新型生物標志物在良惡性胸腔積液鑒別診斷中的研究進展

李紫薇 曹曉紅

胸腔積液(pleural effusion,PE)是由于胸膜腔內液體過度產生或重吸收機制破壞所導致的一種臨床疾病[1],是呼吸科的常見病之一。PE根據病因不同通常分為惡性胸腔積液(malignant pleural effusion, MPE)和良性胸腔積液(benign pleural effusion,BPE)。MPE是由起源于胸膜的惡性腫瘤或惡性腫瘤從其他位置轉移到胸膜引起的,約占所有胸腔積液的15%～30%。一旦確診為MPE,患者生活質量將嚴重下降,且其初始診斷后患者的總生存期僅為3-12個月[2]。因此,需要盡早、準確地鑒別良惡性胸腔積液的性質,使患者得到對癥對因治療,改善生活質量。目前強調,在胸腔積液細胞沉淀中找到惡性細胞或在胸膜活檢組織中觀察到惡性腫瘤的病理改變是確定MPE診斷的金標準[3]。但胸水中找瘤細胞敏感度不高,僅為57.4%,臨床實踐中經常對胸水多次檢驗后仍不能發現癌細胞。因此,生物標志物的評估可被視為 MPE診斷中客觀且無創的診斷替代方案。既往已有研究表明傳統生物標志物在惡性胸腔積液診斷中具有重要價值。癌胚抗原(CEA)[4]是最具代表性的生物標志物,在MPE初期即可以被檢測到, 含量也相對較高;糖蛋白抗原19-9(CA19-9)是一種糖蛋白抗原, 主要從癌細胞株分離而來, 當機體發生癌變時, 會導致血清及胸腔積液中的CA19-9的水平明顯上升;細胞角蛋白片段21-1(CYFRA21-1)[5]多意味著是由上皮來源的腫瘤細胞轉移所致,其與腫瘤大小、淋巴結狀態和疾病分期有關;在一項Meta分析中[6],分別研究了CEA、CA19-9和CYFRA 21-1對肺腺癌相關MPE的診斷準確性。其中CEA曲線下面積(area under the curve,AUC)最高,為0.93,其敏感度為0.75,特異度為0.96;CA19-9的敏感度為0.58,特異度為0.84;CYFRA 21-1的敏感度為0.70,特異度為0.88。血管內皮生長因子(VEGF)是一種糖蛋白,作為血管生成的啟動子,在MPE形成中起重要作用。一項Meta分析發現依據胸腔積液VEGF濃度診斷MPE的敏感度和特異度分別為0.75和0.72[7]。不足的是,傳統生物標志物的特異度雖相對較高,但是總體敏感度還不能滿足當前臨床診斷的要求。且值得注意的是,幾乎所有的薈萃分析都強調了發表偏倚的存在,這表明這些傳統生物標志物的診斷準確性可能被高估了。因此,本綜述在此探討一些胸腔積液中具有潛在診斷價值且有應用前景的新型生物標志物,為臨床醫生提供參考。

一、蛋白質類生物標志物

1. 鈣衛蛋白(Calprotectin,S100A8/S100A9)

鈣衛蛋白[8]是由中性粒細胞衍生的警衛蛋白(S100A8與S100A9蛋白)結合形成的的異二聚體蛋白,其在糞便、唾液、羊水、乳汁等體液中均有不同程度分布,與炎性反應和腫瘤免疫相關。其與炎癥的關系是明確的,它來源于中性粒細胞和巨噬細胞,具有促炎作用。其中糞便鈣衛蛋白已經成為一種經過驗證的非侵入性生物標志物,常被用來區分腸道炎癥和非炎癥性疾病[9]。所以在炎性和結核性胸腔積液中鈣衛蛋白水平相對偏高。其也與腫瘤免疫相關,有研究表明[10],較低水平(<20ug/mL)的鈣衛蛋白似乎可以促進腫瘤細胞的增殖,而較高水平的鈣衛蛋白可抑制腫瘤細胞增長,介導腫瘤細胞凋亡。一些研究報道,鈣衛蛋白與不同癌癥的預后有關,如前列腺癌[11]和腎癌[12]。Sánchez-Otero 等人[13]測定了156例診斷為滲出性PE(67例惡性PE和89例良性PE)患者的鈣衛蛋白濃度,該研究顯示,鈣衛蛋白在惡性胸腔積液中顯著降低,具有較高的診斷價值,其中AUC為0.963。其建立了兩個截點：當截斷值為545ng/mL時達到最大的準確性,其敏感度和特異度分別為97.01%和88.76%;當截斷值為736.4ng/mL時可達到100%的敏感度,但這使得特異度下降至83.15%。Maribel Botana-Rial[14]等人的多變量分析實驗也證實了此結論,其診斷敏感度為96%,特異度為60%,陰性和陽性的預測值分別為96%,57%,陰性和陽性的似然比分別為0.06和2.4。由此可以看出,測量胸腔積液中鈣衛蛋白含量可作為MPE鑒別診斷的一種可能的無創策略,它可能是細胞學方法的一個很好的補充,在臨床實踐中具有潛在的應用價值。

