人血清涎液化糖鏈抗原磁微粒化學發光免疫分析方法的建立及對肺癌的診斷價值

張少華，杜文水

1 南京華銀醫學檢驗所 （江蘇南京 211100）； 2 徐州市銅山區中醫院 （江蘇徐州221116）

肺Ⅱ型上皮細胞能夠分泌一種特殊的涎液化糖鏈抗原（sialylated carbohydrate antigen，KL-6），KL-6 是一類相對分子質量接近200 kDa 的糖蛋白[1]。Peng 等[2]研究表明，機體內的KL-6 主要由肺泡Ⅱ型上皮細胞分泌，肺泡Ⅱ型上皮細胞出現增殖、受激發等可引發肺泡細胞受損 ，因此，可以推斷KL-6 水平與肺泡損傷直接相關，可作為臨床評價肺部疾病的重要指標之一[3-8]。血清腫瘤標志物是目前臨床開展最為廣泛、最簡便的腫瘤各期的篩查指標，其中肺癌神經元特異度烯醇化酶（neuron specific eno1ase，NSE）、鱗狀上皮細胞癌抗原（squamous cell carcinoma，SCC）、細胞角蛋白19（cytokeratin-19-fragment，CYFRA21-1） 及 血 清癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）等為用于肺癌篩查的常用指標。但上述指標對肺癌診斷的特異度、靈敏度欠佳，故對肺癌的診斷不具有特異性?；诖?，本研究以磁微粒化學發光免疫術作為技術支撐，建立血清KL-6 的檢測方法，旨在探討其在肺癌中的診斷價值，并與NSE、SCC、CEA、CYFRA21-1 進行聯合檢測，以期為肺癌的診斷提供靈敏度指標，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2023 年1—5 月徐州市銅山區中醫院收治的85 例肺癌患者為試驗組，其中男44 例，女41 例；年齡19～70 歲，中位年齡38（31，46）歲。對照組為隨機選取同期體檢中心接受健康體檢的健康人群85 名，其中男40 名，女45 名；年齡19～70 歲，中位年齡38（31，46）歲。試驗組納入標準：均經手術、穿刺活檢等組織病理學檢查結果確診為肺癌；均行CT 和高分辨率CT 掃描；未伴隨其他惡性腫瘤；臨床資料和影像資料完整。試驗組排除標準：有既往放化療史；伴有其他肺部疾病。本研究經徐州市銅山區中醫院醫學倫理委員會審批通過（倫理審批號：202301304）均于檢查前簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑

受檢者入組時剔除溶血、黃疸、脂血等標本，采集空腹靜脈血，置入4 ℃ 冰箱中恒溫保存。KL-6 抗體-ALP、KL-6 抗體-磁性顆粒、重組KL-6 抗原均購自天津（梅迪賽斯）生物科技有限公司。采用磁微粒全自動化學發光免疫分析儀（天津博奧賽斯公司，Axceed 260 型）檢測 NSE、SCC、CEA、CYFRA21-1 水平，檢測方法為化學發光免疫法，所用試劑為Axceed 260 型檢測儀配套試劑，檢測過程嚴格依據說明書。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 精密度檢測

依據美國臨床實驗室標準化協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）所制定臨床評價方案5（evaluation protocols 5，EP 5）標準指南[9]文件進行精密度實驗，選取高值和低值質控品和4 個濃度不同的血清樣本，在同一實驗內重復測定2 次，間隔2 h 以上記錄數據。同時根據EP5 中的A3 文件標準計算重復性（SR）、實驗室精密度（SWL）。

1.3.2 檢測范圍線性驗證

參照EP 6指南[10]，選取線性范圍（50～10 000 U/ml）內患者的低值樣本和高值樣本，配制11 組梯度樣本，重復測定2 次。已達到設定要求條件基礎上以多項式回歸分析計算重復性，分別完成一次多項式擬合、二次多項式擬合、三次多項式擬合。KL-6 檢測可接受線性允許誤差關系范圍為8.0%，可接受重復性設定范圍≤6.0%。

1.3.3 檢測限

參照EP17[11]標準指南文件確定KL-6 的空白限LoB）：空白樣本測定結果第95 百分位數秩號對應濃度結果為LoB），檢出限LoD：濃度范圍LoB 值1～5 倍范圍內的低濃度樣本，第50 百分位數秩號對應的濃度為LoD），每天重復測定4 次，連續測定3 d，低濃度樣本結果確保低于LoB 的百分比＜5%。選用2 批不同批次試劑進行實驗測定并計算LoB、LoD，比較2 批試劑計算結果，較大值為最終LoB、LoD 值。

1.3.4 評價標準

NSE＞15.2 ng/ml 為陽性[5]、SCC＞1.7 ng/ml 為陽性[6]、CEA＞5.0 ng/ml 為陽性[7]、CYFRA21-1＞3.3 ng/ml 為陽性[8]、KL-6 ≥500 U/ml 為陽性[9]。

1.4 統計學處理

采用SPSS 22.0 統計軟件進行數據分析。計量資料以±s表示，采用t檢驗。計數資料以率表示，采用χ2檢驗。診斷效能評價使用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，計算曲線下面積（area under curve，AUC），根據AUC結果評價血清標志物檢測診斷的靈敏度和特異度。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 KL-6 精密度測定結果

不同濃度精密度檢測結果均值、SD、SR、SWL見表1。本產品的重復性變異系數（CV%）＜6.0%（2.4%～3.3%），實驗室內精密度CV%＜8.0%（4.3%～6.0%）。

