基于網絡藥理學和細胞實驗探討艾迪注射液治療卵巢癌的機制研究

鄧志敏 吳瑪麗 代芳芳 程艷香

卵巢癌是病死率最高的女性生殖系統惡性腫瘤,由于缺少有效的早期診斷手段,大多數患者在確診時已為中晚期[1]。臨床上常以腫瘤細胞減滅術聯合紫杉醇、鉑類化療為主要治療方案,但晚期患者的5年生存率不足30%[2]。盡管分子靶向技術和免疫治療等新療法在不斷改進,但療效欠佳[3]。中國傳統醫藥講究“扶本祛邪”,在延長患者生存時間和改善生活質量等方面具有一定優勢,許多中藥復方和中藥注射液已應用于腫瘤臨床治療,并獲得良好效果[4]。Wang等[5]研究證實,中草藥聯合化療可顯著提高治療效果,減少毒性不良反應,改善中醫證候和癥狀,并提高患者遠期生存率。

艾迪注射液是提純人參、斑蝥、黃芪等中藥的抗腫瘤免疫活性物質制成的抗癌針劑,具有清熱解毒、消瘀散結之功[6]。既往研究發現,卵巢癌患者術后化療過程中,聯合使用艾迪注射液可起到減毒增效的作用[7]。網絡藥理學是利用算法及分析軟件,基于“藥物-靶點-疾病”互作網絡,多維層面觀察藥物對疾病的干預與影響,開啟中醫藥多靶標與疾病間復雜網絡關系的新研究[8]。因此,本研究擬采用網絡藥理學和細胞實驗對艾迪注射液治療卵巢癌的關鍵靶點及分子機制進行分析。

資料與方法

1.艾迪注射液活性成分篩選及靶點預測:利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)對人參、黃芪、斑蝥以生物利用度≥30%、類藥性≥0.18且藥物半衰期≥4h作為閾值進行篩選,得到艾迪注射液的藥物作用靶點。

2.卵巢癌相關靶點的篩選:通過癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數據庫下載并處理卵巢癌原始的mRNA表達數據。并從基因型-組織表達(Genotype-Tissue Expression,GTEx)數據庫中得到健康人類捐贈者的卵巢轉錄組表達數據。在R軟件中使用“limma”包以log2FC>2且Padj.<0.05為篩選條件獲得卵巢癌組和正常組之間差異表達的基因。

3.蛋白質互作網絡和藥物-化合物-靶點網絡的構建:在Venny 2.1.0平臺進行交集分析獲得艾迪注射液作用于卵巢癌的可能靶點,而后將交集基因錄入STRING平臺,得到蛋白質互作(protein protein interaction,PPI)網絡。

接著構建艾迪注射液藥物-化合物-靶點網絡,并采用Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化分析。

4.富集分析:使用R包“clusterprofiler”對交集基因進行基因本體論(gene ontology,GO)富集和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析。只有P和q值同時<0.05的GO和KEGG富集條目被認為是有意義的。

5.交集基因生存預后分析和表達情況研究:在GEPIA2數據庫中對交集基因進行生存預后分析,P<0.05視為與卵巢癌預后相關的核心靶基因,可能是艾迪注射液治療并延長卵巢癌患者生存期的重要靶點。并在人類蛋白圖譜(Human Protein Altas,HPA)數據庫中獲得核心靶基因在腫瘤組和正常組的免疫組化染色情況。

圖1 艾迪注射液作用于卵巢癌關鍵基因篩選

圖2 交集基因的PPI網絡圖和艾迪注射液-化合物-靶點網絡圖

圖3 交集基因的富集分析圖

圖4 艾迪注射液干預卵巢癌交集關鍵基因生存預后分析

圖5 艾迪注射液作用于卵巢癌關鍵預后基因免疫組化染色

圖6 艾迪注射液對卵巢癌細胞增殖及關鍵預后基因表達水平的影響

6.細胞培養:人卵巢癌細胞系SKOV3購自上海細胞生物學研究所。于DMEM(Dulbecco's modified eagle medium)培養基中加入10%的胎牛血清和1%的青霉素-鏈霉素后配成RPMI 1640培養基用于培養SKOV3。細胞培養于含5%二氧化碳,溫度37℃的培養箱中,每天更換1次培養基。取對數生長期細胞進行藥物處理。

7.藥物和試劑:艾迪注射液購自貴州益佰制藥股份有限公司。細胞計數試劑盒8(CCK-8)購自日本Gojindo公司。實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)試劑盒購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

