參附黃配方對膿毒癥小鼠不同腦區IL-33/ST2軸的影響?

王雪蕊 葉浩然 徐霄龍，3 白云靜，3 王伽伯 劉清泉，3△

（1.首都醫科大學附屬北京中醫醫院，北京 100010；2.中醫感染性疾病基礎研究北京市重點實驗室，北京 100010；3.北京市中醫藥研究所，北京 100010；4.首都醫科大學，北京 100010）

2016 年最新的“國際膿毒癥指南”（Sepsis-3）將膿毒癥定義為宿主應對微生物感染的應答反應失調進而導致的危及生命的多器官功能障礙。指南的不斷更新表明了急診醫學領域對膿毒癥的充分重視及對其不斷的深入研究。即使如此，全球每年每10 萬人中還是約有100 人感染膿毒癥［1］，依然是各大醫院重癥監護病房（ICU）的頭號死因。膿毒癥患者常出現大腦的局灶性或者彌漫性的功能障礙，表現為注意力缺乏、譫妄、昏迷、認知功能的損傷等一系列神經系統癥狀，稱之為膿毒癥相關性腦病（SAE）［2］。SAE 的發生通常在感染癥狀發生之前，ICU 內膿毒癥患者SAE 的發病率高達70%以上［1］。大量臨床研究證實，SAE 是膿毒癥患者發病率增高及死亡率增加的重要原因，同時會造成幸存患者遠期的認知功能障礙［3］。因此，及時有效的預防和治療腦功能障礙對于改善膿毒癥患者的生存率和提高生活質量具有重大的意義。參附黃配方為本課題組學術帶頭人劉清泉教授在“扶正解毒通絡”治則下創制的中藥復方。我們前期研究發現其對SAE 有較好的治療作用［4］，但對膿毒癥小鼠各腦區的神經炎癥是否具有調節作用仍不清楚。本研究旨在觀察參附黃配方對膿毒癥小鼠前額葉皮層和海馬區白細胞介素-33（IL-33）/ST2 軸的影響，為其防治SAE 提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級C57BL/6J 小鼠，雄性，10 周齡，體質量20～23 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2014-0004，使用許可證號：SCXK（京）2015-0023。由北京中醫醫院研究所按純系動物要求專人飼養。本研究經北京市中醫藥研究所實驗動物倫理委員會批準，倫理批號：BJTCM-R-2022-05-01。

1.2 實驗藥物

參附黃配方中藥物均由首都醫科大學附屬北京中醫醫院中藥房提供。組成包括：紅參30 g，制附子60 g，生大黃30 g。煎煮方法如前文獻所述［5］，以濃度1 g/mL 作為實驗用藥，4 ℃冷藏備用，存放時間不超過1個月。

1.3 試劑與儀器

臺式離心機（Allegra X-30R型，美國BECKMAN 公司），酶標儀（ELx808 型，美國Biotek 公司），移液器（Eppendorf生命科學公司），Milipore 純水儀（法國Mili?pore 公司）。小鼠IL-33（MM-0935M1）、ST2（MM-1070M2）酶聯免疫標記法（ELISA）試劑盒均為江蘇酶免實業有限公司產品。

1.4 分組及造模

動物根據隨機數字表法分為對照組、膿毒癥組和參附黃組，其中對照組10 只，膿毒癥組和參附黃組各20 只。膿毒癥組和參附黃組進行盲腸結扎打孔復制膿毒癥模型［6］，對照組進行假手術操作。術后小鼠背部注射1 mL生理鹽水防休克，自由進食、進水。

1.5 給藥方法

參附黃組于造模后4 h 開始給予2.5 g/kg 參附黃配方灌胃，灌胃體積0.5 mL；膿毒癥組和對照組給予0.5 mL純凈水灌胃，均每日2次。

1.6 標本采集與檢測

1.6.1 臨床指數 根據文獻［7-8］，對膿毒癥小鼠進行臨床指數測定，每一項參數如有變化得1分，最多12分。觀察參數：豎毛、腹部扭動、減少體溫、糞便變化（如腹瀉）、流淚、眼瞼閉合、低運動量活動、體溫（低于35 ℃，得分1）、反射性逃避觸摸、自發活動變化、握力下降和呼吸心率變化（過度換氣）。

1.6.2 神經功能指數 根據文獻［9］評估膿毒癥小鼠神經功能指數。觀察參數包括：耳郭反射、角膜反射、翻正反射、屈尾反射和脫逃反應。得分“0”表示無反射，“1”表示反射減弱，“2”表示反射正常。每只小鼠最多可以得到10 分，分數越低，意味著大腦中的神經損傷越嚴重。

