不同質量等級醬香白酒中風味物質及差異性分析

王金龍，尹延順，田棟偉，胡建鋒，程平言*

（貴州習酒股份有限公司，貴州 遵義 564622）

醬香型白酒工藝較為復雜，因其涵蓋了一至七輪次基酒的層次風格特征，呈現出醬香突出，酒體醇厚，幽雅細膩，回味悠長等風味特征而受到廣大消費者的喜愛[1-3]。在醬酒利潤驅使下，一些假冒偽劣事件在市場上時有發生，給醬酒行業帶來不良的影響[4]。當前，大多白酒企業在酒體質量等級鑒別及出廠保障方面主要依賴感官品評[5-7]，部分企業增加了理化和色譜指標作為參考，但也僅是對酒體食品安全范疇進行把關[8]，對其他風味物質組成和香味貢獻的掌握不夠全面完整，造成酒樣批次穩定性以及質量鑒定結果存在爭議。因此，迫切需要對酒體進行全面剖析以保障企業酒體質量的合格率以及產品的穩定。

隨著各種檢測技術的不斷發展，氣相色譜法（gas chromatography，GC）[9-10]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[11]、氣相色譜質譜聯用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[12-14]、電感耦合等離子質譜法（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）[15]等儀器相繼被應用到白酒檢測分析中，目前，已有報道在白酒中檢測出的風味化合物超過2 000余種，而醬香型白酒成分較其他香型更為復雜[16]。因此，在復雜的風味體系中如何找到有效的分析方法來揭示風味特征物質、篩選關鍵標記物及找出酒體之間的差異才是亟待解決的主要問題。

化學計量學方法如主成分分析（principal component analysis，PCA）、聚類分析（cluster analysis，CA）與偏最小二乘-判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA），因其具備了主成分分析、相關性分析及多元線性回歸分析等功能[17]，近年來在白酒行業領域受到了極大的重視及應用。卓俊納等[18]利用氣相色譜-四極桿飛行時間質譜（gas chromatography-quadrupole time of flight-mass spectrometry，GC-QTOF-MS）結合化學計量學成功鑒別三種香型白酒。陳曉梅[19]利用氣相色譜-嗅聞法（gas chromatography-olfactometry，GC-O）、GC-MS等儀器檢測結果結合化學計量學對三種不同年份茅臺酒香氣成分進行剖析，并找出了茅臺酒中35種關鍵香氣化合物與酒體呈現的醬香、陳香、窖香、焦糖香、花香、果香和糧食香這七個感官屬性之間的存在相關性。李愛蘭等[20]利用吹掃捕集-氣質聯用結合化學計量學實現了不同產地和品牌濃香型白酒鑒別。王川南等[21]采用氣相色譜技術結合主成分分析找出了6個品牌七個輪次基酒14個特征成分的含量，并探究不同輪次中特征成分的變化情況。可見，應用先進的檢測工具結合專業的多元化學計量學分析方法可以實現白酒香型的鑒別、關鍵風味物質的尋找及輪次酒的研究。然而，該技術在企業不同質量等級白酒出廠把關和市場真假鑒別的研究方面仍較少。

本研究以同一企業5個質量等級的醬香型白酒為研究對象，借助GC、GC-MS和HPLC為檢測手段，結合化學計量學方法來剖析不同質量等級醬香型白酒的風味物質組成，并結合香氣活性值（ordor activity value，OAV）、主成分分析（PCA）及偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）不同等級質量等級醬香型白酒的關鍵差異風味物質，為白酒酒體穩定性評價、質量控制及真假酒鑒別提供科學的技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同質量等級醬香型白酒樣品：由遵義市某企業提供，酒精度均為53%vol，分A、B、C、D、E共5個等級，每個等級10個酒樣，共50個樣本，室溫下密封貯存。

氯化鈉、磷酸二氫鉀（均為分析純）；國藥集團化學試劑有限公司；乙醚、正己烷、無水乙醇（均為色譜純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸、2-辛醇（純度均≥99.0%）：默克化工技術（上海）有限公司；乙酸、乳酸、己酸、丁酸、乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯、乙縮醛、糠醛、苯甲醛、正丙醇、丁醇、異戊醇、苯甲醇、苯丙酸乙酯、苯乙醇、十三酸乙酯、十四酸乙酯、十五酸乙酯等標準品（純度均≥99.0%）：阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設備

