學類型,占比約為90%。它作為全球第六大最常見的癌癥,給社會帶來了巨大的健康和經濟負擔[1,2]。此外,由于其不良預后,HCC是癌癥死亡的第四大原因。目前,癌癥治療策略主要包括手術、化療、放療、靶向治療和免疫治療,但患者的預后和存活率并不理想。HCC的早期診斷和早期治療可以顯著提高患者的整體治療效果。然而,缺乏有效的預后指標極大地限制了總體生存率,這表明預后標志物的鑒定對于改善肝癌預后、豐富治療方案至關重要[3,4]。

G2/S期應答相關蛋白1(G2and S phase-expressed protein 1,GTSE1)是定位于染色體22q13.2～q13.3的p53誘導基因,在細胞周期的G2期和S期顯著表達[5,6]。GTSE1被GTSE1啟動子區域上的功能性p53結合而激活,并編碼GTSE1蛋白,導致從G2期到M期的轉換延遲[7]。研究表明,GTSE1的過表達有助于促進不同腫瘤中細胞的增殖、遷移和侵襲,這是通過將p53轉位到細胞質中來實現的[8,9]。

研究表明,GTSE1的過表達與乳腺癌、膀胱癌和肝細胞癌患者的不良預后相關,但其在癌癥的發生、發展中的作用機制知之甚少[10,11]。本研究利用生物信息學技術探究了GTSE1在人類癌癥中的表達和預后意義,以及在HCC中GTSE1基因表達與免疫細胞浸潤的關系。

資料與方法

1.數據來源及處理:本項研究數據來自癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)。使用R 4.1.3整合原始數據并驗證數據庫分析結果。

2.數據分析:Kaplan-Meier數據庫含有多數據庫的基因表達數據以及生存信息,其中包含360例肝癌患者的生存數據,可根據基因的中位表達水平將患者分為高表達組和低表達組進行生存分析。基因表達譜交互分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)數據庫利用表達數據和臨床數據,可以在線分析不同基因的生物學作用,例如預后相關生物學標志物,癌癥特異性非編碼RNA和COVID-19相關基因ACE2的表達譜。人類蛋白質圖譜(Human Protein Atlas,HPA)數據庫基于蛋白組學、轉錄組學以及系統生物學數據,可以繪制組織、細胞、器官等圖譜。

圖1 GTSE1在不同癌癥組織中的差異表達

圖2 HPA數據庫中GTSE1在細胞中的定位

應用Kaplan-Meier數據庫、生物醫學數據分析網站SangerBox、GEPIA數據庫進行生存數據分析,驗證GTSE1基因表達與HCC以及其他不同類型癌癥中的多層面預后相關性,包括總體生存期(overall survival,OS)、無進展生存期(progression-free survival,PFS)、無病生存期(disease-free survival,DFS)、疾病特異性生存期(disease-special survival,DSS)。使用Kaplan-Meier法分析HCC患者不同臨床病理因素中GTSE1基因表達與預后的相關性,其中HCC分期方法包括巴塞羅那分期、TNM分級。應用HPA數據庫鑒定GTSE1在人樣本中的蛋白表達。

腫瘤免疫估計資源(Tumor Immune Estimation Resource,TIMER)數據庫利用高通量測序(RNA-Seq表達譜)數據分析腫瘤組織中免疫細胞的浸潤情況,主要提供B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突細胞等6種免疫細胞的浸潤情況。本研究利用TIMER數據庫分析GTSE1在不同癌癥中的表達差異,及GTSE1與HCC中免疫細胞浸潤水平的相關性分析(P<0.05)。

應用R 4.1.3軟件處理從TCGA-LIHC數據集下載的RNA-Seq數據和臨床數據,得到19620個基因,根據GTSE1表達量計算其中位數,應用DESeq2包,將基因集分為高、低表達組,取log2|fold change|>2,P<0.05,得到了458個GTSE1相關差異表達基因,應用R軟件的ClusterProfiler包,對GTSE1相關差異表達基因進行基因本體(gene ontology, GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)富集分析(P<0.05)。

