桑葚花色苷酸奶發酵條件優化及品質分析

黃玉瑩，吳 敏，吳一章，樊保孝，胡德輝*

（1.廣西中醫藥大學 藥學院，廣西 南寧 530200；2.廣西中醫藥大學 教學實驗實訓中心，廣西 南寧 530200；3.中藥學國家級試驗教學示范中心（廣西中醫藥大學），廣西 南寧 530200）

桑葚（Fructus mori）又稱桑椹、桑葚子、桑棗、桑果、桑泡兒、桑子、烏葚、桑實等，是桑科桑屬多年生木本植物桑樹的果實[1]。桑葚中含有豐富的花色苷，桑葚花色苷是一類具有苯并吡喃結構的類黃酮化合物，其中，矢車菊素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-蕓香糖苷兩種含量最高[2]。花色苷廣泛存在于漿果、葡萄、薯類等水果和蔬菜中，作為一種廣泛分布于植物界的水溶性多酚類色素，具有較強的抗氧化能力、抗炎、預防癌癥、抑制腫瘤以及保護心血管、減肥等作用，在保護人體健康上有很大的優勢[4]，也是其促進人體健康的主要成分[5]。

目前，學者們對桑葚研究的領域更多的是桑葚花色苷如何提取、提取工藝的優化以及它的功效研究[6]。桑葚花色苷在食品上的應用主要是作為天然色素，其顏色鮮美，常用于酒、飲料、果汁等飲品來改善風味、美化外觀、增強其飲用的食欲[7]。

酸奶是一款老少皆宜的健康飲品。酸奶中含有豐富的乳酸桿菌、雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌等益生菌，適合乳糖不耐受的人群，易于人體腸道的吸收，能更好地促進潤腸通便，其營養、保健功能豐富，是受人們喜愛的一款乳制品[8]。常見的酸奶于2～4 ℃條件下保存，偏酸性，酸甜可口。根據熱對花色苷降解影響的定量研究，花色苷水溶液在低溫下分解緩慢，高溫下分解得快，特別是pH升高的條件下分解得則更快[10]，因此低溫以及高的酸性條件下貯藏對花色苷的保存更有利[4]。功能型酸奶比一般酸奶有更豐富的品種和保健功效，按添加成分不同主要分為五大類，包括谷物型、果蔬型、中藥型、益生菌型和營養強化型[11]。酸奶中添加花色苷具有較強的抗氧化能力，屬于營養強化型酸奶。紫番薯花色苷酸奶中添加紫番薯花色苷對超氧陰離子和羥自由基均有較好的清除效果，且與濃度正相關[12]。郭紅輝等[13]研制了黑米花色苷酸奶，添加黑米花色苷產品為粉紫色，并提高了附加值。此外，日本開發了具有預防嬰兒流行性感冒和調節尿酸的酸奶[14]。

本研究利用桑葚花色苷在低溫、低pH下保存較好的條件將其應用在酸奶中，以感官評價為主要指標，通過單因素、正交試驗對桑葚花色苷酸奶發酵條件進行優化，并對其理化指標及抗氧化活性進行檢測，以期制作一款有抗氧化功效且具桑葚花色苷獨特風味的酸奶。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葚花色苷提取物：西安立森生物科技有限公司；純牛奶、白砂糖：市售；乳酸菌酸奶發酵粉：北京川秀科技有限公司。

無水乙醇：成都市科隆化學品有限公司；1,1二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；氫氧化鈉、鄰苯對二甲酸氫鉀（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；酚酞（分析純）：成都市科龍化工試劑廠；考馬斯亮藍G-250染色液、牛血清蛋白（均為生化試劑）：福州文萊生物科技有限公司；MRS固體培養基：廣州環凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

EL204分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；TDZ5-WS大容量離心機：湖南湘儀試驗儀器開發有限公司；PHS-3E型pH計：上海雷磁儀器有限公司；759S紫外可見光分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；SPX150生化培養箱：上海精宏試驗設備有限公司；YXQ-LS-50S11立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；VS-1300L-U潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；LRH-250A生化培養箱：韶關市泰宏醫療器械有限公司；DHG-9146A電熱鼓風干燥機：上海精宏試驗設備有限公司；CT3-10K質構儀：廣州市博勒飛粘度計質構儀技術服務有限公司；3nh色差儀：深圳市三恩馳科技有限公司；SHZ-D（III）型循環水真空泵：邦西儀器科技（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑葚花色苷酸奶制備工藝流程及操作要點