2. 載脂蛋白E(Apolipoprotein E,Apo-E)

Apo-E[15]是控制膽固醇運輸和代謝的重要血漿脂蛋白,動脈粥樣硬化和阿爾茨海默病等疾病都與Apo-E的功能異常相關。隨著蛋白質組學高通量技術的發展,Apo-E的過表達已被證明與某些惡性腫瘤有關,它可以作為一種自分泌或旁分泌生長因子來影響微環境,從而有助于癌變。在人類肺癌中,癌組織中Apo-E基因表達和蛋白表達水平明顯高于鄰近非癌組織[16],Apo-E過表達在胃癌、前列腺癌、甲狀腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌和膠質母細胞瘤中也已有報道。Tyan[17]等人利用蛋白質組學技術鑒定出Apo-E是肺腺癌患者胸腔積液中獨特的蛋白之一,Apo-E在MPE相關的肺腺癌中表達頻率高于肺鱗狀細胞癌。而且,Apo-E過表達可能促進MPE患者的癌細胞增殖和遷移,并導致侵襲性臨床過程。Wang等人發現[18],在以105ng/mL為臨界值時,Apo-E診斷MPE的敏感性和特異性分別為87.5%和85.3%,AUC為0.748。不足的是,此研究中所有MPE患者均為非小細胞肺癌,Apo-E對其他病因的MPE患者是否具有類似的診斷準確性仍有待進一步研究。

3. 幾丁質酶樣蛋白(Chitinase-like proteins,CLPs)

CLPs在很多肺部和心血管疾病如哮喘、慢性阻塞性肺疾病[19]和心力衰竭中起著關鍵作用,其中甲殼質酶蛋白(YKL-40)是研究最多的CLPs。YKL-40是一種由巨噬細胞在炎癥和惡性腫瘤環境中分泌的生物標志物,它是人骨肉瘤細胞體外分泌的一種糖蛋白,該糖蛋白在快速增殖和分化的組織中高度表達[20]。其在漿液性上皮性卵巢癌及子宮內膜癌診斷中具有較高價值,且與卵巢癌、膠質母細胞瘤的不良預后有關[21-24]。Javath H.S.[25]等人對147例胸腔積液患者的YKL-40進行了評價,他們發現惡性胸腔積液中YKL-40水平明顯升高,以99.76ng/mL為臨界值時,YKL-40診斷惡性胸腔積液的敏感度為83%,特異度為87%。但目前利用YKL-40檢測惡性胸膜積液的研究很少,對于這種標志物在惡性胸腔積液診斷中的應用還不能得出明確的結論,還需要更大樣本量的進一步研究。

4. B7家族 (B7 family)

既往研究發現,B7家族經常在腫瘤相關內皮細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞中過表達,且與癌癥進展密切相關。它們還在細胞入侵和遷移、血管生成和表觀遺傳基因調控方面加速癌癥進展。其中,B7-H3與B7-H4已經被證明是各種類型癌癥的診斷標志,在胰腺癌、結直腸癌的臨床診斷中具有較高價值[26, 27]。Chen[28]等人研究了52個非小細胞源性MPE和47個BPE中的B7-H3值,他們的中位值分別為41.60ng/mL和31.55ng/mL。當臨界值為38.41 ng/mL時,B7-H3能夠最大程度區分NSLCLC來源的MPE和BPE,敏感度為67.3%,特異度為91.5%。他們還發現在區分NSCLC來源的MPE和良性胸腔積液方面B7-H3與CEA和CYFRA21-1具有同等的診斷效果,且其表達水平與淋巴結轉移、肺癌分化程度、TNM分期相關。Xu[29]等人搜集了98例惡性胸腔積液肺癌患者和60例良性胸腔積液患者的胸腔積液樣本,發現惡性胸腔積液組B7-H4濃度明顯高于良性胸腔積液組,當B7-H4的臨界值為35.8 ng/mL,其敏感度為78.6%,特異度為91.7%,準確度為83.5%,陽性預測值為93.9%,陰性預測值為72.4%。這表明B7-H3與B7-H4在惡性和非惡性胸腔積液的鑒別診斷中是一個有價值的生物標志物。但國內對此研究還比較少,需要更多大規模的前瞻性研究來證實這一發現。

二、DNA甲基化(DNA methylation)

