扶正透邪解毒化瘀方對(duì)多重耐藥銅綠假單胞菌肺炎老年大鼠炎癥損傷的影響?

劉鳳儀 徐紅日 林 英 馬 潔 馬洪皓曹鴻云于 淼張路遙李 鷗 李 瑩

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700；4.北京中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，北京 100038）

多重耐藥銅綠假單胞菌（MDRPA）肺炎患者病情重且變化快、病死率高［1］，尤其機(jī)體免疫力差、接受較多侵入性操作的老年患者［2］，是臨床上較為棘手的治療難題。MDRPA 可通過生物膜、群體感應(yīng)系統(tǒng)、外排泵等耐藥機(jī)制［3］降低對(duì)抗菌藥物的敏感性，使得細(xì)菌清除率下降，進(jìn)而引發(fā)持續(xù)級(jí)聯(lián)瀑布效應(yīng)，出現(xiàn)免疫炎性損傷，最終造成多器官功能障礙而死亡。隨著相關(guān)臨床研究的開展［4-5］，中醫(yī)藥及其聯(lián)合抗菌藥物治療耐藥菌肺炎表現(xiàn)出較大優(yōu)勢(shì)。針對(duì)老年人耐藥菌肺炎“正氣虧虛，熱毒壅盛，痰瘀互結(jié)”的基本病機(jī)［6］，本研究采用治療老年患者肺炎療效顯著的扶正透邪解毒化瘀方探索對(duì)MDRPA 肺炎大鼠炎性損傷的干預(yù)作用，為中西醫(yī)結(jié)合治療MDRPA 肺炎提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD老年大鼠，雌雄各半，20～22月齡，共348 只，雄性大鼠體質(zhì)量700～800 g，雌性大鼠體質(zhì)量400～500 g，購(gòu)自湖北省疾病預(yù)防控制中心，合格證號(hào)：SCXK（鄂2015-0018）。大鼠飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所生物安全實(shí)驗(yàn)室，倫理編號(hào)為20162019。

1.2 試藥與儀器 扶正透邪解毒化瘀方藥物組成：黃芩15 g，連翹15 g，漏蘆15 g，瓜蔞30 g，西洋參6 g，敗醬草30 g，生薏苡仁30 g，生黃芪15 g 等。中藥飲片由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中藥房提供，采用水煎劑，中藥提取液濃度為1.4 g/mL，由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院制備。注射用頭孢他啶（凱復(fù)定）（規(guī)格：1 g/瓶，Antibioticos do Brasil Ltda，批號(hào)：106516C）。實(shí)驗(yàn)菌株為MDRPA 臨床分離株，編號(hào)：1607106，由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院細(xì)菌室提供。試劑：麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司），大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒（深圳欣博盛生物科技有限公司），白細(xì)胞介素-10（IL-10）ELISA 試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司），4%多聚甲醛（北京索萊寶科技有限公司），4%戊二醛固定液（北京索萊寶科技有限公司），丙酮（國(guó)藥集團(tuán)）。儀器：LHS-250 HC-11 恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），MULTISKAN MK3全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技有限公司），HistoStar 組織包埋機(jī)（賽默飛世爾科技有限公司），Excelsior ES 全自動(dòng)組織脫水機(jī)（賽默飛世爾科技有限公司），BX-51 正置熒光顯微鏡（奧林巴斯），EM UC6 超薄切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司），H-7650 透射電鏡（日本Hitachi 公司）。

1.3 分組與造模 采用經(jīng)口氣管插管法制備MDRPA肺炎模型，實(shí)驗(yàn)菌濃度設(shè)定為9.753×108cfu/mL，按500 g 大鼠體表面積給菌200 μL 計(jì)算給菌量，空白對(duì)照組給予生理鹽水。分組：將大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、西藥組、中藥組、中藥提前給藥組（中提組）、中西醫(yī)結(jié)合治療組（中西組）。