1.6.3 腦組織炎癥因子蛋白水平 CLP 造模后48 h，麻醉動物后進行斷頭處死，取腦組織放于冰盒上并迅速分離前額葉皮層和海馬組織，經液氮快速冷凍后轉入-80 ℃保存。采用ELISA 法參照試劑盒步驟對腦組織中IL-33和ST2的水平進行檢測。

1.7 統計學處理

2 結 果

2.1 各組小鼠臨床指數比較 見表1。與對照組相比，膿毒癥組CLP術后24、48 h的臨床指數均顯著升高（P＜0.05）；與膿毒癥組相比，參附黃組的臨床指數在CLP 術后24、48 h 均顯著下調（P＜0.05）。參附黃配方對CLP術后小鼠的臨床表現具有一定改善作用。

表1 各組小鼠臨床指數評分比較（分，±s）

表1 各組小鼠臨床指數評分比較（分，±s）

注：與膿毒癥組比較，?P ＜0.05；與參附黃組比較，△P ＜0.05。下同。

組 別對照組膿毒癥組參附黃組48 h 0.0±0.0 8.4±2.2*6.1±2.5△n 10 20 20 24 h 0.0±0.0 10.4±1.6*7.2±1.9△

2.2 各組小鼠神經功能指數比較

見表2。與對照組相比，膿毒癥組24、48 h的神經功能指數均顯著降低（P＜0.05）；與膿毒癥組相比，參附黃組的神經功能指數在24、48 h均顯著升高（P＜0.05）。參附黃配方對CLP術后小鼠的神經功能具有一定改善作用。

表2 各組小鼠神經功能指數比較（分，±s）

表2 各組小鼠神經功能指數比較（分，±s）

組 別對照組膿毒癥組參附黃組n 10 20 20 24 h 9.4±0.5 5.6±0.8*7.8±1.1△48 h 10.0±0.0 6.9±1.3*8.1±0.9△

2.3 各組小鼠前額葉皮層和海馬區IL-33/ST2 軸蛋白表達比較

見表3。與對照組相比，膿毒癥組小鼠前額葉皮層和海馬區IL-33和ST2蛋白表達顯著增高（P＜0.05）；與膿毒癥組相比，參附黃組小鼠前額葉皮層和海馬區IL-33蛋白表達顯著增高（P＜0.05），ST2蛋白表達顯著降低（P＜0.05）。提示參附黃配方對膿毒癥小鼠的神經功能改善作用可能與IL-33/ST2通路有關。

表3 各組小鼠前額葉皮層和海馬區IL-33和ST2蛋白表達比較（±s）

表3 各組小鼠前額葉皮層和海馬區IL-33和ST2蛋白表達比較（±s）

組 別對照組（n=10）膿毒癥組（n=20）參附黃組（n=20）前額葉皮層海馬區前額葉皮層海馬區前額葉皮層海馬區IL-33（pg/mg）1 123.4±79.9 1 693.9±115.2 1 756.6±302.2*2 321.7±322.5*2 213.3±299.8△2 889.6±309.2△ST2（ng/mg）27.8±1.9 19.0±1.3 48.7±7.1*31.9±4.2*37.9±6.2△24.5±6.7△

3 討 論

由于神經內分泌系統和腦結構受損，膿毒癥患者在急性期、恢復期及出院后常伴有認知功能障礙等SAE 癥狀［10］。SAE 發病的病理生理機制極為復雜：內皮細胞/小膠質細胞激活、血腦屏障通透性增加、缺氧、神經遞質失衡、神經膠質激活、軸突和神經元丟失等原因引起的神經炎癥是導致SAE 發生發展的主要機制［11］。膿毒癥發生時，病原微生物刺激或組織損傷會募集大量天然免疫細胞，釋放炎性介質和細胞因子，發揮免疫效應。SAE 血腦屏障受損，使得外周免疫細胞和炎癥因子、細菌壁成分等遷移入大腦，激活小膠質細胞、星型膠質細胞等免疫細胞引起中樞神經炎癥反應和氧化應激［12］。SAE 可能導致廣泛的中樞神經系統損傷，影響海馬、邊緣系統、額葉皮質和腦干等腦區，尤其是內側顳葉和額葉皮層的變化，被推測與SAE患者認知水平下降密切相關［2］。神經影像學研究也表明，SAE 患者出現海馬體、杏仁核和皮層的體積減小［13］。既往研究證實，抑制神經炎癥，如抑制促炎細胞因子白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子（TNF）的表達，可以顯著減輕SAE 后的神經功能障礙［2，11］。針對SAE 發病率高、發病機制復雜的情況，研發針對其病理生理過程的治療藥物具有重要的臨床意義。