DNA甲基化[30]是指由DNA甲基轉移酶催化S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體,將胞嘧啶轉變為5-甲基胞嘧啶的反應。目前DNA甲基化已逐漸被認為是腫瘤的潛在生物標志物,已有研究報道在不同的腫瘤患者的體液分泌物中可以觀察到異常DNA甲基化,例如肺癌患者的痰、膀胱癌患者的尿液和結腸癌患者的糞便等[31, 32]。其中RAS相關結構域家族1A(RASSF1A)和矮小同源盒基因2(SHOX2)等基因的異常甲基化是最有希望用于癌癥診斷的新型生物標志物,且已經在多種樣本類型中進行了研究,包括支氣管肺泡灌洗液、福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織。Shi等人基于FFPE樣本,發現SHOX2和RASSF1A甲基化在小細胞肺癌、肺鱗癌和肺腺癌中的陽性檢出率分別為100%、96.1%和82.9%[33]。而來自PE上清液的游離DNA(PE-cfDNA)被報道為一種高質量的分子檢測標本,其易得且受脫落細胞數量的影響較小。Zhang[34]等人納入104例PE患者,利用PE-cfDNA標本,通過實時PCR評估SHOX2和RASSF1A甲基化的診斷價值。他們發現MPE樣品中SHOX2和RASSF1A的甲基化狀態遠高于良性對照,繪制ROC曲線評價SHOX2和RASSF1A DNA甲基化對PE的診斷能力,SHOX2的AUC值為0.959,RASSF1A的AUC值為0.810,兩者聯合分析的AUC值為0.985。基于計算的最佳截斷值(ΔCt SHOX2 10.0和ΔCt RASSF1A 13.0),其聯合檢測診斷敏感度和特異度分別為96%和100%。由此可見,SHOX2和RASSF1A基因甲基化的聯合檢測可以被認為是篩選和監測惡性胸腔積液的優良方法,具有較高的敏感性和特異性。但在他們的隊列中,MPE主要是腺癌衍生的,SHOX2和RASSF1A的甲基化陽性率在特定的疾病亞型中是否存在差異還需要進一步探索。

三、腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)

根據不同的生理條件,巨噬細胞可以極化為經典激活(M1)表型和交替激活(M2)表型。M1巨噬細胞表達的CD86、CD80、HLA-DR通過分泌促炎癥因子促進T輔助細胞1型(Th1)反應,而M2巨噬細胞通過表達CD14、CD136、CD206等,促進T輔助細胞2型(Th2)反應,可促進腫瘤生長、轉移和血管生成,支持腫瘤發展,通常被稱為TAMs。其中CD163+CD14+TAMs及CD206+CD14+TAMs被認為是診斷腫瘤很有前景的生物標志物,在MPE診斷中具有較高的敏感性和特異性。

1. CD163+CD14+TAMs

CD163+CD14+TAMs在很多研究中已被證明是腫瘤微環境的標志,在不同類型癌癥中高表達。在肺組織切片中,CD163+CD14+TAMs的數量在惡性病變中高于良性病變,并與腫瘤的組織學分級有關[35]。膀胱癌微環境中CD163+CD14+TAMs也被證明異常升高[36]。Wang[37]等人用流式細胞術檢測34例MPE和26例良性胸腔積液中CD206+CD14+TAMs的百分比,以是否含有CD163+CD14+ TAMs作為標準,其鑒別良惡性胸腔積液敏感度為78.9%,特異度為100%。當他們使用3.65%為臨界值時,CD163+CD14+TAMs診斷MPE的敏感度為81.2%,特異度為100%。且值得注意的是,通過檢測PE中CD163+CD14+TAMs鑒別胸腔積液可比細胞學檢查提前一周得到MPE診斷,其檢測靈敏度優于胸水中找瘤細胞。由此可見,CD163+CD14+TAMs有可能作為MPE的免疫診斷標志物,并且比細胞學分析具有更好的檢測靈敏度。

2. CD206+CD14+TAMs

已有研究表明,CD206+CD14+TAMs可作為癌癥的標志,在卵巢癌、結直腸癌患者標本[38, 39]中高表達。Pei[40]等人應用流式細胞術檢測34例MPE和26例良性胸腔積液中CD206+CD14+TAMs的百分比發現,MPE中CD206+CD14+TAMs百分比明顯高于良性胸腔積液,當臨界值為39.8%時,其診斷敏感度為88.2%,特異度為100.0%。他們的研究也有局限性,首先,此研究納入的樣本量相對較小,需要更大的種群來確認這種方法的價值。第二,該研究分析的MPE均來源于肺癌,其他惡性疾病引起的胸腔積液未被分析,所以CD206+CD14+巨噬細胞對MPE的診斷價值需要更大規模的前瞻性研究。

四、小結與展望

MPE往往代表預后不良的晚期惡性疾病,其診斷仍是臨床一個具有挑戰性的問題。生物標志物的評估可被視為MPE診斷中客觀且無創的診斷方案,但既往研究的傳統生物標志物敏感度不足,本綜述在此探討了一些具有潛在診斷價值的新型生物標志物。相對來說,新型標志物可提高MPE診斷的敏感度和特異度,但因技術和費用等原因,國內對此研究仍較少,其臨床價值、可行性和準確度有待商榷,需進一步組織大樣本、前瞻性、多中心研究來評價其診斷價值。