1.4 干預(yù)方法 空白組、模型組均給予0.9%氯化鈉溶液灌胃，每日2 次；西藥組和中西組給予注射用頭孢他啶（180 mg/kg）肌肉注射，每日3 次；中藥組、中提組、中西組給予中藥提取液（1.4 g/mL）灌胃，每日2次。中提組在造模前3 d 開始灌胃。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）計(jì)算死亡保護(hù)率、生命延長(zhǎng)率：60 只大鼠隨機(jī)分為上述6 組，每組10 只，雌雄各半，觀察各組動(dòng)物的精神活動(dòng)狀況和死亡情況。死亡率（%）=死亡數(shù)量（只）÷感染前總數(shù)量（只）×100%；死亡保護(hù)率（%）=（模型組死亡率-實(shí)驗(yàn)組死亡率）÷模型組死亡率×100%；平均生活日=同組內(nèi)每只動(dòng)物生存日數(shù)之和÷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)；生命延長(zhǎng)率（%）=（實(shí)驗(yàn)組平均存活天數(shù)-模型對(duì)照組平均存活天數(shù)）÷模型對(duì)照組平均存活天數(shù)×100%。2）檢測(cè)血清TNF-α、IL-10 水平：288 只大鼠隨機(jī)分為上述6 組，每組各48只，雌雄各半，各組按時(shí)間點(diǎn)又分為造模后2 h、6 h、1 d、3 d、5 d、7 d，共6 個(gè)亞組，每個(gè)亞組8 只。各組分別于上述各時(shí)間點(diǎn)取血清，按照ELISA 試劑盒說明書測(cè)定血清炎癥因子TNF-α、IL-10 水平。3）觀察靶器官肺組織炎癥損傷情況：大鼠麻醉后取正中線切口打開胸腔，取出全肺，在光鏡下觀察HE 染色后的肺組織變化情況。選取感染后第3 日，即肺組織損傷最嚴(yán)重時(shí)的肺組織，進(jìn)行醋酸鈾-檸檬酸鉛染色，通過電鏡對(duì)肺泡結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，計(jì)數(shù)資料以“n、%”表示。對(duì)于多組計(jì)量資料，在符合正態(tài)分布、方差齊時(shí)采用單因素方差分析檢驗(yàn)組間以及組內(nèi)差異，不符合正態(tài)分布時(shí)采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠的死亡保護(hù)率和生命延長(zhǎng)率比較 見表1。造模后觀察7 d，空白組大鼠精神活動(dòng)正常，無(wú)死亡。其他各組均出現(xiàn)不同程度的精神萎靡，活動(dòng)減少，進(jìn)食水減少。結(jié)合模型組死亡率90%計(jì)算，中提組、中西組有著較高的死亡保護(hù)率。結(jié)合模型組平均生活天數(shù)2.5 d 計(jì)算，中提組生命延長(zhǎng)率最高，中西組次之。

表1 各組大鼠死亡保護(hù)率及生命延長(zhǎng)率比較

2.2 各組大鼠血清TNF-α 表達(dá)比較 見表2。與模型組比較，西藥組在感染后2 h 血清TNF-α 水平降低且有顯著差異（P＜0.01），中藥組在感染后2 h、3 d 血清TNF-α 水平降低且有顯著差異（P＜0.01），中提組、中西組在感染后2 h、1 d、3 d 血清TNF-α 水平降低且有顯著差異（P＜0.01）。組間比較，在感染后1 d，中西組血清TNF-α 水平低于西藥組、中藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在感染后3 d，中藥組、中提組、中西組血清TNF-α 水平低于西藥組，且有明顯差異（P＜0.05）。

表2 各組大鼠不同時(shí)相血清TNF-α表達(dá)的比較（pg/mg，±s）

表2 各組大鼠不同時(shí)相血清TNF-α表達(dá)的比較（pg/mg，±s）

注：與空白組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；與模型組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01；與西藥組比較，?P ＜0.05，??P ＜0.01；與中藥組比較，☆P ＜0.05，☆☆P ＜0.01；與中提組比較，◇P ＜0.05，◇◇P ＜0.01。下同。

組別空白組模型組西藥組中藥組中提組中西組n8 8 8 8 8 8 2 h 57.418±2.233 74.373±5.421△57.776±3.825▲▲57.081±8.037▲▲55.650±5.354▲▲56.864±3.887▲▲n8 7 7 7 7 7 6 h 55.428±2.123 72.562±16.613 65.081±8.312 55.353±11.039 55.808±10.076 61.295±17.224 n8 7 7 7 7 7 1 d 56.431±2.112 81.219±11.153△58.995±6.828 59.753±4.523 52.764±4.613▲▲46.846±4.496▲▲*☆n8 7 7 7 7 7 3 d 55.461±2.553 67.336±15.592 57.495±4.620 43.732±8.313△▲▲*42.292±10.335△▲▲*44.255±1.096△▲▲*n8 6 7 7 7 7 5 d 56.498±2.313 52.276±13.633 49.106±7.931 46.648±9.054 40.587±6.419 40.849±5.943 n8 6 6 6 6 6 7 d 56.411±2.323 52.382±6.813 52.649±16.608 48.888±11.180 40.587±4.443 43.340±9.156