操作要點：

用量杯準確量取50 mL純牛奶，將其置于外溫100 ℃的水浴鍋上加熱10 min滅菌，加熱時不定時攪拌，保持純牛奶受熱均勻。滅菌結束后，將定量的桑葚花色苷提取物加入已滅菌的純牛奶中，于100 ℃條件下加熱，結束后冷卻至35 ℃，放入定量菌種攪勻，在恒溫培養箱中發酵一定時間，結束立即置于4 ℃的冰箱后熟12 h，得成品。

1.3.2 桑葚花色苷酸奶發酵條件優化單因素試驗

將前期預試驗的結果分析后，以桑葚花色苷加熱時間1 min、桑葚花色苷添加量4%、白砂糖添加量10%、菌種添加量0.1%、發酵溫度42 ℃、發酵時間8 h為基礎，以感官評分及酸度為考察指標，分別考察桑葚花色苷加熱時間（1 min、2 min、3 min、4 min、5 min）；桑葚花色苷添加量（2%、3%、4%、5%、6%）；白砂糖添加量（6%、8%、10%、12%、14%）；菌種添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）；發酵時間（7.0 h、7.5h、8.0 h、8.5 h、9.0 h）；發酵溫度（38 ℃、40 ℃、42 ℃、44 ℃、46 ℃）對桑葚花色苷酸奶品質的影響。

1.3.3 桑葚花色苷酸奶發酵條件優化正交試驗

在單因素試驗結果的基礎上，設計L9（34）正交試驗，以感官評分為指標，優化桑葚花色苷酸奶的發酵條件，正交試驗因素與水平見表1。

表1 桑葚花色苷酸奶發酵條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of mulberry anthocyanins yogurt

1.3.4 測定方法

桑葚花色苷酸奶感官評價評定：選取經過培訓的專業人員從色澤、香氣、口感、組織狀態4個方面對其進行感官評價，滿分為100分，取每組平均值為最終值。感官評價標準見表2。

表2 桑葚花色苷酸奶感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standards of mulberry anthocyanins yogurt

酸度：參照GB 5009.239—2016《食品安全國家標準食品的酸度測定》中第一法酚酞指示劑法測定。

pH值：參照楊揚[15]的方法，并進行改良，酸度計預熱30 min，校準后，稱取10 g酸奶樣品在pH計下測量酸奶pH值，平行測定3次，取平均值。

DPPH自由基清除率測定：參考文獻[16-17]方法測定。

色差：參照馮子健等[18]的方法，采用色差儀直接測定。以L*、a*、b*值來反映桑葚花色苷酸奶的顏色的變化，每組樣品平行測定3 次，其中L*表示亮度值，a*表示紅綠值，b*表示黃藍值。以白色作為標樣，測量并計算桑葚花色苷酸奶及空白對照組酸奶的ΔL、Δa、Δb和ΔE。ΔE 的計算公式如下：

式中：ΔE、ΔL、Δa、Δb 表示與標樣相比相關數值的變化。

持水力：參照康林芝等[19]的方法。取50 mL離心管稱質量記為m，向50 mL離心管中加入10 g酸奶樣品并稱量酸奶和離心管的總質量記為m1，隨后在室溫下，離心條件為3 000 r/min離心10 min，靜置10 min后，棄去上清液，稱量棄去上清液后離心管與剩余沉淀物的總質量記為m2。酸奶樣品的持水力計算公式如下：

式中：m為空離心管的質量，g；m1為裝有酸乳樣品離心管的質量，g；m2為棄去上清液后離心管與剩余沉淀物的總質量，g。

乳清析出量：參照康林芝等[19]的方法，將桑葚花色苷酸奶成品和空白對照組酸奶在4 ℃條件下放置1 d，測量酸奶總高度記做H，再測量酸奶乳清析出層高度記為h，平行測定3次，代入乳清析出量的計算公式，取平均值，即得酸奶乳清析出量。乳清析出量計算公式如下：

式中：h為酸奶乳清析出層的高度，cm；H為酸奶總的高度，cm。

糖度：參照賴盈盈等[20]的方法，室溫條件下準確稱量10 g酸奶，離心機中5 000 r/min離心10 min，取2滴上清液，用糖度計測量桑葚花色苷酸奶的糖度，同時測量空白對照組酸奶，平行測定3次。

