血清miR-497-5p、FGF-2在阿爾茨海默病患者中的表達(dá)及相關(guān)性分析

李曉艷 徐宇浩 朱 穎 童 娟 李元媛 于 明

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病,以逐漸記憶力惡化和認(rèn)知功能下降為臨床特征[1]。隨著人口老齡化進(jìn)展,AD的發(fā)生率及病死率呈上升趨勢[2]。探索AD的診斷指標(biāo)對(duì)該疾病的診療尤為重要。微小RNA(microRNA,miRNA)是一種基因調(diào)控因子,可通過多種途徑調(diào)節(jié)AD的發(fā)生、發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn),miR-497-5p在Aβ1-42誘導(dǎo)后的微血管內(nèi)皮細(xì)胞高度表達(dá),通過促進(jìn)TJs相關(guān)蛋白表達(dá)而降低了血-腦脊液屏障通透性,可能參與了腦血管屏障對(duì)β淀粉樣蛋白(amyloid β-protein,Aβ)的清除作用[3]。另外,成纖維細(xì)胞生長因子-2(fibroblast growth factor-2,FGF-2)具有血管生成、有絲分裂和神經(jīng)營養(yǎng)作用[4]。研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)FGF-2預(yù)處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞可激活神經(jīng)配素-1依賴性谷氨酸能突觸的發(fā)生,從而抑制空間記憶力喪失[5]。然而,有關(guān)miR-497-5p、FGF-2和AD的研究多數(shù)局限于細(xì)胞及動(dòng)物層面。本研究從臨床角度出發(fā),觀察了miR-497-5p、FGF-2水平在不同程度AD患者血清中的變化及其對(duì)AD的診斷效能,以及兩者可能存在的相關(guān)性,現(xiàn)報(bào)道如下。

資料與方法

1.臨床資料:選取2020年10月～2022年6月就診于江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科的50例AD患者為AD組,納入標(biāo)準(zhǔn):①依據(jù)2011年美國國立衰老研究所(National Institute on Aging,NIA)和AD學(xué)會(huì)(Alzheimer′s Association,AA)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)(NIA-AA診斷標(biāo)準(zhǔn))[6];②簡易精神狀態(tài)量表(mini-mental state examination,MMSE)評(píng)定癡呆的標(biāo)準(zhǔn):文盲組≤17分,小學(xué)組≤20分,中學(xué)組≤22分,大學(xué)組≤24分;③頭顱磁共振提示雙側(cè)顳葉、海馬萎縮。排除標(biāo)準(zhǔn):①既往有腦血管疾病者;②有顱腦外傷者;③有中毒性、代謝性、精神性等腦病者;④診斷前進(jìn)行藥物治療者;⑤合并心臟、肝臟、腎臟、造血系統(tǒng)疾病者;⑥血管性及其他原因所致癡呆者;⑦有其他不宜入選者。另外,根據(jù)MMSE評(píng)分將AD患者分為:輕度AD組18例(21分≤MMSE評(píng)分≤26分)、中度AD組18例(10分≤MMSE評(píng)分≤20分)和重度AD組14例(MMSE評(píng)分≤9分)。同期選取在江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院行常規(guī)檢查的37例健康體檢者為對(duì)照組,其日常生活能力正常,神經(jīng)系統(tǒng)檢查無異常,MMSE評(píng)分在28分以上,直系親屬無癡呆家族史且均無重大軀體疾病。所有量表評(píng)估由神經(jīng)內(nèi)科主治及以上職稱醫(yī)師完成。記錄所有研究對(duì)象的年齡、性別、受教育程度、高血壓、糖尿病、高脂血癥、MMSE評(píng)分。入組的每位受試者及家屬對(duì)本研究均知情,并簽署知情同意書。本研究獲得江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審查批準(zhǔn)(倫理學(xué)審批號(hào):SWYXLL20210401-11)。

2.主要儀器與試劑:總RNA提取試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司; miRNA第1鏈cDNA合成購自山東思科捷生物技術(shù)有限公司;miRNA實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)試劑盒購自山東思科捷生物技術(shù)有限公司;人FGF-2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒購自上海威奧生物科技有限公司;高速低溫離心機(jī)購自美國Thermo Fisher公司;紫外分光光度儀購自美國Beckman公司;RT-qPCR儀購自美國Applied Biosystems公司;本研究中其他化學(xué)用品均采購自江蘇太倉滬試試劑有限公司。

3.方法

(1)標(biāo)本采集:采集受試者清晨空腹外周血3～5ml,將樣本靜止于4℃冰箱約1h,接著以3500r/min轉(zhuǎn)速,離心半徑10cm,離心10min分離出上層液體血清,分裝于無菌無酶EP管中,置于-80℃超低溫冰箱保存,待檢測。