GC 8890A氣相色譜儀、1260 Infinity高效液相色譜儀、GC 7890A-MS 5975C氣相色譜質譜聯用儀：美國Agilent公司；QT-1旋渦混合器：上海琪特分析儀器有限公司；Eppendorf自動移液槍：德國艾本德公司；OEM型電子天平：奧豪斯國際貿易（上海）有限公司；Aquaplore 3S型全智能超純水機：美國艾科浦國際有限公司。

1.3 方法

1.3.1 感官評價

參照國標GB/T 33405—2016《白酒感官品評術語》[22]與GB/T 33404—2016《白酒感官品評導則》[23]等相關標準，結合文獻報道的方法[24-25]，選取12名有省級資格品酒人員（年齡在25～35周歲，男女比例1∶1）組成感官評價小組，在經過系統培訓后，對5個質量等級的醬香酒體所包含的特征香氣進行篩選，確定的特征描述詞分別是“醬香”、“曲香”、“糧香”、“花香”、“果香”、“醇甜香”、“青草香”、“烘焙香”、“酸香”。

1.3.2 風味物質的測定

（1）氣相色譜法

酒樣的風味物質分析采用氣相色譜-火焰離子化檢測器（gas chromatograph-flame ionization detector，GC-FID），參照課題組前期文獻報道方法[26]，具體測定指標及內標見表1，共檢測風味物質45種。

表1 氣相色譜法測定風味物質所用內標Table 1 Internal standards for determination of flavor components by gas chromatography

（2）高效液相色譜法

酒樣的乙酸和乳酸含量測定采用HPLC法。參考趙璇等[27]報道的文獻結合實驗室條件，簡化樣品前處理。取待測酒樣1 mL，通過注射針過0.22 μm有機濾膜，上機檢測。HPLC色譜條件為：ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm 5 μm）；流動相：0.02 mol/LKH2PO4，pH 2.3；檢測波長208 nm，柱溫30 ℃，流動相流速0.8 mL/min，進樣量1 μL。

（3）氣相色譜-質譜聯用法

酒樣的微量風味物質檢測參照文獻報道的GC-MS法[28]，內標選用2-辛醇和2-甲氧基-3-甲基吡嗪，具體測定指標及內標見表2，共檢測風味物質指標56種。

表2 氣相色譜-質譜聯用法測定風味物質所用內標物Table 2 Internal standards for determination flavor components by gas chromatograph-mass spectrometry

1.3.3 風味化合物定性定量

定性方法：GC-FID和HPLC采用標準品定性，GC-MS采用美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）譜庫檢索結合標準品定性。

定量方法：GC-FID和GC-MS采用內標法，以待測物與內標物的含量比為橫坐標，峰面積比為縱坐標，建立各物質的標準曲線回歸方程計算各風味物質含量。HPLC采用外標法，標準品進行梯度稀釋，建立各物質的標準曲線來測量各物質含量。

1.3.4 香氣活性值（OAV）計算

通過香味物質的濃度（concentration，C）與閾值（odor threshold，OT）的比值計算各物質的OAV[29-30]，OAV＞1的物質對白酒香氣形成有重要貢獻，是關鍵風味化合物。其計算公式如下：

式中：C為各香氣化合物質量濃度，mg/L；OT為各香氣化合物閾值，μg/L。

1.3.5 數據處理

利用Excel 2019軟件整理數據，Origin 2022軟件制圖，SIMCA 14.1軟件開展判別分析及變量權重排序分析，SPSS 20.0軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同質量等級白酒的感官分析

采用感官評定的方法對5個質量等級的醬香型白酒打分，繪制感官評定雷達圖，結果見圖1。由圖1可知，A級酒的醬香、曲香和青草香突出，糧香、花香、果香、醇甜香和烘焙香適中，酸香較淡。B級酒的醬香、曲香和烘焙香突出，糧香、花香、果香、醇甜香和青草香適中，酸香較淡。C級酒的曲香、糧香和醇甜香突出，醬香、花香、果香、青草香、烘焙香和酸香適中。D級酒的糧香和醇甜香突出，醬香、曲香、花香、果香、青草香和酸香適中，烘焙香較淡。E級酒的糧香、酸香突出，花香、果香、醇甜香和青草香適中，醬香和烘焙香較淡。結果表明，不同等級的白酒在各感官維度上存在顯著差異（P＜0.05），從A級酒到E級酒中，醬香、曲香逐漸淡化，糧香和酸香逐漸突出，其差異的原因可能是老酒與新酒比例不同造成的。

