復(fù)合益生菌固態(tài)發(fā)酵酒糟條件的研究

舒 林，鄭 佳，李 麗，蔡 吉，，黃翠欣，林 捷，溫雪瓶，劉 軍*

（1.四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644000；2.宜賓五糧液股份有限公司，四川 宜賓 644000）

白酒糟別名酒醅糟、丟糟，是白酒類(lèi)生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的主要副產(chǎn)物，年產(chǎn)量高達(dá)5 000萬(wàn)t[1-3]，若儲(chǔ)存不當(dāng)或放置過(guò)久易導(dǎo)致酒糟變質(zhì)，甚至造成嚴(yán)重環(huán)境污染[4-5]。白酒的生產(chǎn)是以高粱、大米、小麥等谷物為主要原料，因此白酒糟不僅氮、磷元素含量高[6]，富含纖維素以及豐富的發(fā)酵產(chǎn)物，還有很多未能利用的淀粉、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高[7-8]。目前企業(yè)對(duì)白酒糟的處理方法比較單一，主要是通過(guò)生物質(zhì)燃燒或?qū)⑵浣?jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的干燥處理作為飼料和堆肥出售，不僅產(chǎn)品附加值低、經(jīng)濟(jì)效益較低，而且還會(huì)污染環(huán)境。無(wú)害化再利用白酒糟不僅可以實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)白酒綠色生產(chǎn)，同時(shí)也能實(shí)現(xiàn)資源合理利用和經(jīng)濟(jì)循環(huán)[9]，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)白酒糟進(jìn)行了大量的研究，主要集中在生產(chǎn)食醋、蛋白飼料、化工產(chǎn)品、食用菌栽培等方面[10-13]，其中以酒糟為主要培養(yǎng)料接種食用菌菌種進(jìn)行栽培后，菌絲滿袋后未出菇菌糠的粗蛋白、粗多糖等營(yíng)養(yǎng)成分可得到一定改善。微生物發(fā)酵處理是無(wú)害化利用白酒糟、提升酒糟品質(zhì)的有效手段，在發(fā)酵過(guò)程中，微生物可以產(chǎn)生一些復(fù)雜的酶系，從而改善酒糟的品質(zhì)，其主要有單菌種發(fā)酵[14]和復(fù)合菌種發(fā)酵[15]技術(shù)。大量研究表明，復(fù)合微生物發(fā)酵酒糟因其成本低、富含益生菌等優(yōu)點(diǎn)逐漸受到重視，發(fā)酵工業(yè)中常用白酒糟發(fā)酵劑菌種主要包括酵母菌、霉菌、細(xì)菌、乳酸菌、放線菌等[16-18]。隨著白酒產(chǎn)量的不斷增幅，深入探索酒糟高值化、規(guī)?；涂沙掷m(xù)處理途徑具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

考慮到酒糟水分含量較高，可通過(guò)添加麩皮和洗米糠兩種蛋白原料，實(shí)現(xiàn)降低物料水分同時(shí)提高發(fā)酵效率的效果。本試驗(yàn)以白酒釀造副產(chǎn)物酒糟、酒糟為主要培養(yǎng)料的未出菇菌糠、麩皮和洗米糠為發(fā)酵底物，用三種益生菌1∶1∶1（V/V）混合制備具有高生物活性的發(fā)酵劑，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件，使酒糟的蛋白品質(zhì)得到有效提升，并為發(fā)酵酒糟在酸奶、食用醋、發(fā)酵蛋白飼料等方面的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)白酒升級(jí)轉(zhuǎn)型為環(huán)境友好型產(chǎn)業(yè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與材料

芽孢桿菌（Bacillus）K、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）S、屎腸球菌（Enterococcus faecium）Q：保藏于本實(shí)驗(yàn)室；菌糠（水分含量為59.33%，培養(yǎng)料為酒糟60%、棉籽殼20%、麩皮20%，菌絲滿袋且未出菇）：由本實(shí)驗(yàn)室自行栽培；酒糟（水分含量為15.35%）：宜賓五糧液股份有限公司；麩皮（水分含量為11.45%）、洗米糠（水分含量為8.88%）：樂(lè)山恒峰華邦生物科技有限公司；酸性蛋白酶（蛋白酶活力≥6×105U/g）：滄州夏盛酶生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 化學(xué)試劑

硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、三氯乙酸、鹽酸（均為分析純）：成都科隆化學(xué)品有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基：按照參考文獻(xiàn)[19-21]配制。

芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基：2 g/L葡萄糖，10 g/L蛋白胨，5 g/L氯化鈉，4 g/L吐溫-80，121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

LS-75HD立式壓力蒸汽滅菌鍋：江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；T-114分析天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；AT-710電位自動(dòng)滴定計(jì)：日本京都電子制造有限公司；SH220F石墨消解儀、K9840凱氏定氮儀：山東海能科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2D雙人單面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；HWS-2608恒溫恒濕培養(yǎng)箱：杭州綠博儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高生物活性發(fā)酵劑的制備

用接種環(huán)分別刮取兩環(huán)菌株K、S和Q的活化菌種，分別接種至50 mL LB培養(yǎng)基、50 mL YPD培養(yǎng)基和150 mL MRS培養(yǎng)基中，分別在37 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)20 h和37 ℃靜置培養(yǎng)20 h，獲得種子液；再按3%接種量（V/V）分別接種于芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)38 h、28 h和28 h后獲得發(fā)酵液，其中活菌數(shù)分別為9.2×108CFU/mL、2.3×108CFU/mL和2.0×109CFU/mL。

將K發(fā)酵液、S發(fā)酵液和Q發(fā)酵液以1∶1∶1（V/V）混合均勻，制得高生物活性的混合發(fā)酵劑，備用。

1.3.2 復(fù)合益生菌固態(tài)發(fā)酵酒糟

將粉碎后的酒糟、菌糠、麩皮、洗米糠分別按質(zhì)量比30∶30∶20∶20（配方1）、20∶40∶20∶20（配方2）、15∶45∶20∶20（配方3）、10∶50∶20∶20（配方4）、5∶55∶20∶20（配方5）混合均勻，加入其總質(zhì)量0.6%的酸性蛋白酶和7.5%（mL/g）的高生物活性混合發(fā)酵液，添加適量蒸餾水翻拌均勻，使其水分含量為45%。將最終物料分裝于呼吸袋中40 ℃密閉發(fā)酵3 d。以發(fā)酵前為對(duì)照，測(cè)定發(fā)酵后的pH、粗蛋白（crude protein，CP）、酸溶蛋白（acid soluble protein，ASP）含量、ASP/CP，進(jìn)而確定最優(yōu)發(fā)酵配方。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

選擇接種量7.5%、水分含量45%、發(fā)酵時(shí)間3 d、發(fā)酵溫度40 ℃作為固定初始發(fā)酵條件，依次考察接種量（4.5%、6.0%、7.5%、9.0%、10.5%）、水分含量（35%、40%、45%、50%、55%）、發(fā)酵時(shí)間（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d）、發(fā)酵溫度（34 ℃、37 ℃、40 ℃、43 ℃、46 ℃）對(duì)CP、ASP含量、ASP/CP、蛋白溶解度的影響。

1.3.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以ASP/CP為考察指標(biāo)，選擇發(fā)酵時(shí)間（A）、發(fā)酵溫度（B）、水分含量（C）、接種量（D）4個(gè)因素設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

水平 A 發(fā)酵時(shí)間/d B 發(fā)酵溫度/℃ C 水分含量/% D 接種量/%1 2 3 2 3 4 37 40 43 45 50 55 7.5 9.0 10.5

1.3.5 檢測(cè)方法

pH測(cè)定：參照劉曉明等[22]的方法，用pH計(jì)測(cè)定。

粗蛋白（CP）含量[23]：根據(jù)GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的凱氏定氮法測(cè)定；酸溶蛋白（ASP）含量[24]：采用三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）沉淀法測(cè)定；蛋白溶解度：根據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T 19541—2017《飼料原料豆粕》[25]規(guī)定方法測(cè)定；酸溶蛋白/粗蛋白（ASP/CP）計(jì)算公式如下：

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2016對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理，SPSS 27軟件中的ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，并采用Duncan's法進(jìn)行多重比較。結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵底物配方的選擇