(2)總RNA的提取和miR-497-5p定量檢測:取適量凍融后的血清樣本,采用Takara RNAiso Blood提取血清中RNA,用紫外分光光度儀檢測RNA的濃度和純度,依據(jù)試劑盒說明書將提取出的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,依據(jù)2×miRNA SYBR Green qPCR Mix(By stem-loop)說明書進(jìn)行RT-qPCR檢測,設(shè)置反應(yīng)體系為10μl,反應(yīng)條件為94℃ 3min,94℃ 20s,51.7℃ 30s,72℃ 30s,共循環(huán)40次,以U6作為內(nèi)參基因,采用法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

(3)引物設(shè)計(jì)及合成:引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司,采用莖環(huán)法合成引物。引物序列如下:miR-497-5p:上游引物:5′ -AACGATACAGCA-GCACACTGT-3′,下游引物:5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGT-CCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAAC-3′;U6:上游引物:5′-GCTCGCTTCGGCAGCACATATAC-3′,下游引物:5′-CG-AATTTGCGTGTCATCCTTGCG-3′。

(4)血清FGF-2水平檢測:按照人FGF-2 ELISA試劑盒的使用說明書操作。

結(jié) 果

1.對(duì)照組與不同程度AD組一般資料比較:對(duì)照組、輕度、中度和重度AD組的年齡、性別、受教育水平、高血壓、糖尿病和高脂血癥比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);不同程度AD組MMSE評(píng)分均顯著低于對(duì)照組(P<0.001),AD各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),詳見表1。

表1 對(duì)照組與不同程度AD組的一般資料比較

2.各組血清miR-497-5p、FGF-2水平比較:與對(duì)照組和輕度AD組比較,中度、重度AD組血清miR-497-5p水平均升高(P<0.01),中度、重度AD組FGF-2水平均降低(P<0.01);對(duì)照組與輕度AD組血清miR-497-5p和FGF-2水平比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);中度和重度AD組血清miR-497-5p和FGF-2水平比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),詳見表2。

表2 各組血清miR-497-5p和FGF-2水平比較

3.血清miR-497-5p表達(dá)水平與MMSE評(píng)分相關(guān)性分析:Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,血清miR-497-5p相對(duì)表達(dá)量與MMSE評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.724,P<0.01),由以下散點(diǎn)圖可見,在AD患者中MMSE評(píng)分越低,miR-497-5p表達(dá)越高,詳見圖1。

圖1 血清miR-497-5p相對(duì)表達(dá)量與MMSE評(píng)分的相關(guān)性分析

4.miR-497-5p與FGF-2相關(guān)性分析:經(jīng)miRTarBase數(shù)據(jù)庫檢索,miR-497-5p與FGF-2可能存在靶向關(guān)系,詳見表3。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,AD組血清miR-497-5p相對(duì)表達(dá)量與FGF-2水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.748,P<0.01),詳見圖2。

圖2 血清miR-497-5p與FGF-2相關(guān)性分析

表3 miRTarBase預(yù)測miR-497與FGF-2的靶向相互作用

5.各組之間血清miR-497-5p、FGF-2及兩者聯(lián)合對(duì)AD診斷價(jià)值和不同程度AD鑒別效能評(píng)估:miR-497-5p、FGF-2對(duì)中度AD和重度AD具有診斷價(jià)值,曲線下面積(area under the curve, AUC)分別為0.794、0.849、0.782、0.830;對(duì)輕度AD和中度AD、輕度AD和重度AD的鑒別具有效能,AUC分別為0.847、0.881、0.777、0.845;miR-497-5p和FGF-2聯(lián)合指標(biāo)對(duì)中度AD和重度AD具有診斷價(jià)值,AUC分別為0.861、0.922,對(duì)輕度AD和中度AD、輕度AD和重度AD的鑒別具有效能,AUC分別為0.879、0.944,詳見表4。

表4 各組之間血清miR-497-5p、FGF-2及兩者聯(lián)合對(duì)AD診斷價(jià)值和不同程度AD鑒別效能評(píng)估

討 論

AD的發(fā)病機(jī)制仍未闡明,尋找AD相關(guān)標(biāo)志物,且盡早預(yù)測其發(fā)展尤為重要。miR-497-5p可通過調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡介導(dǎo)神經(jīng)發(fā)育和重塑等過程,在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中被大量研究[7, 8]。Li等[9]研究發(fā)現(xiàn),miR-497-5p在抑郁癥小鼠中表達(dá)上調(diào),可能與負(fù)性調(diào)控腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)有關(guān),產(chǎn)生影響記憶相關(guān)信號(hào)系統(tǒng)的作用。此外,Chen等[10]研究發(fā)現(xiàn),LINC00641