圖1 不同質量等級醬香白酒感官評價雷達圖Fig.1 Radar map of sensory evaluation of sauce-flavor Baijiu with different quality grades

2.2 不同質量等級酒樣的風味成分解析

采用GC、HPLC和GC-MS對不同質量等級的醬香型白酒的風味成分進行定性、定量分析，GC-FID，HPLC和GC-MS分析圖譜以及見方法的檢出限（limit of detection，LOD）、定量限（limit of quantification，LOQ）、加標回收率和精密度試驗結果相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分別見圖2和表3。由圖2和表3可知，所使用的方法基線平穩，色譜峰平滑對稱，分離效果明顯，且精密度及準確度良好，能滿足白酒風味物質檢測的要求。

圖2 不同質量等級酒樣的風味成分GC-FID、GC-MS和HPLC分析色譜圖Fig.2 Chromatograms of flavor compounds in sauce-flavor Baijiu with different quality grades analyzed by GC-FID, GC-MS and HPLC

表3 檢出限、定量限、回收率及精密度試驗結果相對標準偏差Table 3 Limit of detection, limit of quantification, recovery rate and relative standard deviation of precision tests results

將不同質量等級醬香型白酒中所檢出的風味物質按酸類、酯類、醇類、醛類、酮類、吡嗪類、酚類和其他類進行分類，結合各物質閾值計算其OAV，結果見表4。

表4 不同等級醬香型白酒酒樣風味物質檢測結果及香氣活性值Table 4 Determination results and odor activity values of flavor components in sauce-flavor Baijiu samples with different quality grades

由表4可知，通過GC、HPLC和GC-MS技術對不同質量等級醬香型白酒酒樣進行定性定量分析，共檢出103種風味物質，包括酸類10種，酯類34種，醇類21種，醛類9種，酮類9種，吡嗪類10種，酚類6種，其他類4種，且不同等級酒樣中各種風味物質含量存在一定的差異，是酒體質量等級劃分的重要依據。

酸類物質能在白酒中起到消除雜味、增加余味和促進酒體老熟等作用[30]。在幾個質量等級的醬香型白酒酒體中，以乙酸和乳酸的含量上最多，遠高于其他酸約2個數量級，均達到1 500 mg/L以上。在風味貢獻方面，OAV＞1的有7種酸，分別是乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、己酸，這些物質對醬香白酒酸香具有貢獻。而乳酸為非揮發性有機酸，其含量雖然較高，其作用主要貢獻在口味方面[31]。

酯類物質在白酒中主要以乙酯為主，占35%～45%，常常賦予酒體濃郁的果香味及飽滿的酯香感[3，30]。由表4可知，酯類在醬香白酒中種類最豐富，在含量上以乙酸乙酯和乳酸乙酯含量較高，均達到1 000 mg/L以上，是醬香性白酒重要的骨架組分。從各酯類物質的OAV上分析，OAV＞1的風味物質有乙酸異丁酯、2-甲基丁酸乙酯、己酸丁酯、苯乙酸乙酯、苯丙酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、異戊酸乙酯、乙酸異戊酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯，共13種，占所檢測酯類的38%，這些物質共同形成了酒體獨特的香氣。特別是異戊酸乙酯和己酸乙酯，盡管酒體中含量不高，但OAV均＞100，說明其對醬香白酒香氣的形成有明顯貢獻，在酒體中呈現“量微香大”的特點。此外，各等級酒體中也存在一定含量的棕櫚酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯，豐富著酒體的脂肪香氣[32]。

醇類在白酒中起到助香和增甜作用，也會呈現特殊香味，如β-苯乙醇帶有玫瑰花香氣[30]。由于醇類物質閾值較高，在研究的白酒中OAV＞1的醇僅有6種，分別是1-辛烯-3-醇、仲丁醇、丙醇、異丁醇、丁醇、己醇，占所檢測醇類的28%，大部分醇類的OAV＜1，這部分物質對酒體的貢獻可能在口味上。此外，丙醇在醬香酒醇類物質中含量最高，且OAV最大，因此，推斷丙醇可能是醬香酒不同與其他香型白酒的差異貢獻物質。