中醫學認為膿毒癥屬于“熱病”，SAE 患者出現神志癥狀，可歸屬“神昏”范疇。腦為元神之府，由于邪氣亢盛，正氣漸衰，無力抗衡，故元神受損，熱、瘀、痰等病理產物蒙閉清竅而出現認知功能減退等癥狀，歸納其病機為正虛毒損、絡脈瘀滯［14］。參附黃配方是本團隊在“扶正解毒通絡”治則下創制的代表方，以人參為君，附子和大黃共為臣藥。人參大補元氣，《名醫別錄》中記載，人參可“通血脈、破堅積、令人不忘”；附子大辛大熱，純陽燥烈，能速回散失元陽于須臾，力挽厥脫之危候于俄頃，有“回陽救逆第一品藥”之稱；大黃乃蕩滌之將軍，推陳出新，能夠泄下因膿毒癥所致之瘀熱毒邪積聚，確有一瀉而解之功。正如明代張景岳贊譽大黃具有尖銳攻擊，無堅不摧之力，斬關奪將，犁庭掃穴之能，能祛邪止暴，撥亂反正，定禍亂而致太平，故名之曰“將軍”。參得附子、大黃補而不滯，益氣通陽而無留瘀之弊；附子、大黃得人參則扶正祛邪而無傷正之虞；大黃得人參和附子，其苦寒不致留滯陰邪；人參、附子得大黃，其燥熱不致劫陰傷津。3 藥共奏扶正解毒通絡之功。我們前期研究證實，本方對改善膿毒癥小鼠空間學習記憶障礙、增強突觸可塑性、降低氧化應激方面具有較好的療效［4-5］。在本研究中，我們采用臨床癥狀分級和神經功能分級評價該方對膿毒癥小鼠的治療作用，發現其對改善膿毒癥后動物臨床體征，尤其是神經功能體征具有較好的療效。

IL-33 是一種前炎癥細胞因子，屬于白細胞介素-1（IL-1）免疫球蛋白家族的新成員。IL-33 幾乎表達于所有組織，其中中樞神經系統是表達IL-33 最高的組織，尤其是小膠質細胞，是人類和小鼠IL-33 的重要來源［15］。ST2 是IL-33 的受體，主要包括可溶型ST2（sST2）和跨膜型ST2（ST2L）。ST2L 與IL-1 受體輔助蛋白組成異源二聚體，與IL-33 結合可激活IL-33/ST2 軸，調節NF-κB 和MAPK 信號通路，介導免疫調節功能，尤其是促進Th2 型免疫應答［16］。sST2 是IL-33 的誘騙受體，可競爭性地與IL-33 結合從而發揮抑制IL-33/ST2 信號轉導的作用。近年來IL-33 已作為一種新型治療靶標，通過誘導IL-10 等抑炎因子，對癡呆、神經系統后遺癥、創傷性腦損傷等認知功能異常相關疾病發揮治療作用［16-18］。既往多項研究也明確了IL-33 對CLP 膿毒癥小鼠的治療作用［19-20］：IL-33 可以通過上調趨化因子受體表達，促進中性粒細胞的遷移從而降低CLP 小鼠死亡率。我們前期采用多因子固相芯片篩選200 種具有重要功能的細胞因子，發現參附黃配方可顯著上調膿毒癥小鼠腦組織IL-33 的蛋白表達，提示參附黃配方可能通過特異性調節IL-33 發揮治療作用。在本研究中，我們發現參附黃配方對膿毒癥小鼠多個腦區中IL-33 和ST2 的蛋白表達具有影響，可上調前額葉皮層和海馬區IL-33表達，同時降低ST2 表達。在本研究中，ELISA 檢測無法確定ST2 受體類型，但是根據既往文獻報道，sST2作為損傷發生后的標志物，與多種疾病的預后呈負相關［21-22］。據此，我們推測參附黃配方改善膿毒癥認知功能障礙的機制可能與增加多個腦區IL-33 的表達，同時降低sST2 的表達有關。

但是，參附黃配方調節哪種細胞來源的IL-33，對Th2 型免疫應答和下游信號通路的具體影響，以及IL-33/ST2 軸在參附黃配方改善SAE 認知功能障礙中的特異性作用，仍有待未來進一步闡明。