酸奶質構分析：參考胡錦濤等[17，21-22]的方法，用CT3-10K質構儀，選用TA4/1 000探頭，設置條件為觸發點負載5 g，測試、返回的速度為2 mm/s，刺入的深度為20 mm，循環2次。同等條件下，每組樣品平行測定3次以上。

蛋白質：采用考馬斯亮藍G-250法測定酸奶中的蛋白質[23-24]。

活菌數：參照GB 4789.35—2023《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》中的方法測定。

1.3.5 數據處理

采用Excel 2019分析單因素試驗的數據，用正交設計助手設計、分析正交試驗數據，用Origin 2021軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 桑葚花色苷酸奶發酵條件優化單因素試驗

2.1.1 桑葚花色苷加熱時間對桑葚花色苷酸奶品質的影響

由圖1可知，桑葚花色苷加熱時間為1～5 min時，桑葚花色苷酸奶的感官評分呈先上升后下降的趨勢，其中加熱2 min時酸奶的感官評分最高。桑葚花色苷為水溶性色素，因此不完全與牛奶分子緊密結合，使酸奶有少許沉淀，沉淀的多少是影響感官評分的主要因素。桑葚花色苷加熱時間為1～5 min時，桑葚花色苷酸奶酸度呈先上升后趨于平緩的趨勢，其中加熱3 min后無明顯差別。因此綜合考慮，選擇桑葚花色苷加熱時間為2 min進行后續試驗。

圖1 桑葚花色苷加熱時間對桑葚花色苷酸奶品質的影響Fig.1 Effect of heating time of mulberry anthocyanins on quality of mulberry anthocyanins yogurt

2.1.2 桑葚花色苷提取物添加量對桑葚花色苷酸奶品質的影響

由圖2可知，當桑葚花色苷提取物的添加量為2%～6%時，桑葚花色苷酸奶的感官評分呈先上升后下降的趨勢。當桑葚花色苷提取物添加量為2%時，由于添加量較少，嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌能利用好其營養物質，所以酸奶中乳酸菌的發酵得較好，酸奶酸度較高，pH值偏低，酸奶口味偏酸，感官評分偏低；當桑葚花色苷添加量為6%時，由于添加物過多，抑制乳酸菌的生長，因此發酵得較差，酸度較低，甜酸比較差，導致酸奶口感偏差。當桑葚花色苷提取物添加量為4%時，由于桑葚花色苷添加量適當，酸奶的酸度和甜度恰好發揮相當，因此使桑葚花色苷酸奶感官評分最高。孫百虎[25]研究發現，桑葚汁是乳酸菌優良的生長基質，但在相同的桑葚汁中發酵，其接種菌株中嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌的活菌數最低，植物乳桿菌的活菌數量最高因其能夠更好地利用桑葚汁中的營養物質，這與本試驗的研究結果相一致。因此綜合考慮，選擇桑葚花色苷提取物添加量為4%進行后續試驗。

圖2 桑葚花色苷提取物添加量對桑葚花色苷酸奶品質的影響Fig.2 Effect of mulberry anthocyanins addition on quality of mulberry anthocyanins yogurt

2.1.3 白砂糖添加量對桑葚花色苷酸奶品質的影響

由圖3可知，白砂糖添加量為6%～14%時，桑葚花色苷酸奶的感官評分呈先上升后下降的趨勢，酸度呈逐漸降低的趨勢。在白糖添加量為6%時，白糖添加量較少，導致桑葚花色苷酸奶甜味較淡，而乳酸菌不能得到充分的發酵能量，使感官評分較低；白糖添加量為14%時，白糖添加量較多，使得桑葚花色苷酸奶偏甜，酸甜比重失調，導致酸奶的感官品質偏低；白糖添加量為10%時，乳酸菌恰好能利用適宜的碳源量來進行充分發酵，使得桑葚花色苷酸奶酸甜比例恰當，感官評分最高。因此綜合考慮，選擇白砂糖添加量為10%進行后續試驗。

圖3 白砂糖添加量對桑葚花色苷酸奶品質的影響Fig.3 Effect of sugar addition on quality of mulberry anthocyanins yogurt