醛酮類物質是醬香型酒體重要的一類風味物質，常常賦予酒體陳味和青草味[30]。由表3可知，醛類物質的閾值均較低，除了苯甲醛和5-甲基-2-糠醛外，78%的醛類OAV＞1，包括糠醛、苯乙醛、乙醛、丙醛、異丁醛、乙縮醛、異戊醛，說明醛類物質是醬香白酒的重要香氣貢獻物質，如乙縮醛（OAV＞100）賦予白酒清香柔和感[30]。酮類物質除了2-庚酮和3-羥基-2-丁酮外，其他酮類物質的OAV均＜1，其原因主要是其他酮含量太低導致。值得注意的是，3-羥基-2-丁酮（又名醋嗡）的OAV＞100，可能是醬香型白酒的關鍵風味物質。

吡嗪類通常賦予白酒焦香和焙烤香，在醬香型白酒中量高于其他香型，同時對其他香型具烘托疊加作用[30]。酚類在醬香型白酒中含量均低，僅愈創木酚因閾值較低造成OAV＞1，且在不同等級質量醬香型白酒中無明顯差異。其他類中二甲基二硫和二甲基三硫因香氣閾值較低使其OAV＞1，該類硫化物被報道是導致醬香型白酒產生鹽菜味的因素[33]。此外，2-乙氧基甲烷被認為是酒體老熟的標記物[34]，在不同等級醬香酒體均能被定量到，而且存在差距，是醬香白酒關鍵風味成分。

本研究從103種風味物質中篩選出關鍵風味化合物（OAV＞1）38種，其中，酸類7種（乙酸，丙酸，異丁酸，丁酸，異戊酸，戊酸，己酸）、酯類13種（乙酸異丁酯，2-甲基丁酸乙酯，己酸丁酯，苯乙酸乙酯，苯丙酸乙酯，乙酸乙酯，丁酸乙酯，異戊酸乙酯，乙酸異戊酯，戊酸乙酯，己酸乙酯，乳酸乙酯，辛酸乙酯）、醇類6種（1-辛烯-3-醇，仲丁醇，丙醇，異丁醇，丁醇，己醇）、醛類7種（糠醛，苯乙醛，乙醛，丙醛，異丁醛，乙縮醛，異戊醛）、酮類2種（2-庚酮，3-羥基-2-丁酮）、酚類1種（愈創木酚）、硫化物2種（二甲基二硫，二甲基三硫）。

2.3 關鍵風味化合物熱圖分析

為了直觀了解不同質量等級醬香型白酒酒中各物質間的種類及含量差異，利用表3中OAV＞1的38種關鍵風味化合物的數據，構建不同質量等級醬香型白酒中香氣貢獻物質熱圖，結果見圖3。由圖3可知，各香氣貢獻物質在酒體中含量具有較大差異，如乙酸、乙酸乙酯、乳酸乙酯及丙醇的含量均較高，而愈創木酚、二甲基二硫和二甲基三硫含量較低。值得注意的是，因物質間最大含量與最小含量存在104個數量級的差異，通過對數條件處理后，在熱圖中只能直觀看出各香氣貢獻物質間含量差異，而未能體現出不同質量等級酒之間存在的差異，達不到酒體質量等級的差異性分析要求。

圖3 不同質量等級醬香型白酒樣品中關鍵風味化合物熱圖Fig.3 Heat map of key flavor compounds in sauce-flavor Baijiu samples with different quality grades

2.4 關鍵風味化合物的化學計量學分析

主成分分析（PCA）是一種無監督的降維多元統計分析技術，是將多個變量指標歸納為少數幾個綜合指標以利于分析的工具[35-36]。試驗通過對50個樣本中38種關鍵風味化合物進行PCA。結果表明，前4個主成分累計方差貢獻率已到達85.30%，可代表大部分成分信息，其中，主成分1（PC1）解釋了總方差的44.60%，而主成分2（PC2）解釋了總方差的22.50%，共解釋了數據集總方差的67.10%。由圖4a可知，A級酒樣坐落在第一象限，E級酒樣坐落在第二象限，C級和D級酒樣坐落在第三象限，B級酒樣坐落在第四象限，且各等級酒能實現良好的聚集，表明不同質量等級的醬香型白酒的香氣化合物的含量存在明顯差異，彌補了熱圖分析無法區分的缺陷。