3.標本收集和免疫組化驗證GTSE1在人體HCC組織中的表達:(1)樣本采集:收集3例確診為HCC患者術后的肝癌及癌旁組織。本研究獲武漢大學中南醫院醫學倫理學委員會批準(倫理學審批號:臨研倫2022019),研究對象及家屬已簽署知情同意書。(2)抗體及方法:GTSE1抗體購自北京博奧森生物技術有限公司,山羊抗兔鼠通用二抗購自丹麥Dako公司。采用間接法行免疫組化實驗。(3)實驗步驟:肝癌組織石蠟切片經二甲苯脫蠟及梯度乙醇充分水化,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)沖洗3次。抗原修復:用乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)抗原修復緩沖液煮沸,95℃ 15min。阻斷內源性過氧化物酶:切片放入3%過氧化氫溶液,室溫避光孵育25min,PBS液洗3次。血清封閉:在組化圈內滴加3% 牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)均勻覆蓋組織,室溫封閉30min。敷一抗,4℃孵育過夜。玻片置于PBS中晃動洗滌3次。敷二抗,室溫孵育50min。二氨基聯苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色,顯微鏡下控制顯色時間,陽性為棕黃色,自來水沖洗終止顯色。蘇木精復染細胞核。脫水封片。

結 果

1.GTSE1在癌組織和正常組織中的差異表達:使用TIMER數據庫對TCGA數據集處理分析。結果表明,在乳腺浸潤癌(breast invasive carcinoma,BRCA)、膽管癌(cholangiocarcinoma,CHOL)、肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)等20種腫瘤中,GTSE1的表達顯著上調(P<0.001)。為了進一步了解GTSE1在HCC中的表達情況,本研究使用R 4.1.3軟件整理分析了從TCGA數據庫獲取的TCGA-LIHC數據,取log2|fold change|>2,P<0.05,得到369個腫瘤樣本和50個正常組織樣本,以及GTSE1在樣本中的表達數據,研究發現,GTSE1在HCC組織中的表達較正常組織顯著上調,詳見圖1。

2.免疫組化驗證GTSE1在HCC組織中的表達情況:通過HPA數據庫分析GTSE1在人基因組圖譜中的表達及蛋白定位發現,人類細胞系RH-30的免疫熒光染色顯示該蛋白表達定位在質膜和中心體(圖2)。免疫組化實驗結果顯示,GTSE1蛋白定位于細胞質,在100倍和400倍鏡下觀察發現,在HCC組織中,GTSE1的表達較癌旁組織表達水平更高。免疫組化染色后,細胞質內出現淡黃色顆粒為弱陽性,深棕色顆粒為強陽性表達(圖3)。

3.GTSE1多方面預后價值分析:本研究按不同生存指標對GTSE1基因表達與HCC及其他腫瘤患者預后之間的關系進行了評估。生存指標包括OS、DSS、PFS和DFS。單因素生存分析揭示,GTSE1的表達與不同癌癥患者OS的關系,發現在肝細胞癌、膠質瘤等18種腫瘤中,GTSE1高表達預后差(P<0.05),而在胸腺癌中,GTSE1低表達預后差(P<0.01),詳見圖4。本研究進一步完善了生存曲線分析。應用GEPIA數據庫分析發現,GTSE1高表達與HCC預后較差相關(P<0.05,圖5中E、F),使用Kaplan-Meier法進一步驗證,GTSE1高表達與HCC預后較差顯著相關,詳見圖5中A～D。

圖4 33種腫瘤中GTSE1表達危險比的森林圖

圖5 GTSE1基因表達與HCC患者預后的關系

4.GSTE1基因表達與肝細胞癌患者病理因素、臨床特征的相關性分析:應用Kaplan-Meier數據庫分析了GTSE1基因表達與HCC患者臨床特征、病理因素之間的關系,結果見表1。數據庫中包含364例HCC患者,GTSE1高表達與女性及男性患者不良預后顯著相關,但兩者間無明顯差異。3種HCC分期或分級方式中,均發現GTSE1高表達的患者預后不良。無血管侵犯或未感染肝炎病毒的肝癌患者中,GTSE1過表達的患者預后更差(P<0.05)。

表1 Kaplan-Meier數據庫分析GSTE1基因表達與肝細胞癌患者臨床特征、病理因素的相關性

5.GTSE1的表達與免疫細胞浸潤水平的相關性分析:研究表明,腫瘤免疫微環境在腫瘤的發生、發展過程中具有重要的作用。本研究使用來自TIMER數據庫中371例HCC患者的數據,對GTSE1在HCC組織中的表達與免疫滲透水平之間的關系進行了相關性分析。結果表明,GTSE1基因的表達與腫瘤純度(r=0.128)呈正相關(P<0.05),且在HCC中,GTSE1表達與B細胞(r=0.484)、CD8+T 細胞(r=0.296)、CD4+T 細胞(r=0.402)、巨噬細胞(r=0.484)、中性粒細胞(r=0.360)和樹突狀細胞(r=0.425)的浸潤水平呈顯著正相關(P<0.001),詳見圖6。