上調(diào)可通過抑制miR-497-5p激活TrkB/PI3K/Akt通路,間接促進(jìn)BDNF蛋白表達(dá)。Zhu等[11]研究顯示,miR-497-5p在1-甲基-4-苯基吡啶(1-methyl-4-phenylpyridiniumion,MMP)誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞及小鼠中高表達(dá),通過靶向FGF-2調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡和自噬。本研究中筆者首次以AD患者為研究對(duì)象,從臨床水平關(guān)注了AD患者血清miR-497-5p的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)了中重度AD患者血清miR-497-5p表達(dá)水平明顯升高,提示血清miR-497-5p增加參與AD的發(fā)展。

FGF-2是成纖維細(xì)胞因子家族成員之一,在多種生物活性的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用[12]。在AD小鼠海馬中,FGF-2水平的增加有利于細(xì)胞分裂和巢蛋白水平,可降低成熟海馬細(xì)胞的神經(jīng)元譜系標(biāo)志物的水平[13]。FGF-2還存在抗炎和抗淀粉樣變性作用,可能與FGF-2促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)Aβ吞噬作用有關(guān)[14]。本研究同樣關(guān)注了AD患者血清FGF-2表達(dá)情況,結(jié)果顯示,中重度AD患者血清FGF-2呈低表達(dá)。大量研究發(fā)現(xiàn),FGF-2可促進(jìn)海馬神經(jīng)生成,并且在不利的條件下有著神經(jīng)保護(hù)作用[15～18]。本研究也與這些研究結(jié)論具有一致性,提示FGF-2降低與AD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

為了進(jìn)一步評(píng)估m(xù)iR-497-5p與AD認(rèn)知功能的相關(guān)性,本研究對(duì)miR-497-5p與MMSE評(píng)分進(jìn)行相關(guān)分析,兩者較高的相關(guān)系數(shù)也表明miR-497-5p對(duì)AD患者病情嚴(yán)重程度評(píng)估有一定的提示作用。另外,本研究發(fā)現(xiàn),對(duì)照組與中度、重度AD組血清miR-497-5p、FGF-2水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而與輕度AD組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示miR-497-5p和FGF-2可能在中重度AD中更具有重要的潛在調(diào)控和干預(yù)價(jià)值。本研究還發(fā)現(xiàn),與輕度AD患者比較,中度、重度AD組血清miR-497-5p、FGF-2水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而在中度和重度AD患者中,血清miR-497-5p和FGF-2水平比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這可能與AD的病程存在一定的關(guān)聯(lián)。

多項(xiàng)研究證實(shí)了miR-497-5p與FGF2之間存在對(duì)應(yīng)關(guān)系。在非小細(xì)胞肺癌中,miR-497-5p表達(dá)下調(diào),并通過影響FGF-2表達(dá)調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和侵襲[19]。在抑郁癥小鼠中,miR-497通過靶向FGF-2加重小鼠中的海馬膠質(zhì)細(xì)胞活化,從而促進(jìn)炎癥相關(guān)因子的產(chǎn)生[20]。不僅如此,本研究通過miRTarBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測也顯示miR-497-5p與FGF-2存在結(jié)合位點(diǎn)。本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示,血清FGF-2與miR-497-5p呈負(fù)相關(guān),提示兩者可能存在某種關(guān)系共同參與了AD的發(fā)生和發(fā)展,其作用機(jī)制也需后期進(jìn)行基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。此外,ROC曲線分析結(jié)果顯示,血清miR-497-5p和血清FGF-2水平對(duì)中重度AD疾病均有一定的診斷價(jià)值,兩者聯(lián)合診斷效能更高;進(jìn)一步分析顯示,聯(lián)合指標(biāo)診斷中度、重度AD的效能更高,而診斷輕度AD效能無顯著差異,表明在一定程度上可判斷疾病的進(jìn)展程度。聯(lián)合指標(biāo)鑒別輕度與中度、重度AD的效能較高,而鑒別中、重度AD的效能差異不明顯,也為評(píng)估AD發(fā)展提供了一定的參考。

綜上所述,miR-497-5p和FGF-2在中重度AD患者中存在差異表達(dá),兩者對(duì)中重度AD具有一定的診斷價(jià)值。本研究仍有一些不足,比如研究樣本量較小,并未對(duì)AD患者的血清miR-497-5p和FGF-2進(jìn)行隨訪觀察。兩者之間可能存在的作用機(jī)制以及在AD不同病情程度中的特征性變化,仍需在細(xì)胞及動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探討。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。