2.3 各組大鼠血清IL-10 表達(dá)比較 見表3。與模型組比較，西藥組、中藥組在感染后6 h、1 d血清IL-10水平明顯升高（P＜0.05），中提組在感染后2 h、6 h、1 d 血清IL-10 水平明顯升高（P＜0.05），中西組在感染后2 h、6 h、1 d、3 d 血清IL-10 水平升高，有顯著差異（P＜0.05）。組間比較，在感染后第1 日，中提組、中西組血清IL-10 水平高于中藥組、西藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在感染后第5 日，中提組血清IL-10 水平顯著高于中藥組、西藥組、中西組（P＜0.05）。

表3 各組大鼠不同時(shí)相血清IL-10表達(dá)的比較（pg/mg，±s）

表3 各組大鼠不同時(shí)相血清IL-10表達(dá)的比較（pg/mg，±s）

組別空白組模型組西藥組中藥組中提組中西組n8 8 8 8 8 8 2 h 48.667±1.101 32.315±8.519△30.598±9.474△43.215±9.598 61.929±13.800▲▲*☆54.440±15.081▲▲*n8 7 7 7 7 7 6 h 48.697±1.102 33.746±7.852△48.672±8.207▲48.959±7.057▲63.358±5.652△▲▲*☆50.406±12.909▲▲◇n8 7 7 7 7 7 1 d 48.367±1.121 26.472±3.537△△39.483±9.100△▲▲46.083±6.297▲▲59.818±3.637△△▲▲*☆60.761±4.835△△▲▲*☆☆n8 7 7 7 7 7 3 d 48.567±1.201 30.379±16.430 21.149±5.154△50.319±21.267*45.476±6.749 59.539±7.141▲*n8 6 7 7 7 7 5 d 48.687±1.201 33.479±11.415 32.976±7.593 40.138±12.832 40.132±14.551 53.861±25.439 n8 6 6 6 6 6 7 d 48.669±1.191 36.059±4.432 31.051±13.955 32.947±16.468 34.466±20.463 42.119±25.520

2.4 各組大鼠肺組織微觀病變的觀察 見圖1、圖2。MDRPA 感染后2 h、6 h、1 d，各藥物干預(yù)組細(xì)支氣管及血管周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡結(jié)構(gòu)破壞程度均較模型組輕，中提組和中西組肺間質(zhì)充血水腫，程度較西藥組和中藥組輕。MDRPA 感染后3 d，模型組肺組織炎癥表現(xiàn)最重，支氣管管腔及肺泡內(nèi)可見大量出血，肺泡結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重。藥物干預(yù)組炎癥較模型組稍輕，西藥組、中藥組、中提組組間差異不明顯，支氣管周圍環(huán)狀炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡結(jié)構(gòu)破壞；中西組存在少許炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡結(jié)構(gòu)破壞不明顯，部分肺泡內(nèi)有漿液性滲出及紅細(xì)胞。MDRPA 感染后5 d、7 d，模型組支氣管上皮細(xì)胞脫落，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺間質(zhì)充血水腫。藥物干預(yù)組炎癥呈減輕趨勢(shì)，中提組和中西組肺組織炎癥較其他各組輕，肺泡結(jié)構(gòu)破壞不明顯。

圖1 各組大鼠肺支氣管病理觀察（HE染色，200倍）

圖2 各組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)觀察（HE染色，200倍）

2.5 各組大鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)的觀察 見圖3。在感染后第3 日，空白組肺泡壁均勻完整，肺泡毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)完整，Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)可見豐富板層小體。模型組肺泡壁增厚，肺泡毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞腫脹，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)板層小體增生、有明顯排空跡象。相較模型組，西藥組鏡下表現(xiàn)無(wú)明顯差異；中藥組、中提組Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)板層小體排空減少，中西組無(wú)明顯排空；中藥組肺泡腔偶見紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，中提組肺泡腔未見炎性浸潤(rùn)，中西組肺泡腔偶見巨噬細(xì)胞。