8.CCK-8檢測艾迪注射液對SKOV3細胞增殖能力的影響:將SKOV3細胞消化成單細胞懸液后以5000個/孔的密度接種于96孔板中,種板24h后細胞貼壁,實驗組加入含有50mg/ml艾迪注射液的RPMI1640培養基,對照組加入等量培養基,繼續培養細胞24h和48h,每孔中加入配好的CCK-8檢測液(10μl),置于培養箱中孵育1h,最后用酶標儀測定450nm處的吸光度。

9.RT-qPCR分析艾迪注射液影響卵巢癌預后的基因表達水平:按Trizol Reagant說明書提取添加或不加艾迪注射液的RPMI1640培養基培養24h卵巢癌細胞的總RNA,并用紫外分光光度計定量并檢測純度,將1μg RNA反轉錄為cDNA并進行PCR擴增。目的基因和內參基因的引物序列詳見表1,以GAPDH作為內參,進行相對表達量的計算,每組重復3次,取平均值。

表1 目的基因和內參基因引物序列

結 果

1.卵巢癌靶點基因的篩選:整合TCGA和GTEx數據后得到卵巢癌基因表達矩陣,共篩選出610個差異基因(圖1A),其中上調基因277個,下調基因333個。圖1B為在腫瘤組和正常組組間差異表達最大的前20個基因的熱圖。

2.艾迪注射液作用于卵巢癌的可能靶點及網絡圖構建:通過TCSMP數據庫獲得人參、黃芪、斑蝥這3種中藥的有效成分及其作用的靶點共193個。將193個藥物靶點與610個疾病差異基因取交集,得到13個交集基因。接著將這13個交集基因導入STRING檢索PPI信息,得到PPI網絡圖(置信度>0.40,圖2A)。根據藥物有效成分、ID信息、篩選得到的交集基因,構建艾迪注射液-化合物-靶點網絡,借助Cytoscape進行網絡可視化分析(圖2B、表2)。

表2 艾迪注射液-化合物-靶點網絡詳細信息

3.富集分析結果:13個交集基因在R中富集分析篩選得到353條GO條目(圖3A)(P<0.05,q<0.05),涉及生物過程、細胞組成和分子功能的前10條通路呈現于圖3B。主要富集在氧化應激通路相關酶活性、細胞連接和染色體復制、營養物的代謝和傷口愈合等生物學過程。主要涉及到細胞凋亡、鉑耐藥、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、Toll樣受體(Toll-like receptor)和白細胞介素-17(interleukin-17,IL-17)等相關信號通路(圖3中C、D)。

4.生存分析結果:將13個靶基因輸入到GEPIA2平臺分析,發現3個基因對卵巢癌預后影響有統計學意義,分別為細胞間緊密連接蛋白4(claudin 4,CLDN4)、分泌性白細胞蛋白酶抑制因子(secretory leukocyte peptidase inhibitor,SLPI)和桿狀病毒IAP重復序列包含5(baculoviral IAP repeat containing 5,BIRC5)。其中,BIRC5為卵巢癌保護性因素,而CLDN4和SLPI是卵巢癌預后危險因素(圖4)。

5.艾迪注射液作用于卵巢癌關鍵基因免疫組化分析:在HPA數據庫中探究艾迪注射液干預卵巢癌的關鍵預后基因的差異表達情況。免疫組化染色結果表明,卵巢癌預后危險因素CLDN4和SLPI確實在腫瘤組中表達更高,在正常組中表達偏低,而卵巢癌保護性因素BIRC5則是正常組的表達比腫瘤組高(圖5)。

6.艾迪注射液對卵巢癌細胞增殖及關鍵預后基因表達水平的影響:進行CCK-8實驗研究艾迪注射液對SKOV3細胞的增殖抑制作用,圖6A可見對照組細胞24h增殖率約為100%,艾迪注射液50mg/ml處理24h組增殖率下降至66%,48h后對照組增殖率為164%,而實驗組增殖率繼續下降至50%。實驗組增殖率均低于對照組(P<0.01)。提示艾迪注射液對SKOV3細胞具有生長抑制作用,且隨作用時間延長,抑制作用愈加明顯。

在mRNA水平進一步研究艾迪注射液對卵巢癌預后關鍵基因表達水平的影響。由圖6B可以看出,艾迪注射液50mg/ml處理24h后卵巢癌危險因素SLPI和CLDN4的mRNA表達水平與對照組比較均有明顯降低,且艾迪注射液處理也使卵巢癌保護性因素BIRC5呈現大幅提高。