表1 KL-6 精密度測定結果

2.2 KL-6 檢測線性范圍

線性范圍結果見表2，SDr為2.6%，＜實驗室設定允許范圍5%。多項式回歸分析顯示，二次多項式非線性系數與三次多項式的非線性系數與一次擬合系數比較，差異無統計學意義（P＞0.05），說明預期值與測量值間相關性良好，相關系數r=0.996。磁微粒化學發光法檢測KL-6 在50～10 000 U/ml 范圍內成良好的線性，經計算KL-6 檢測限指標LoB為20 U/ml，LoD 為50 U/ml。

圖1 KL-6 梯度濃度預測值與實測值的線性分析圖

表2 KL-6 線性范圍檢測結果

2.3 KL-6 在肺癌診斷中的應用

2.3.1 試驗組和對照組血清KL-6、NSE、SCC、CEA、CYFRA21-1 水平比較

試驗組血清KL-6、NSE、CEA、CYFRA21-1 水平高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；試驗組SCC 水平與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 試驗組和對照組血清KL-6、NSE、SCC、CEA、CYFRA21-1 水平比較 （±s）

表3 試驗組和對照組血清KL-6、NSE、SCC、CEA、CYFRA21-1 水平比較 （±s）

注：KL-6 為涎液化糖鏈抗原，NSE 為神經元特異度烯醇化酶，SCC 為鱗狀上皮細胞癌抗原，CEA 為血清癌胚抗原，CYFRA21-1 為細胞角蛋白19

CYFRA21-1（ng/ml）試驗組85 例 2463.55±522.49 25.83±8.81 1.01±0.45 101.03±16.82 3.82±3.57對照組85 名 209.75±117.05 10.44±3.92 0.93±0.39 2.57±0.49 1.85±0.95 t 38.810 14.710 1.240 53.950 4.979 P 0.000 0.000 0.217 0.000 0.000組別 人數 KL-6（U/ml）NSE（ng/ml）SCC（ng/ml）CEA（ng/ml）

2.3.2 腫瘤標志物單項檢測與聯合檢測對肺癌患者的診斷效能比較

血 清KL-6、NSE、SCC、CEA、CYFRA21-1 腫瘤標志物單項檢測與聯合檢測對肺癌患者的診斷效能分析結果比較，ROC 曲線分析顯示，5 項腫瘤標志物聯合診斷肺癌的靈敏度為98.80%，特異度為97.60%，AUC為0.997，其靈敏度和AUC均分別高于5 項指標單一檢測，見表4 和圖2。KL-6、NSE、SCC、CEA、CYFRA21-1 5 項指標所形成的鑒別診斷體系診斷肺癌的AUC為0.997（95%CI：0.992～1.000，P＜0.01），最大約登指數為0.964，靈敏度為98.8%，特異度為97.6%，具有一定診斷價值。

圖2 5 項血清腫瘤標志物單項及其聯合檢測診斷肺癌的ROC 曲線

表4 腫瘤標志物單項檢測與聯合檢測對肺癌患者的診斷效能比較

3 討論

血清腫瘤標志物檢查在肺癌早期篩查中具有重要的參考預警價值，且能為其分期診斷提供重要參考價值。雖然單項血清腫瘤標志物檢查簡便、價格低，但診斷靈敏度和特異度欠佳。雖然多項腫瘤標志物聯合檢測價格相對較貴，但檢測效能優于B 超、CT 或磁共振等影像學檢查，且診斷時間早，尤其對早期微灶腫瘤，多項腫瘤標志物聯合檢測能至少提前半年以上發現，為肺癌的臨床超早期診斷、治療爭取了寶貴的時間。近年來有研究表明，KL-6 血清學水平的高低與肺纖維化患者病情嚴重程度有較高的相關性，常作為肺纖維化病情評估、預后評價的生物學指標[12]，但其與肺癌的相關研究報道較少。本研究參考CLSI 指南標準建立KL-6 檢測精密度評價，確定KL-6 檢測的線性范圍和參考區間，結果顯示，KL-6 的LoB 為20 U/ml、最低檢出限LoD 為50 U/ml，該方法精密度良好，達到精密度質量規范，在檢測范圍50～10 000 U/ml 內成線性。該方法的精密性、檢測能力及線性范圍等均較為準確，符合臨床診斷需求，可以作為臨床診斷指標。

為了進一步探討KL-6 在肺癌診斷中的價值，本研究對KL-6 單一檢測和與其他指標聯合檢測進行價值分析，發現KL-6 單一指標檢測肺癌的靈敏度為80%，特異度為76.5%，AUC為0.838，其靈敏度、特異度和AUC均高于其他3 項指標NSE、SCC、CYFRA21-1， 說 明KL-6 對 肺 癌 臨床輔助診斷價值較高。 血清KL-6、NSE、SCC、CEA、CYFRA21-1 腫瘤標志物聯合檢測對肺癌患者的診斷效能分析結果顯示，聯合檢測AUC為0.997（95%CI：0.992～1.000，P＜0.01），最 大 約登指數0.964，靈敏度為98.8%，特異度為97.6%，具有極高診斷價值。

綜上所述，基于磁微粒全自動化學發光免疫技術建立的血清KL-6 檢測方法，符合CLSI 的EP5標準指南文件制定的相關性能指標參數，可作為臨床實驗室KL-6 的檢測方法與試劑。KL-6 單一診斷肺癌的價值雖較高，但聯合檢測血清KL-6、NSE、SCC、CEA、CYFRA21-1 的診斷靈敏度為98.8%，特異度為97.6%，對于明確診斷肺癌具有較高的臨床應用價值。