圖3 各組大鼠肺泡超微結(jié)構(gòu)的觀察（醋酸鈾-檸檬酸鉛染色）

3 討 論

銅綠假單胞菌（PA）作為下呼吸道感染常見病原體，西醫(yī)治療上首選具有抗假單胞菌活性的β-內(nèi)酰胺類藥物［7］。但由于抗菌藥物使用不規(guī)范，PA 對(duì)多種藥物的耐藥率持續(xù)保持較高水平［8］。而年齡≥65 歲的患者因基礎(chǔ)疾病相對(duì)較多，疾病抵抗能力差，成為耐藥菌肺炎的高發(fā)人群［9-10］。因此，老年MDRPA 肺炎的抗菌藥物選擇面更窄，治療效果相對(duì)較差，病死率更高。

老年MDRPA 肺炎屬于中醫(yī)“喘證”“風(fēng)溫肺熱病”等范疇。臨床上，各家結(jié)合病因病機(jī)擬定治法方藥，同時(shí)結(jié)合西醫(yī)常規(guī)治療取得較好療效［11-12］。本研究團(tuán)隊(duì)針對(duì)老年耐藥菌肺炎“正氣虧虛、熱毒熾盛、痰瘀互結(jié)”的基本病機(jī)，擬定扶正透邪解毒化瘀方。方中黃芪、當(dāng)歸、西洋參益氣養(yǎng)陰，調(diào)和氣血；連翹、金銀花取銀翹散之意，辛涼解表，透邪外出；黃芩、漏蘆、瓜蔞取小陷胸湯之意，清熱解毒，滌痰寬胸；薏苡仁取千金葦莖湯之意，上清肺熱，下利胃腸；當(dāng)歸、赤芍、敗醬草活血散瘀。諸藥合用，在臨床獲得較好療效。

PA 侵犯人體呼吸道后，單核/巨噬細(xì)胞分泌大量TNF-α 趨化免疫細(xì)胞，引起級(jí)聯(lián)免疫反應(yīng)［13］，但過強(qiáng)的炎癥反應(yīng)會(huì)引起機(jī)體損傷，而IL-10 能夠抑制抗原提呈和T 細(xì)胞的激活，負(fù)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)［14］。本研究結(jié)果表明中西醫(yī)結(jié)合治療組、中藥提前給藥組在感染后第1、3日可明顯降低血清TNF-α水平，并升高血清IL-10 水平，且中西醫(yī)結(jié)合治療組療效優(yōu)于西藥組，可明顯減輕感染極期病情嚴(yán)重階段的肺組織炎癥損傷，減輕支氣管及血管周圍炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)、肺間質(zhì)的充血水腫和肺泡結(jié)構(gòu)的破壞。

Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞板層小體內(nèi)含有表面活性物質(zhì)，該物質(zhì)通過胞吐的形式分泌并鋪展于肺泡內(nèi)面以維持肺泡的穩(wěn)定性［15-16］，因此板層小體的排空情況反映了機(jī)體為防止肺泡塌陷而進(jìn)行的代償。本研究在感染后第3 日即炎癥損傷最嚴(yán)重時(shí)進(jìn)行了肺組織電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)該方可減少Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)板層小體的排空，中西醫(yī)結(jié)合治療組效果最佳，這與光鏡下觀察到的肺組織病變情況一致。

老年大鼠空白組肺組織切片可見支氣管上皮細(xì)胞少許脫落、支氣管周圍及肺泡少許炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，提示氣道黏膜的保護(hù)力下降，存在慢性炎癥狀態(tài)。通過中藥提前干預(yù)，在感染后炎癥早期，老年大鼠IL-10 明顯高于其他組別，避免了過強(qiáng)的炎癥反應(yīng)。因此，中藥提前給藥組在感染前針對(duì)正氣虧虛進(jìn)行未病先防，在感染后針對(duì)熱毒熾盛、痰瘀互結(jié)進(jìn)行既病防變的治療策略可對(duì)老年大鼠產(chǎn)生有效的保護(hù)和治療作用，提高生命延長(zhǎng)率，改善預(yù)后。

綜上所述，扶正透邪解毒化瘀方聯(lián)合頭孢他啶治療老年大鼠MDRPA 肺炎，可降低血清TNF-α 水平、升高IL-10 水平，減輕肺組織炎癥損傷，提高死亡保護(hù)率和生命延長(zhǎng)率。這為臨床上運(yùn)用中西醫(yī)結(jié)合療法治療老年人MDRPA 肺炎提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究中所觀察的炎癥因子處于信號(hào)通路的下游階段，其調(diào)節(jié)的具體機(jī)制有待進(jìn)一步探索。