討 論

目前卵巢癌的一線化療方案為紫杉醇聯合鉑類藥物,但是化療帶來的不良反應及化療耐藥問題為卵巢癌患者的遠期生存帶來了極大的阻礙[9]。既往研究發現,中草藥的有效成分與化療藥物聯用能起到增效減毒的作用,這為卵巢癌的治療帶來了新希望[10]。艾迪注射液中含有人參、斑蝥、黃芪等多種中藥有效成分,其中人參皂苷Rg3已被證明能抑制腫瘤增殖、轉移和腫瘤血管生成,并調節T細胞功能,改善腫瘤免疫微環境[11,12];而斑蝥抗腫瘤的主要成分是斑蝥素,可顯著抑制腫瘤細胞的生長[13]。另外黃芪多糖作為一種補氣中藥,可阻滯細胞周期、減少活性氧自由基含量發揮抗癌活性[14]。艾迪注射液已被報道輔助治療卵巢癌時可以有效降低腫瘤標志物水平,改善免疫功能,減輕不良反應,療效確切[15,16]。

本研究通過TCMSP數據庫檢索艾迪注射液的活性成分并預測對應的靶點、構建網絡、富集分析和生存分析,挖掘艾迪注射液治療卵巢癌的作用靶點。本研究共篩選到卵巢癌相關基因610個,艾迪注射液作用基因靶點193個,進一步篩選到艾迪注射液作用于卵巢癌的交集靶點共13個,這些基因主要富集在凋亡增殖、鉑耐藥和IL-17相關信號通路中,與卵巢癌發生、發展以及化療耐藥密切相關,可能是艾迪注射液增效減毒卵巢癌治療的機制。生存分析進一步篩選后共發現3個艾迪注射液調控卵巢癌的預后關鍵基因,分別為CLDN4(P=0.014)、SLPI(P=0.008)和BIRC5(P=0.013),生存分析結果顯示,CLDN4和SLPI的低表達與患者更長的總生存期相關,而BIRC5的低表達與卵巢癌不良預后相關。此外,免疫組化染色分析結果顯示,CLDN4和SLPI在腫瘤組織中表達更高,在正常組中表達偏低,而BIRC5在正常組中的表達高于腫瘤組。

CLDN4是一種細胞緊密連接蛋白,在人卵巢癌中高度表達,研究發現,CLDN4可通過Wnt/β-catenin信號通路活化促進卵巢癌增殖和侵襲,并介導卵巢癌細胞對紫杉醇的耐藥[17～19]。分泌性白細胞蛋白酶抑制劑SLPI在卵巢癌細胞中過表達,與卵巢癌患者腫瘤分期相關[20]。而BIRC5是凋亡抑制因子基因家族的成員,編碼Survivin蛋白[21]。研究表明,NF-κB介導的Survivin表達可促進癌細胞對順鉑和紫杉醇的敏感度[22]。總之,根據免疫組化染色和生存分析結果顯示,CLDN4和SLPI為卵巢癌的預后危險因素,在卵巢癌中高表達,而BIRC5為保護性因素,在正常組織中表達較高,本研究結果與既往相關文獻研究結果吻合。

進一步使用艾迪注射液對卵巢癌細胞系SKOV3進行細胞層面研究。CCK-8實驗檢測結果顯示,艾迪注射液可顯著抑制卵巢癌細胞增殖能力,且隨著用藥時間的延長,抑制作用加強。而RT-qPCR檢測也證實艾迪注射液的使用可降低SLPI和CLDN4這兩個卵巢癌預后危險因子的表達,同時大幅提高卵巢癌保護性因素BIRC5的水平,從而實現抗腫瘤效果。因此,艾迪注射液可能通過調節這些關鍵基因的表達影響腫瘤相關信號通路,從而實現抗腫瘤作用,同時通過影響卵巢癌細胞對化療藥物的敏感度實現增強化療效果的作用。

綜上所述,本研究通過網絡藥理學手段,初步研究艾迪注射液在殺傷卵巢癌細胞的潛在靶點,可通過影響細胞增殖和影響化療耐藥性等方式實現多成分、多靶點、多途徑抗卵巢癌和聯合化療增效減毒的作用,為開展進一步實驗研究提供了良好的理論依據。然而,本研究主要基于數據庫分析開展,雖進行了部分細胞層面的驗證,但是具體的分子機制還需更深入的研究。未來需要進行更多細胞層面信號通路機制的探索,并在動物水平進行艾迪注射液藥代動力學的研究以及分子機制的驗證,為艾迪注射液在卵巢癌的臨床應用奠定了研究基礎。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。