益生菌發(fā)酵不同底物配方的結(jié)果分別見(jiàn)表2和圖1。由表2可知，隨著配方中酒糟含量的不斷減少，發(fā)酵前各配方的pH呈顯著上升趨勢(shì)（P＜0.05），其中配方4和配方5發(fā)酵前pH無(wú)顯著差異（P＞0.05）；發(fā)酵后各配方的pH與發(fā)酵前相比均有所下降，配方4和配方5發(fā)酵前后的pH值變化較大，這可能是因?yàn)榇宋锪铣跏紁H較高，適合微生物生長(zhǎng)繁殖，更有利于在發(fā)酵過(guò)程中將糖類(lèi)轉(zhuǎn)化為乳酸、乙酸等有機(jī)酸導(dǎo)致酸度增加[26]。由圖1可知，發(fā)酵結(jié)束后配方4的各蛋白品質(zhì)提升效果均達(dá)到最好水平，CP、ASP、ASP/CP含量分別提高了9.94%、66.03%、51.29%，說(shuō)明此配方碳氮源比例均衡，利于微生物生長(zhǎng)代謝產(chǎn)酶。綜合pH變化和蛋白品質(zhì)提升效果，選取配方4進(jìn)行后續(xù)條件優(yōu)化試驗(yàn)。

圖1 不同配方原料發(fā)酵后各蛋白品質(zhì)提升效果Fig.1 Enhancing effect of protein quality in raw materials with different formulas after fermentation

表2 不同配方原料發(fā)酵前后pH的變化Table 2 Changes of pH of raw materials with different formulas before and after fermentation

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 接種量的確定

采用配方4，分別接種不同比例的混合發(fā)酵液，考察發(fā)酵底物中蛋白的變化情況，從而確定最佳的接種量，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，ASP/CP基本變化趨勢(shì)為不斷上升，在10.5%時(shí)達(dá)到最高值為54.29%，與接種量為7.5%和9.0%無(wú)顯著差異（P＞0.05）。原因可能是當(dāng)以較低接種量接種時(shí)，固態(tài)培養(yǎng)基中微生物含量較低，產(chǎn)生的蛋白酶也相對(duì)較少，導(dǎo)致大量的大分子蛋白質(zhì)無(wú)法被充分分解；同時(shí)菌種會(huì)先滿足自身繁殖，再對(duì)物料進(jìn)行發(fā)酵作用，延長(zhǎng)固態(tài)發(fā)酵的時(shí)間[27-28]。當(dāng)接種量為7.5%和10.5%相比于其他組較優(yōu)，兩組間各蛋白品質(zhì)均不具有顯著差異（P＞0.05）。因此，最適接種量為9.0%。

圖2 接種量對(duì)蛋白品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of inoculum on protein quality

2.2.2 水分含量對(duì)發(fā)酵酒糟的影響

不同水分含量對(duì)物料的各蛋白品質(zhì)的影響見(jiàn)圖3。在固態(tài)發(fā)酵中，水分含量對(duì)微生物的生長(zhǎng)具有重要影響，水分過(guò)多或過(guò)少都會(huì)影響微生物生長(zhǎng)，且隨發(fā)酵的進(jìn)行水分含量會(huì)隨代謝強(qiáng)度相應(yīng)發(fā)生變化，與微生物生長(zhǎng)狀況直接相關(guān)。由圖3可知，隨著水分含量的增加，各蛋白品質(zhì)大致呈增長(zhǎng)趨勢(shì)；當(dāng)水分含量為35%時(shí)，初始水分含量過(guò)低，物料不能充分的吸收水分，不利于微生物的生長(zhǎng)，造成產(chǎn)酶下降，進(jìn)而影響后續(xù)大分子物質(zhì)的分解[29]；當(dāng)水分含量為50%和55%時(shí)，相比于其他組各蛋白品質(zhì)較優(yōu)，且兩組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。當(dāng)水分含量為55%時(shí)，雖然ASP/CP有最大值，但由于水分含量較高，發(fā)酵中容易導(dǎo)致底物粘連結(jié)塊，影響感官的同時(shí)物料發(fā)酵不均勻，基質(zhì)間隙率下降，影響氧氣流通[30]，抑制好氧菌的的代謝強(qiáng)度，不利于產(chǎn)酶或降低酶活力。因此，最適水分含量為50%。

圖3 水分含量對(duì)蛋白品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of moisture on protein quality

2.2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵酒糟的影響

不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)蛋白品質(zhì)的影響見(jiàn)圖4。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)蛋白品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of fermentation time on protein quality