2.1.4 菌種添加量對桑葚花色苷酸奶品質的影響

由圖4可知，菌種添加量為0.05%～0.25%時，桑葚花色苷酸奶的感官評分呈先上升后下降的趨勢，酸度呈上升趨勢。菌種添加量為0.05%時，乳酸菌過少，產酸過少，不能充分利用糖所提供的能量，使酸奶較稀、偏甜，導致感官評分較低；菌種添加量為0.25%時，乳酸菌的量過多，能充分利用糖所提供的的能量進行發酵，但產酸強，使得酸奶酸度偏高，甜味較淡，從而使其感官評分偏低；菌種添加量為0.10%時，此時菌種所需的能量恰好與糖能提供的能量相當，使得乳酸菌利用適量的糖充分發酵，酸奶的酸甜比適度，從而使得感官評價得分較高。余森艷等[26]研究發現，酸奶中乳酸菌添加量過少，則不利于產酸，酸奶易不成型；乳酸菌添加量過多，產酸過強，導致乳清易析出，口感較澀，這與本試驗的研究結果相一致。因此綜合考慮，選擇菌種添加量為0.10%進行后續試驗。

圖4 菌種添加量對桑葚花色苷酸奶品質的影響Fig.4 Effect of strain addition on quality of mulberry anthocyanins yogurt

2.1.5 發酵時間對桑葚花色苷酸奶品質的影響

由圖5可知，發酵時間為7～9 h時，桑葚花色苷酸奶感官評分呈先上升后下降的趨勢。發酵時間為7 h時，發酵時間較短，導致桑葚花色苷酸奶的質地較稀，同時有少量乳清析出，食用起來產生不佳的愉悅感；酸奶發酵時間為9 h時，此時桑葚花色苷酸奶質地稠，由于發酵時間偏長，酸度偏高，使人食用起來有點偏苦。發酵時間為8 h時，桑葚花色苷酸奶的發酵程度適中，此時酸奶酸甜可口，質地細膩，感官評分最高。張永清[27]發現，酸奶發酵時間短，會使其凝固效果差，發酵時間過長，則酸度越高，乳酸菌活性逐漸下降，使口味發生變化，這與本試驗的研究結果相一致。因此綜合考慮，選擇發酵時間為8 h進行后續試驗。

圖5 發酵時間對桑葚花色苷酸奶品質的影響Fig.5 Effect of fermentation time on quality of mulberry anthocyanins yogurt

2.1.6 發酵溫度對桑葚花色苷酸奶品質的影響

由圖6可知，發酵溫度為38～46 ℃時，桑葚花色苷酸奶的感官評分呈先上升后下降的趨勢，酸度逐漸上升。發酵溫度為38 ℃時，由于發酵溫度整體偏低，乳酸菌發酵緩慢，桑葚花色苷酸奶質地較稀，風味較差，此時桑葚花色苷酸奶的酸度偏低，沒有達到國標規定的酸度（≥70°T），感官評分較低；發酵溫度為42 ℃時，乳酸菌發酵充分，酸甜適中，質地細膩，符合大眾的口味；發酵溫度為44～46 ℃時，發酵體系的溫度較高，導致桑葚花色苷酸奶酸化過快，酸度較高，組織狀態不好，酸奶風味不佳。李思寧等[28]發現，在38 ℃及以下發酵的酸奶，乳酸菌發酵慢，且凝乳效果差；在42 ℃以上溫度發酵的酸奶，發酵速度會加快，但溫度越高，則產酸過快，使酸奶組織狀態粗糙，這與本試驗研究結果相一致。因此綜合考慮，選擇發酵溫度為42 ℃進行后續試驗。

圖6 發酵溫度對桑葚花色苷酸奶品質的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on quality of mulberry anthocyanins yogurt

2.2 桑葚花色苷酸奶發酵條件優化正交試驗

以桑葚花色苷加熱時間（A）、桑葚花色苷提取物添加量（B）、白砂糖添加量（C）、菌種添加量（D）為評價因素，以感官評分為評價指標進行正交試驗，結果見表3。

表3 桑葚花色苷酸奶發酵條件優化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of mulberry anthocyanins yogurt

表4 正交試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表3可知，對桑葚花色苷酸奶品質的影響中主次因素排序為C＞B＞A＞D，由此可得，白砂糖添加量是影響桑葚花色苷酸奶配方工藝的主要因素，其次是桑葚花色苷添加量、桑葚花色苷加熱時間、菌種添加量；由極差分析得出桑葚花色苷酸奶的最佳工藝為A1B2C2D3，即桑葚花色苷提取物加熱時間1 min、桑葚花色苷添加量4%、白砂糖添加量10%、菌種添加量0.15%。在正交試驗確定的最佳發酵條件下進行驗證試驗，桑葚花色苷酸奶感官評分為92分。

