清胰湯對肝缺血再灌注損傷小鼠的肝臟保護作用及鐵死亡機制研究?

周 楨 凌琪華 王 倩 方 榮

（上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海 201203）

膿毒癥多臟器功能障礙是膿毒癥致死的首要原因［1］，其中，肝臟由于同時擁有肝動脈和門靜脈的雙重血供結構，往往高度暴露于以腸源性微生物為主的各種病原體之中，使急性肝損傷成為膿毒癥常見并發癥［2］。相比其他易損臟器，肝臟作為抵御全身炎癥反應的重要免疫器官，肝損傷將進一步加劇炎癥因子風暴［3］，是影響膿毒癥預后的獨立危險因素［4］，并發急性肝損傷的膿毒癥患者病死率甚至超過50%［5］，已被臨床獨立命名為“膿毒癥相關肝損傷”（SALD）。有學者提出，探索肝臟在膿毒癥中的作用或將促進新的膿毒癥治療靶點和干預策略發展［6］。與傳染性肝炎不同，SALD 并不常由膿毒癥病原微生物直接刺激所致，而是以缺血性肝炎為主要病理表現［7］。其發生肝損傷的機制包括炎癥因子風暴引起的廣泛血管滲漏、局部組織酸中毒以及微循環血栓形成所導致的肝臟動靜脈血流壓力降低、肝組織氧利用率下降以及肝臟毛細血管缺血等，最終造成肝臟血流灌注損害［8］。因此，肝缺血再灌注損傷是SALD 的核心病理生理基礎。

清胰湯是筆者主治腑實熱結型腹痛之經驗方，配伍思路旨在針對實邪直入或傳至下焦，化為濕熱，邪毒壅阻而發為腹痛的病證，對于急性胰腺炎療效確切［9］。而肝臟同處下焦，易受濕熱實邪之困，我們以此為異病同治理論基礎，嘗試將清胰湯運用于SALD患者，亦初步發現其臨床療效［10］。本實驗將進一步研究清胰湯對肝缺血再灌注損傷小鼠的肝臟保護作用，并探討其作用機制，為豐富清胰湯的臨床應用提供科學依據。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

采用SPF 級雄性C57BL/6 小鼠，8～10 周齡，體質量約20 g，由上海杰思捷實驗動物有限公司提供，于上海中醫藥大學附屬曙光醫院動物實驗中心SPF 級環境下飼養。所有小鼠均經過7 d 的適應性飼養后再進行實驗處理。

1.2 藥物制備

清胰湯浸膏劑委托曙光醫院藥劑科配置完成。組方：大黃9 g，枳實6 g，牡丹皮6 g，冬瓜子15 g，蘇敗醬15 g，柴胡12 g，郁金10 g，甘草6 g。將全方加10 倍量水，煎煮2 次，每次30 min，過濾后合并濾液，離心后取上清液，濃縮至1.3 g 生藥/g 浸膏，4 ℃冰箱保存。

1.3 試劑與儀器

谷丙轉氨酶（ALT）ELISA 試劑盒（YMS2871-A），谷草轉氨酶（ACT）ELISA 試劑盒（EM30567S）購自上海奧威生物科技有限公司；HE 染色試劑盒（G1121）購自北京索萊寶科技有限公司；冰凍切片活性氧檢測試劑盒（DHE 探針）（HR8685）購自上海穩承生物技術有限公司；鐵含量檢測試劑盒（MAK025）購自美國Sigma-Aldrich 公司；丙二醛（MDA）檢測試劑盒（S0131S）購自上海碧云天生物技術有限公司；GPX4（ab125066）、GAPDH（ab9485）抗體（來源兔）購自英國Abcam 公司；免疫組化試劑盒（D601037-0020）購自上海生工生物工程有限公司。倒置顯微鏡、熒光顯微鏡（德國Leica 公司），實時熒光定量PCR 儀、凝膠成像儀、電泳儀（美國Bio-Rad 公司），酶標系統多功能儀（上海百基生物）。

1.4 分組與給藥

30 只小鼠以耳標法隨機分為5 組：假手術組、模型組及清胰湯高、中、低劑量組，每組6 只。清胰湯低、中、高劑量組分別按成人劑量8、16、32 倍給藥，每組小鼠按1.5 mL/100 g 體質量進行灌胃，每日2 次，在IRI 模型造模前預處理7 d。假手術組及模型組同時灌胃等體積生理鹽水。

