黃芪建中湯對脾胃虛寒證胃潰瘍大鼠炎癥因子及HGF/c-Met信號通路的影響?

韓運(yùn)宗 陳思清 劉 琴 周 姝 藺曉源 周賽男

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

胃潰瘍是人群中常見的消化系統(tǒng)疾病，患病率高［1］。當(dāng)胃黏膜的保護(hù)性因素和侵襲性因素之間不平衡時(shí)，就會發(fā)生胃潰瘍［2］。其病理特征是胃黏膜和黏膜下層被破壞損傷，可侵犯漿膜層甚至血管，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致出血［3］。胃黏膜損傷是引起胃潰瘍的直接原因。目前西醫(yī)治療胃潰瘍以藥物為主，主要包括抑酸藥、黏膜保護(hù)劑、根除HP 治療等。其中質(zhì)子泵抑制劑（PPI）是使用最廣泛的一類藥物［4］，但有研究表明長期使用PPI 可能與一些疾病的發(fā)生有關(guān)，如心血管疾病［5］、骨質(zhì)疏松癥［6］、艱難梭菌結(jié)腸炎［7］等。中藥治療該病有療效確切、安全性高的特點(diǎn)［8］。胃潰瘍的典型表現(xiàn)是周期性和節(jié)律性的上腹部疼痛、反酸，可歸屬于中醫(yī)“胃痛”“嘈雜”“胃瘍”范疇［9］。《金匱要略》中最早有黃芪建中湯的記載，其作用是溫中健脾、和胃止痛，在臨床上可治療脾胃虛寒證胃潰瘍。研究證實(shí)黃芪建中湯可促進(jìn)胃黏膜的修復(fù)愈合［10］，但具體機(jī)制尚不明確。有研究報(bào)道［11］，在胃潰瘍邊緣組織可發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞生長因子（HGF）含量增高，HGF 具有促進(jìn)多種細(xì)胞增殖的作用，肝細(xì)胞生長因子受體（c-Met）是HGF 特異性受體。筆者觀察黃芪建中湯對脾胃虛寒證胃潰瘍大鼠炎癥因子及HGF/c-Met信號通路的影響，并研究其機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF 級雄性成年大鼠60 只，體質(zhì)量（200±10）g，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物合格證號：SCXK（湘）2019-0004。正常飼養(yǎng)7 d 后開始造模。飼養(yǎng)溫度24～26 ℃，濕度50%～70%。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

黃芪建中湯：黃芪22 g，白芍18 g，桂枝9 g，炙甘草6 g，生姜9 g，大棗6 枚（擘），飴糖30 g，均購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診中藥房。中藥湯液制備方法：常規(guī)煎煮后去渣，濾出藥液，加熱濃縮至1 g/mL，待冷卻后置于4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｐ〕袣鉁捍簏S12 g，厚樸6 g，枳實(shí)9 g，均購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診中藥房。制備方法同黃芪建中湯，濃縮至1 g/mL，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩W美拉唑腸溶膠囊（阿斯利康制藥有限公司，批號02002750），用雙蒸水配制成含藥量為0.208 mg/mL的混懸液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 試劑與儀器

腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）；白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）；白細(xì)胞介素-6（IL-6）試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）；mRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（中國北京康為世紀(jì)公司）；miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（中國北京康為世紀(jì)）；抗HGF抗體（美國abcam）；抗c-Met抗體（美國Proteintech）；Trizol（美國Thermo）。臺式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，貨號：H1650R）；多功能酶標(biāo)分析儀（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司，貨號：MB-530）；熒光定量RCP 儀（美國Thermo，貨號：QuantStudio1）；電泳儀（中國北京六一，貨號：DYY-2C）；水平瓊脂糖電泳槽（中國北京六一，貨號：DYCP-31DN）；搖床（其林貝爾，貨號：TS-92）；恒溫箱（北京六一，貨號：DYY-6C）；切片刀（萊卡，貨號：M199）；切片機(jī)（浙江金華益迪試驗(yàn)器材，貨號：YD-315）；包埋機(jī)（常州中威電子儀器，貨號：BMJ-A）；顯微鏡（Motic，貨號：BA210T）。

1.4 分組與造模

將60只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成4組，即正常組、模型組、奧美拉唑組、黃芪建中湯組，每組15 只。正常組隔日蒸餾水灌胃，劑量10 mL/（kg·d），每日不限飲食。其余各組首先以小承氣湯為致虛藥，用耗氣破氣法結(jié)合饑飽失常法復(fù)制大鼠脾胃虛寒模型［12］。小承氣湯以10 g/（kg·d）劑量進(jìn)行灌胃，隔日1次，灌胃當(dāng)日禁食，次日不限飲食，共計(jì)10 d。隨后禁食不禁水24 h，于第11日用國際公認(rèn)的冰醋酸法建立大鼠胃潰瘍模型［13］。