由圖4可知，隨著發(fā)酵天數(shù)的延長(zhǎng)，CP和蛋白溶解度含量各組分間無(wú)顯著差異，ASP含量和ASP/CP呈先上升后下降趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為第3天時(shí)，ASP、ASP/CP和蛋白溶解度均達(dá)到最大值，分別為8.45%、52.35%、67.34%。這是因?yàn)榘l(fā)酵前期物料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充分，微生物生長(zhǎng)代謝旺盛，分泌的蛋白酶將蛋白大分子分解成小分子，使ASP/CP上升，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，物料水分含量達(dá)到穩(wěn)定，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能滿足微生物生長(zhǎng)，微生物數(shù)量達(dá)到平衡狀態(tài)，微生物優(yōu)先利用肽或小分子蛋白合成自身蛋白，造成ASP/CP含量逐漸下降。發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)短直接影響代謝產(chǎn)物的積累和底物的消耗，時(shí)間過(guò)短導(dǎo)致發(fā)酵不充分；發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)使原料被浪費(fèi)[31]。因此，最適發(fā)酵時(shí)間為3 d。

2.2.4 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵酒糟的影響

不同發(fā)酵溫度對(duì)蛋白品質(zhì)的影響見(jiàn)圖5。

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)蛋白品質(zhì)的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on protein quality

由圖5可知，隨著發(fā)酵溫度的增大，物料的ASP/CP呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)，在46 ℃時(shí)達(dá)到最大值為51.87%；CP、ASP和蛋白溶解度含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，可能因?yàn)檫m度升溫可以促進(jìn)微生物分泌相關(guān)的酶，而溫度過(guò)高則會(huì)導(dǎo)致某些蛋白質(zhì)和酶變性[32-33]。在發(fā)酵溫度40 ℃條件下，CP、ASP、蛋白溶解度三個(gè)蛋白品質(zhì)均達(dá)到最大值，分別為17.02 g/100 g、8.58 g/100 g、70.80%。當(dāng)發(fā)酵溫度為46 ℃時(shí)，ASP/CP雖然有最大值，但與40 ℃無(wú)顯著差異（P＞0.05）。因此，最適發(fā)酵溫度為40 ℃。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，正交試驗(yàn)結(jié)果如表3所示，結(jié)果表明正交試驗(yàn)5號(hào)ASP/CP最高，達(dá)到52.57%。通過(guò)極差分析，可得到對(duì)ASP/CP影響的主次順序?yàn)锳＞B＞C＞D，即影響最大的因素是發(fā)酵時(shí)間，其次是發(fā)酵溫度和水分含量，影響最小的是接種量。通過(guò)比較K值，可確定最優(yōu)發(fā)酵條件組合為A2B3C3D3，即發(fā)酵時(shí)間為3 d，發(fā)酵溫度為43 ℃，水分含量為50%，接種量為10.5%。

表3 復(fù)合益生菌固態(tài)發(fā)酵酒糟條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for solid-state fermentation conditions optimization of distiller's grains by compound probiotics

2.4 驗(yàn)證性試驗(yàn)

按最佳發(fā)酵條件組合A2B3C3D3，即水分含量為50%，接種量為10.5%，于43 ℃下固態(tài)發(fā)酵3 d，檢測(cè)發(fā)酵前后的各蛋白品質(zhì)，試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，在該優(yōu)化條件下，CP、ASP含量、蛋白溶解度分別為16.90 g/100 g、8.95 g/100 g、70.70%，ASP/CP可達(dá)到52.95%，優(yōu)于正交試驗(yàn)5號(hào)。

3 結(jié)論

通過(guò)比較不同配方發(fā)酵前后pH及蛋白品質(zhì)變化篩選出一個(gè)益生菌固態(tài)發(fā)酵酒糟的較合適配方，即酒糟10%，菌糠50%，麩皮20%，洗米糠20%。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)分析得到影響益生菌固態(tài)發(fā)酵酒糟品質(zhì)的影響因素次序依次為發(fā)酵時(shí)間＞發(fā)酵溫度＞水分含量＞接種量，確定最佳發(fā)酵條件組合為A2B3C3D3，即發(fā)酵時(shí)間為3 d，發(fā)酵溫度為43 ℃，水分含量為50%，接種量為10.5%。在此優(yōu)化發(fā)酵條件下，與發(fā)酵前相比CP含量提高了11.06%，ASP含量提高了95.77%，ASP/CP提高了76.23%，蛋白溶解度提高了14.84%。

本研究通過(guò)混合益生菌發(fā)酵酒糟，篩選出合適的發(fā)酵配方和發(fā)酵條件，使酒糟的蛋白品質(zhì)得到有效提升，在一定程度上提高了酒糟的再利用價(jià)值，并為發(fā)酵酒糟在酸奶、食用醋、發(fā)酵蛋白飼料等方面的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。今后還可對(duì)酶制劑添加量，益生菌發(fā)酵液比例等發(fā)酵條件進(jìn)行研究，以期獲得更好的發(fā)酵品質(zhì)。