6.GTSE1在HCC中的GO和KEGG富集分析:GO富集分析由生物過程(biological process,BP)、細胞組分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)3部分組成。BP分析結果表明,GTSE1相關差異基因在核分裂、有絲分裂核分裂、細胞器裂變等途徑中顯著豐富;在CC分析中,GTSE1產物發揮作用的主要場所包括突觸膜、離子通道配合物等;MF分析表明,顯著豐富的途徑是通道活動和離子通道活性。KEGG富集分析發現,GTSE1相關基因參與的主要通路包括細胞周期、神經活性配體-受體相互作用等,詳見圖7。

圖7 富集分析結果

討 論

肝癌由于早期缺乏特異性的癥狀和體征,多數發現時已經處于晚期,具有高病死率、低存活率等特點。

本研究通過多數據庫聯合分析,以及免疫組化實驗驗證,明確了GTSE1在腫瘤組織中的表達水平,及其在HCC發生、發展中發揮著一定的作用。TIMER數據庫分析表明,在肝細胞癌、膽管癌等20種腫瘤中,GTSE1的表達顯著上調。采用Kaplan-Meier數據庫分析GTSE1表達與預后的相關性,本研究發現,GTSE1過表達與HCC不良預后顯著相關。通過分析GSTE1基因表達與HCC患者臨床特征、病理因素的相關性,進一步驗證了GTSE1過表達對HCC患者預后的不良影響。研究表明,肝癌在男性患者中發生率和病死率均比女性高2～3倍,但在本研究中,男性患者與女性患者的預后未見明顯差異,這可能是由于Kaplan-Meier數據庫樣本量較小導致的[12]。GTSE1在乳腺癌、肢端黑色素瘤、透明細胞腎細胞癌、肝細胞癌等多種癌癥中表達明顯上調,且與腫瘤預后不良相關[13,44]。這與本研究結果一致。本研究認為,GTSE1可作為一種潛在的HCC預后生物學標志物,但其影響肝癌發生、發展的具體機制還需進一步探索。

腫瘤微環境是由腫瘤細胞、非惡性細胞、血管、細胞外基質和其他物質組成的復雜結構。不同類型的免疫細胞在腫瘤微環境中發揮不同的調節作用[15]。研究表明,癌細胞與腫瘤微環境的各種成分之間的相互作用對腫瘤發生免疫逃逸有著極大的影響,最終導致腫瘤的增殖、復發和轉移[16]。腫瘤微環境顯著影響治療反應和臨床結果[17]。免疫細胞是腫瘤基質的重要組成部分,且在其中發揮關鍵作用[18]。先天免疫細胞(巨噬細胞、中性粒細胞、樹突細胞和自然殺傷細胞等)以及適應性免疫細胞(T細胞和B細胞)在腫瘤中存在時有助于腫瘤進展[19]。中性粒細胞在腫瘤內的炎癥中起著核心作用,中性粒細胞通過釋放活性氧或蛋白酶可促進腫瘤發生,并可促進腫瘤中血管生成從而促進腫瘤發生、發展[20,21]。GTSE1對HCC免疫微環境的影響及其作用機制尚未得到充分研究。通過TIMER數據庫分析發現,在HCC中,GTSE1基因的表達與腫瘤純度呈正相關(P<0.05),與B細胞、CD8+T細胞等6種免疫細胞的浸潤水平呈顯著正相關(P<0.001)。

本研究認為,GTSE1在肝細胞癌中可通過促進免疫細胞浸潤從而影響HCC的發展,且對腫瘤免疫具有重要作用,未來對GTSE1在肝癌中免疫細胞浸潤的前瞻性研究可能會為腫瘤發生、發展及免疫細胞浸潤提供更多見解,并優化肝癌治療策略,以提高免疫治療的療效。

富集分析結果表明,GTSE1相關的差異表達基因主要富集于核分裂、細胞器裂變、離子通道活性等基因模塊,提示其與腫瘤發生、發展密切相關;其參與的信號通路主要包括神經活性配體-受體的相互作用、細胞周期等,為進一步研究GTSE1參與腫瘤生物學的具體分子機制提供了思路。

綜上所述,GTSE1在腫瘤的發生、發展中發揮著重要作用,為進一步研究GTSE1表達對腫瘤預后的影響及潛在分子機制提供了理論基礎。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。