1.5 干預(yù)方法

造模后模型組繼續(xù)隔日上午給予致虛藥并當(dāng)日禁食，次日恢復(fù)飲食，共持續(xù)20 d。治療組大鼠在模型組基礎(chǔ)上每日下午予治療藥物［奧美拉唑4.2 mg/（kg·d），黃芪建中湯6.8 g/（kg·d）］。正常組隔日上午及每日下午蒸餾水灌胃。各組灌胃劑量均為10 mL/（kg·d）［12］。

1.6 檢測指標(biāo)及方法

1.6.1 一般情況 每日觀察大鼠的精神狀態(tài)、姿勢、皮毛色澤、活動度、對束縛的反應(yīng)性、眼裂黏膜色澤、耳郭色澤以及糞便等全身情況。大鼠體質(zhì)量增長情況測量：實(shí)驗(yàn)開始后隔日上午7∶00 用電子秤稱量大鼠體質(zhì)量，并根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥量。計(jì)算各組大鼠體質(zhì)量增長情況并進(jìn)行比較。

1.6.2 評估胃黏膜損傷潰瘍指數(shù) 參照Guth標(biāo)準(zhǔn)［14］：斑點(diǎn)狀糜爛＜1 mm 為1 分；糜爛長度1～2 mm 為2 分；糜爛長度2～3 mm 為3 分；糜爛長度3～4 mm 為4 分；依次類推。寬度＞2 mm 時(shí)分值×2，最后以全胃病灶分?jǐn)?shù)總和計(jì)算Guth評分。

1.6.3 HE 染色 觀察胃黏膜形態(tài)計(jì)算胃黏膜潰瘍評分后，將胃部組織進(jìn)行固定，經(jīng)過脫蠟、染色、脫水、封片等步驟后，行4 μm 切片，對切片進(jìn)行HE 染色，封片后顯微鏡下觀察胃黏膜形態(tài)。

1.6.4 ELISA法檢測血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平 全血標(biāo)本離心后取上清液進(jìn)行檢測，分別使用IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA 試劑盒，按照說明書操作，經(jīng)過加樣、溫育、加酶標(biāo)試劑、顯色等步驟，用酶標(biāo)儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度。

1.6.5 PCR檢測胃組織HGF、c-Met mRNA的表達(dá) Trizol 法提取組織細(xì)胞總RNA，以組織總mRNA 為模板，逆轉(zhuǎn)錄cDNA。設(shè)計(jì)引物序列由上海生工公司合成，詳見表1。95 ℃預(yù)變性10 min，隨后進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)：95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸30 s。采用2-ΔΔCt進(jìn)行RNA相對表達(dá)量分析。

表1 RT-qPCR引物序列

1.6.6 免疫組化檢測胃組織HGF、c-Met 表達(dá) 取胃組織切片脫蠟至水，浸入枸櫞酸鹽緩沖液，加熱至沸騰后，冷卻至室溫，PBS 洗滌3 次；加入1%高碘酸，滅活內(nèi)源性酶，PBS 沖洗3 次；滴加稀釋的一抗（1∶50），4 ℃過夜，PBS 沖3 次；滴加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS 沖洗3 次；滴加顯色劑DAB 工作液，室溫孵育顯色；脫水后中性樹膠封片，顯微鏡觀察并測量平均光密度（MOD）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量比較

見表2。造模前各組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；經(jīng)造模及相應(yīng)藥物處理后，與正常組比較，模型組、黃芪建中湯組、奧美拉唑組大鼠體質(zhì)量明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪建中湯組、奧美拉唑組大鼠體質(zhì)量明顯升高（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)前后各組大鼠體質(zhì)量增長量相比，與正常組比較，模型組、黃芪建中湯組、奧美拉唑組大鼠體質(zhì)量增長值明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪建中湯組、奧美拉唑組大鼠體質(zhì)量增長值明顯升高（P＜0.05）。黃芪建中湯組各指標(biāo)與奧美拉唑組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

表2 各組大鼠體質(zhì)量比較（g，±s）

表2 各組大鼠體質(zhì)量比較（g，±s）

注：與正常組比較，?P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05。下同。

組 別正常組模型組奧美拉唑組黃芪建中湯組n3 3 3 3處理前體質(zhì)量263.90±6.22 263.97±6.64 264.10±6.17 263.67±3.84處理后體質(zhì)量442.17±8.64△304.83±13.90*340.77±6.60*△339.50±9.40*△體質(zhì)量增長178.27±2.55△41.87±20.40*76.77±12.66*△75.83±11.78*△