2.3 桑葚花色苷酸奶品質分析比較

按照正交試驗確定的最佳發酵條件制作桑葚花色苷酸奶，以相同工藝下不添加桑葚花色苷的酸奶為空白對照，酸奶后熟后對其酸度、pH值、DPPH自由基清除率、色差、持水力、乳清析出量、糖度、質構進行測定，對比桑葚花色苷酸奶和空白對照酸奶的品質，結果見表5、表6。

表5 桑葚花色苷酸奶與空白對照酸奶品質分析比較Table 5 Analysis andcomparison of mulberry anthocyanins yogurt and blank control yogurtquality

表6 桑葚花色苷酸奶與空白對照酸奶質構分析比較Table 6 Analysis and comparison of mulberry anthocyanins yogurt and blank control yogurt texture

由表5可知，桑葚花色苷酸奶的酸度比空白對照酸奶的酸度略低，兩者的酸度均符合國家標準中規定的發酵乳的酸度（≥70°T），pH值比空白對照酸奶pH值高，與所測定的酸度相對應，趨勢正常。兩者酸度、pH比較相近，口感之差主要體現在添加物上。酸奶的色澤是感官評價的主要因素之一。以白色為標樣，ΔE越大，則表示酸奶的顏色變化越大[29]。桑葚花色苷酸奶ΔE變化最大，桑葚花色苷酸奶色澤偏紫紅色，是令人愉悅的顏色，同時桑葚花色苷在合適的酸度內比空白對照的酸奶的甜度稍高，使其感官評分提高。桑葚花色苷酸奶DPPH自由基清除率高達68.6%，而空白對照酸奶DPPH自由基清除率為5%，可見添加桑葚花色苷到酸奶中達到預期的效果，提高了酸奶的抗氧化能力，具有一定的保健價值。持水力是衡量酸奶保持水分強弱的重要依據[30]，持水力的高低，反映了凝固型酸奶的凝乳效果，持水力低，會導致凝乳效果差，乳清容易析出，降低凝固型酸奶的品質。桑葚花色苷酸奶和空白對照酸奶的持水力相當，高達90%以上。其乳清析出量桑葚花色苷酸奶的比空白對照酸奶的要多出0.57%，因其桑葚花色苷為水溶性，在牛奶中有少量沉淀，其乳清較普通酸奶較容易析出。桑葚花色苷酸奶和空白對照酸奶的蛋白質含量相差不大。桑葚花色苷酸奶和空白對照組酸奶的乳酸菌活菌數均符合國家標準（≥1×106CFU/mL）。

質構是評價酸奶的物理性質和感官的重要指標[31]。由表6可知，桑葚花色苷酸奶的硬度、粘性比空白對照酸奶低，因此在口感上空白對照酸奶較桑葚花色苷酸奶黏稠，說明空白對照酸奶較桑葚花色苷酸奶凝膠情況較好，主要原因可能與桑葚花色苷為水溶性色素有關，但其內聚性、彈性兩者相比沒有明顯的差別。

2.4 桑葚花色苷酸奶貯藏期DPPH自由基清除率的變化

由于桑葚花色苷酸奶貯藏14 d后感官上已逐漸趨于較酸，整體口感體驗變差，故本試驗研究桑葚花色苷酸奶在較優的貯藏期（13 d）內DPPH自由基清除率的變化。

由圖7可知，桑葚花色苷酸奶DPPH自由基清除率隨貯藏時間的延長而減小，第1天時DPPH自由基清除率為68.6%，第13天降至55.6%，驗證了桑葚花色苷在低pH條件下有較好的保存效果[4]。

圖7 桑葚花色苷酸奶及空白對照酸奶貯藏期DPPH自由基清除率的變化Fig.7 Changes of DPPH radical scavenging rates of mulberry anthocyanins yogurt and blank control yogurt during storage

3 結論

通過單因素和正交試驗，本試驗確定了桑葚花色苷酸奶的最佳發酵條件為桑葚花色苷加熱時間1 min、桑葚花色苷提取物添加量4%、白砂糖添加量10%、菌種添加量0.15%、發酵時間8 h、發酵溫度42 ℃。在此條件下制得的桑葚花色苷酸奶感官評分為92分，酸度為77.79 T°，pH值為4.47，持水力為93.33%，乳清析出量為0.94%，糖度為19.47°Bx，蛋白質含量為41.98 μg/g，乳酸菌活菌數為1.24×108CFU/mL，DPPH自由基清除率為68.6%，貯藏第13天仍可達到55.6%，說明桑葚花色苷能在酸奶中較好地保存。