1.5 模型制備

造模前禁食不禁飲12 h，異氟烷麻醉后仰臥固定于小動物加熱墊上，逐層打開腹腔，充分暴露肝臟區，鈍性分離肝左葉和中葉的門靜脈及肝動脈，并用血管夾夾閉，以阻斷肝臟左葉和中葉的血流，使70%肝臟缺血，當被夾閉的肝臟組織部分顏色變淺時即肝血管阻斷成功。血流阻斷60 min 后，松開血管夾，肝葉逐漸恢復供血，由白轉紅表明再灌注成功，逐層縫合關閉腹腔，再灌注12 h。假手術組僅開腹鈍性分離血管，不進行缺血再灌注處理。

1.6 標本采集與檢測

各組小鼠于造模結束后在異氟烷麻醉狀態下經眼眶取血約300 μL，血液于室溫靜置1 h 后離心（6 000 r/min，10 min），取上清液待測。取血后斷頸處死，用剪刀快速暴露胸腹腔后以生理鹽水從右心房灌注，清洗臟器內殘留血液，直至肝臟變為土黃色，剪取肝左葉及肝中葉，其中肝左葉剪成兩塊，盡量保持邊緣整齊，用于肝臟冰凍及石蠟病理切片的制備；肝中葉剪成數個體積相近的小碎塊后以液氮迅速冷卻，-80℃冰箱保存。

1.6.1 血清ALT、AST 水平 采用ELISA 法，取各組小鼠血清，根據ELISA 試劑盒說明書制定標準曲線，并在各組樣本中加入工作液，用酶標儀在450 nm 波長下測量各組OD 值。

1.6.2 肝組織缺血形態學 采用HE 染色法，取各組小鼠肝臟石蠟切片，依次經脫蠟、蘇木素染色、伊紅染色、脫水、DAPI 封片，顯微鏡下觀察并拍片。

1.6.3 肝細胞活性氧水平 采用DHE 熒光探針技術，取各組小鼠肝臟冰凍切片，根據活性氧檢測試劑盒說明書，將清洗液、染色液稀釋至工作濃度，依次將切片清洗、染色，避光孵育30 min 后，用熒光顯微鏡觀察并拍片。

1.6.4 Fe2+含量 取各組小鼠肝組織0.05 g，加入冰PBS 0.5 mL 研磨成組織勻漿，低溫離心取上清至新EP管。根據鐵含量檢測試劑盒說明書制定標準曲線，并加入工作液，37 ℃孵育1 h，用酶標儀在593 nm 波長下測量各組OD 值。

1.6.5 脂質過氧化水平 取各組小鼠肝組織0.05 g，加入蛋白裂解液0.5 mL 研磨成組織勻漿，低溫離心取上清至新EP 管。根據MDA 檢測試劑盒說明書繪制標準曲線，并配置工作液，在各組樣本中加樣后沸水加熱15 min，冷卻至室溫后離心，取上清液用酶標儀在450 nm 波長下測量各組OD 值。

1.6.6 GPX4 表達 1）采用Western blotting 法，取各組小鼠肝組織0.05 g，加入蛋白裂解液0.5 mL 研磨成組織勻漿，低溫離心取上清至新EP 管。BCA 蛋白定量，加入5xloading buffer，100 ℃煮沸，配置12% SDSPAGE，取50 μg蛋白加入孔中電泳，轉移至PVDF膜上，再用5%脫脂奶粉封閉1 h。移入GPX4（1∶1 000）、GAPDH（1∶8 000）孵育盒中4 ℃過夜。次日，用0.05%Tween20 的PBST 沖洗PVDF 膜，加入二抗，再經室溫孵育2 h，PBST 沖洗3 次，GPX4、GAPDH 蛋白表達水平經ECL 化學發光法檢測。2）采用免疫組化染色法，取各組小鼠肝臟石蠟切片，脫蠟復水，滴加3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶，經胰酶修復后，以4%BSA/PBS 室溫封閉1 h。移入一抗GPX4（1∶250）孵育盒中4℃過夜。次日PBS 清洗4 次，移入二抗（來源兔，1∶200）孵育盒孵育1 h，PBS 清洗5 次。滴加DAB顯色劑，以顯出陽性且背景色不深為宜。再將切片經IHC 專用蘇木素染色，1%鹽酸乙醇分化，2%氨水返藍后脫水透明，封片后顯微鏡下觀察并拍片。