2.2 各組大鼠潰瘍指數(shù)比較

見表3。正常組大鼠未見明顯潰瘍病灶；與正常組比較，模型組、黃芪建中湯組、奧美拉唑組大鼠胃潰瘍指數(shù)明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪建中湯組、奧美拉唑組大鼠胃潰瘍指數(shù)明顯降低（P＜0.05）。黃芪建中湯組各指標(biāo)與奧美拉唑組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

表3 各組大鼠潰瘍指數(shù)比較（分，±s）

組 別正常組模型組奧美拉唑組黃芪建中湯組n3 3 3 3潰瘍指數(shù)0△7.26±1.03*3.63±1.36*△3.87±1.10*△

2.3 各組大鼠胃黏膜組織病理變化比較

見圖1。鏡下觀察各組大鼠胃黏膜，正常組大鼠胃黏膜組織完整，腺體規(guī)則，皺襞清晰，未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤；模型組大鼠胃黏膜可見潰瘍，肌層缺損，腺體減少，有明顯炎癥細(xì)胞浸潤；奧美拉唑組及黃芪建中湯組大鼠胃黏膜潰瘍情況較模型組好轉(zhuǎn)，腺體基本規(guī)則，有少量炎癥細(xì)胞浸潤。

圖1 各組大鼠胃組織病理變化（HE染色，100倍）

2.4 各組大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平比較

見表4。與正常組比較，模型組、黃芪建中湯組、奧美拉唑組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α 水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪建中湯組、奧美拉唑組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α 水平明顯下降（P＜0.05）。與奧美拉唑組比較，黃芪建中湯組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α均升高（P＜0.05）。

表4 各組大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平的比較（pg/mL，±s）

表4 各組大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平的比較（pg/mL，±s）

注：與奧美拉唑組比較，#P ＜0.05。下同。

組 別正常組模型組奧美拉唑組黃芪建中湯組n3 3 3 3 IL-6 38.57±3.24△90.40±5.18*53.10±3.53*△72.84±3.81*△#IL-1β 215.78±8.30△1 045.45±55.09*433.88±21.13*△582.73±22.80*△#TNF-α 7.46±0.59△29.04±2.77*13.29±2.14*△19.10±1.46*△#

2.5 各組大鼠胃組織HGF與c-Met蛋白水平的比較

見表5。與正常組比較，模型組、黃芪建中湯組、奧美拉唑組大鼠胃組織HGF 蛋白水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪建中湯組、奧美拉唑組大鼠胃組織HGF蛋白水平明顯升高（P＜0.05）；且黃芪建中湯組HGF 與奧美拉唑組比較，無顯著差異P＜0.05）。各組間c-Met蛋白水平無明顯差異（P＞0.05）。

表5 各組大鼠胃組織HGF與c-Met蛋白水平的比較（±s）

表5 各組大鼠胃組織HGF與c-Met蛋白水平的比較（±s）

組 別正常組模型組奧美拉唑組黃芪建中湯組n3 3 3 3 HGF 0.032±0.002△0.047±0.002*0.071±0.002*△0.062±0.003*△c-Met 0.039±0.001 0.043±0.002 0.050±0.007 0.043±0.002

2.6 各組大鼠胃組織HGF mRNA 與c-Met mRNA 表達(dá)水平的比較

見表6。與正常組比較，模型組、黃芪建中湯組、奧美拉唑組大鼠胃組織HGF mRNA 與c-Met mRNA 水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪建中湯組、奧美拉唑組大鼠胃組織HGF mRNA、c-Met mRNA 水平明顯升高（P＜0.05）。與奧美拉唑組比較，黃芪建中湯組HGF、c-Met mRNA均顯著降低（P＜0.05）。

表6 各組大鼠胃組織HGF mRNA與c-Met mRNA表達(dá)水平的比較（±s）

表6 各組大鼠胃組織HGF mRNA與c-Met mRNA表達(dá)水平的比較（±s）

組 別正常組模型組奧美拉唑組黃芪建中湯組n3 3 3 3 HGF mRNA 0.33±0.05△0.72±0.04*0.99±0.03*△0.86±0.01*△#c-Met mRNA 0.26±0.03△0.49±0.06*0.97±0.04*△0.72±0.02*△#