圖4 不同質量等級醬香型白酒樣品中關鍵風味化合物化學計量學分析結果Fig.4 Chemometrics analysis results of key flavor compounds in sauce-flavor Baijiu samples with different quality grades

偏最小二乘判別法分析（PLS-DA）集中了主成分、典型相關性分析和多元線性回歸分析技術優點，且增加了虛擬響應矩陣，具備對數據擬合及預測的能力，可解決傳統多元回歸方法無法克服的問題，且在分析小樣本量變量的相關性時更加可靠[28]。研究為了準確地分鑒定不同質量等級醬香型白酒之間香氣組分的差異，利用PLS-DA對關鍵風味化合物含量進行解析。由圖4b可知，PLS-DA構建的模型解釋能力（R2Y）為0.968，預測能力（Q2Y）為0.961，均近于1，同樣能夠對五個不同質量等級的醬香型樣品區分較好。由圖4c可知，通過200次置換檢驗以評估PLS-DA模型是否過度擬合數據，置換測試的截距R2為0.059 9，Q2為-0.398 0，R2＞Q2，且Q2在負截距，表明PLS-DA模型有效。通過變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值分析可體現出各個變量對于樣品分離的貢獻程度，通常選擇VIP值＞1的變量作為解釋差異的潛在標記物質。由圖4d可知，VIP值＞1的物質分別是丁醇（1.463 91）、乙醛（1.385 96）、乙酸乙酯（1.365 56）、苯乙醛（1.328 04）、丙醛（1.326 97）、丁酸（1.171 13）、丙酸（1.162 10）、戊酸乙酯（1.115 01）、2-甲基丁酸乙酯（1.109 93）、戊酸（1.093 66）、辛酸乙酯（1.090 00）、乙酸（1.088 46）、己醇（1.051 43）和異丁醛（1.048 93），共14種關鍵差異性香氣化合物。

進一步對14種關鍵差異風味化合物（VIP值＞1）的含量進行分析，結果見圖5。

圖5 關鍵差異風味化合物含量分析結果Fig.5 Analysis results of key difference flavor compoundscontents

由5可知，14種關鍵差異風味化合物中，醇類有2種，酸類4種，酯類4種，醛類4種。以乙酸、乙酸乙酯和乙醛含量較高，在乙酸和乙醛含量對比中，A級酒中含量最多，在乙酸乙酯含量對比中，E級酒中含量最多，反觀丙酸、戊酸及異丁醛等物質，盡管它們的含量較低，但同樣在不同質量等級白酒之間均存在明顯的差異，其原因可能是在勾調工藝中老酒、調味酒等用量不同導致的。通過對五個質量等級酒樣中關鍵差異風味化合物（VIP值＞1）含量進行單因素方差分析，結果表明，這些關鍵差異風味化合物含量在不同質量等級的醬香型白酒中差異顯著（P＜0.05），這一結論進一步驗證了PCA和PLS-DA的分析結果。

3 結論

采用GC、HPLC和GC-MS對5個質量等級酒樣進行定性、定量分析，共檢出103種風味物質，通過OAV＞1篩選后，獲得對醬香酒體具有香氣貢獻的38種關鍵風味化合物，借助PCA和PLS-DA建模，能實現不同等級酒樣的有效區分。通過變量重要性投影（VIP）值篩選出14種關鍵差異風味化合物（VIP值＞1），分別為丁醇、乙醛、乙酸乙酯、苯乙醛、丙醛、丁酸、丙酸、戊酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、戊酸、辛酸乙酯、乙酸、己醇和異丁醛，這些關鍵差異風味化合物含量在不同質量等級的醬香型白酒中顯著差異（P＜0.05）。

本研究豐富了酒體質量評價的方法，此方法雖不能完全替代感官品評方法，但可將鑒別模型與感官分析相結合，用于不同質量醬香型白酒的鑒別，從而提供一種更高效、準確的鑒別方法，提高鑒別結果的可信度。本模型的后續研究可延伸到不同產區的醬香型白酒品質鑒定及驗證，為產業高質量發展提供理論依據。