1.7 統計學處理

計量資料采用Prism 9.0 進行數據整理及統計學分析，以（±s）表示，其中WB 條帶的灰度值采用ImageJ 分析量化數據。P＜0.05 為差異具有統計學意義，P＜0.000 1 為差異具有顯著統計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠血清肝酶指標比較

見表1。各組小鼠血清ALT 指標方面：與假手術組相比，模型組指標顯著升高（P＜0.000 1）；與模型組相比，清胰湯低劑量組差異無統計學意義（P＞0.05），中劑量組有所下降（P＜0.05），而高劑量組則顯著下降（P＜0.000 1）。各組小鼠血清AST 指標方面：與假手術組相比，模型組顯著升高（P＜0.000 1）；與模型組相比，清胰湯低劑量組指標有所下降（P＜0.05），而中、高劑量組則顯著下降（P＜0.000 1）；與中劑量組相比，高劑量組降低更為明顯（P＜0.000 1）。

表1 各組小鼠肝酶指標比較（U/L，±s）

表1 各組小鼠肝酶指標比較（U/L，±s）

注：與模型組比較，?P ＜0.05，??P ＜0.000 1；與清胰湯低劑量組比較，#P＜0.05，##P＜0.000 1；與中劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.000 1。下同。

AST 84.08±2.296**1 255±130.8 909.3±48.12*427.9±26.62**222.0±17.99**△△組 別假手術組模型組清胰湯低劑量組清胰湯中劑量組清胰湯高劑量組n6 6 6 6 6 ALT 38.76±3.80**2 535±256.9 2 127±87.43 1 560±79.47*488.5±41.93**

2.2 各組小鼠肝臟組織缺血情況比較

見圖1。與假手術組相比，模型組小鼠肝臟組織出現大面積缺血灶，肝細胞出現腫脹、變形、壞死，而各清胰湯組肝臟缺血面積明顯減少，肝細胞腫脹、變形、壞死減少，并呈劑量依賴性。

圖1 各組小鼠肝組織形態學比較（HE染色）

2.3 各組小鼠肝細胞ROS 表達比較

見圖2。以DHE 熒光探針觀察各組小鼠肝組織細胞層面的ROS 表達情況（紅色熒光），結果發現，與假手術組相比，模型組肝細胞ROS 水平增高，而各清胰湯組ROS 水平降低，且隨劑量上升逐漸下降。

圖2 各組小鼠肝組織細胞ROS表達（DHE熒光探針）

2.4 各組小鼠肝臟組織鐵離子含量及MDA 水平比較

見表2。各組小鼠肝臟組織Fe2+變化方面：與假手術組相比，模型組含量顯著上升（P＜0.000 1）；與模型組相比，清胰湯低劑量組含量差異無統計學意義（P＞0.05），中劑量組含量有所下降（P＜0.05），而高劑量組則顯著下降（P＜0.000 1）。各組小鼠肝臟組織脂質過氧化水平方面：與假手術組相比，模型組MDA 水平顯著上升（P＜0.000 1）；與模型組相比，清胰湯低劑量組MDA 水平無統計學差異（P＞0.05），中劑量組有所下降（P＜0.05），而高劑量組則呈顯著下降（P＜0.000 1）。

表2 各組小鼠肝臟組織亞鐵離子含量、MDA水平及GPX4蛋白表達比較（±s）

表2 各組小鼠肝臟組織亞鐵離子含量、MDA水平及GPX4蛋白表達比較（±s）

組 別假手術組模型組清胰湯低劑量組清胰湯中劑量組清胰湯高劑量組n6 6 6 6 6 Fe2+（μmol/g）4.87±0.44**15.21±1.13 15.46±0.73 10.82±0.84*6.98±0.53**MDA（μmol/g）2.65±0.35**10.86±0.67 8.95±0.55 7.90±0.43*5.57±0.52**GPX4 0.871±0.220*0.081±0.006 0.099±0.022 0.183±0.021*0.358±0.059*△