3 討 論

胃潰瘍是嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量的一種疾病，嚴(yán)重時(shí)會危及生命。目前認(rèn)為發(fā)病因素與幽門螺旋桿菌感染、胃蛋白酶和胃酸分泌過多、飲酒、非甾體消炎藥等造成黏膜破壞、黏膜修復(fù)功能下降有關(guān)。黏膜損傷與修復(fù)不足是發(fā)病關(guān)鍵［15-16］。研究表明，HGF/c-Met通路在修復(fù)胃腸道黏膜、調(diào)節(jié)免疫方面具有重要意義［17］。HGF 在人體中分布廣泛，具有促進(jìn)多種細(xì)胞DNA 合成及細(xì)胞分裂的作用。HGF 與細(xì)胞膜上的特異性受體c-Met 結(jié)合后發(fā)揮作用。HGF 與c-Met 結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸蛋白激酶，進(jìn)一步磷酸化有絲分裂素激活蛋白激酶等靶蛋白分子，并經(jīng)過信號的逐級放大，改變特定基因及蛋白質(zhì)的表達(dá)或功能，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化［18］。

胃潰瘍往往伴隨炎癥反應(yīng)的發(fā)生［17］，炎癥細(xì)胞可遷移到潰瘍及其周圍區(qū)域，通過釋放炎癥因子來促進(jìn)胃黏膜損傷。IL-6、IL-1β 和TNF-α 是重要的炎癥因子［19］，可誘導(dǎo)損傷胃黏膜，加重潰瘍。IL-6 具有抗炎和促炎雙重作用，還具有促進(jìn)多種細(xì)胞增殖分化的功能。IL-1 發(fā)揮作用主要依靠IL-1β，其可激活多種炎性因子參與免疫應(yīng)答，常與TNF-α 共同促進(jìn)炎癥發(fā)生。TNF-α 是炎癥期間遷移的巨噬細(xì)胞釋放的主要促炎細(xì)胞因子，可以通過刺激區(qū)域的中性粒細(xì)胞浸潤，抑制潰瘍黏膜周圍的胃微循環(huán)，延緩胃潰瘍愈合［20］。

根據(jù)胃潰瘍的典型臨床癥狀，可歸屬于中醫(yī)“胃痛”“嘈雜”“胃瘍”等疾病范疇。其中，脾胃虛寒證是該病的常見證型之一。脾胃同居中焦，臟腑互為表里，為氣機(jī)升降關(guān)鍵樞紐，故脾胃病變常相互影響。先天稟賦不足，或后天失養(yǎng)，饑飽失常，勞倦過度，久病正氣虧虛等，均可致脾陽不足，虛寒內(nèi)生；脾胃受損可出現(xiàn)多種不適癥狀，如胃脘部疼痛、得溫痛緩、四肢倦怠乏力、畏寒怕冷、四肢不溫、飲食減少、大便溏稀等。針對該病因病機(jī)，治法應(yīng)為溫中健脾、和胃止痛。《金匱要略》中最早有黃芪建中湯的記載“虛勞里急，諸不足，黃芪建中湯主之”。黃芪建中湯由黃芪、桂枝、芍藥、大棗、生姜、甘草、飴糖組成。方中黃芪、大棗健脾益氣，桂枝、生姜溫中散寒，芍藥、飴糖緩急止痛，甘草調(diào)和諸藥，兼有緩急止痛之功。全方合用，共奏溫中健脾，和胃止痛之功效。因此，黃芪建中湯可以很好地治療脾胃虛寒證胃潰瘍。

研究結(jié)果顯示，黃芪建中湯組和奧美拉唑組HGF水平高于模型組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但各組間c-Met 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與Ha X 等［21］的研究結(jié)果相同；黃芪建中湯組和奧美拉唑組HGF mRNA 與c-Met mRNA 表達(dá)水平較模型組高；黃芪建中湯組和奧美拉唑組潰瘍指數(shù)較模型組低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組IL-6、IL-1β和TNF-α均有大量表達(dá)，黃芪建中湯組和奧美拉唑組IL-6、IL-1β 和TNF-α 較模型組均有不同程度的下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

HGF/c-Met 通路的高表達(dá)有益于胃黏膜的修復(fù)；IL-6、IL-1β 和TNF-α 等炎癥因子在胃潰瘍的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用。黃芪建中湯治療脾胃虛寒證胃潰瘍大鼠后，可見HGF mRNA、HGF 水平升高，IL-6、IL-1β和TNF-α水平下降，推測黃芪建中湯治療脾胃虛寒證胃潰瘍機(jī)制可能是通過提高HGF mRNA 水平，進(jìn)而增加HGF 表達(dá)，影響HGF/c-Met 通路促進(jìn)胃黏膜修復(fù)；抑制炎癥因子可能也是其作用機(jī)制。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組間c-Met mRNA 表達(dá)量存在差異，但各組間c-Met 蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其原因有待進(jìn)一步研究。