2.5 各組小鼠肝臟組織GPX4 表達比較

見表2、圖3 及圖4。各組小鼠肝臟組織GPX4 表達方面：與假手術組相比，模型組蛋白表達水平顯著下降（P＜0.05）；與模型組相比，清胰湯低劑量組蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0.05），而中、高劑量組有所上升（P＜0.05），與中劑量組相比，高劑量組上升幅度更多（P＜0.05）。進一步以免疫組化染色觀察GPX4 表達水平，結果發現，與假手術組相比，模型組GPX4 表達明顯減少，而各清胰湯組表達逐漸上升，且呈劑量依賴性。

圖3 各組小鼠肝臟組織GPX4蛋白表達

圖4 各組小鼠肝臟組織GPX4表達（免疫組化染色）

3 討 論

機體對細菌病毒的清除都應以正常的肝功能為基礎，當膿毒癥并發急性肝損傷時容易進一步誘發其他的感染并發癥，如何防治SALD 的發生發展是改善膿毒癥患者預后所亟須解決的臨床問題［11］。

膿毒癥屬中醫學“溫病”范疇，根據溫病衛氣營血辨證理論，膿毒癥并發臟器功能障礙已進入血分證病機階段［12］，以熱入血分，邪熱蒸騰，耗傷營血，血熱相搏，甚則動血耗血為特點。而肝主藏血，體陰用陽，當邪毒內陷導致營血虧耗時，肝臟無法藏血，則肝陰不能制陽而迫血妄行，加之肝主疏泄，主升主動，肝藏血失司亦影響氣機調暢，氣機逆亂，則血隨氣逆，動血動風，促使血分證的進一步加重［13］，因此，該病機階段與肝之藏象關系密切。我們臨證發現，SALD患者大都可歸屬于“溫病，血分證”辨證類型，中醫治療應泄熱涼血、驅邪外出，同時配合疏肝養血，以期及時截斷血分證向營血耗竭、氣隨血脫階段發展。前期研究表明，清胰湯臨床能夠降低SALD 患者總膽紅素水平并減輕膿毒癥病情嚴重程度［10］，但具體作用機制尚未闡明。

與肝移植術后主要影響肝竇內皮細胞的冷型缺血再灌注損傷不同，SALD 缺血性肝炎通常為影響肝細胞的熱型缺血再灌注損傷［14］，以肝細胞線粒體活性氧（ROS）過度蓄積為特征［15］。本實驗以夾閉小鼠肝左葉及肝中葉動靜脈血流缺血60 min，再灌注12 h的方法構建70%肝臟缺血再灌注損傷模型，結果發現，模型組小鼠肝酶指標顯著上升，肝組織出現大范圍缺血灶，肝細胞發生腫脹、變形及壞死，肝細胞ROS水平明顯增高，均符合SALD 病理特征；而清胰湯中、高劑量組小鼠的肝功能指標改善，肝組織缺血壞死減少，肝細胞ROS 水平降低，表明清胰湯可靶向作用于肝臟；中、高劑量均可減輕肝臟氧化應激，對肝缺血再灌注損傷的肝臟具有保護作用，且高劑量清胰湯作用優于中劑量清胰湯，呈劑量依賴性。

鐵死亡是近年來發現的一種鐵依賴性氧化應激程序性細胞死亡形式［16］，線粒體ROS 為其公認的誘導信號之一［17］，最終由不受控的脂質過氧化反應驅動［18］，已被證實與肝缺血再灌注損傷密切有關［19］。鑒于SALD 是以肝線粒體ROS 所介導的肝缺血再灌注損傷為病理生理基礎，鐵死亡或是該病發生發展的重要病理環節。在缺血再灌注損傷環境下，細胞內的經典抗氧化通路xCT-GSH-GPX4 軸發揮其拮抗作用，但過度持續的線粒體ROS 將誘導GSH 耗竭，使GPX4 失活，拮抗脂質過氧化的作用逐漸減弱，是引發鐵死亡的經典效應途徑［18］。本實驗將GPX4 作為反映鐵死亡程度的相關標志物，GPX4 活性越高代表鐵死亡程度越低。結果發現，模型組小鼠肝組織亞鐵離子含量、脂質過氧化水平明顯上升以及GPX4 表達明顯下降，提示鐵死亡密切參與肝缺血再灌注損傷的過程，而清胰湯中、高劑量組小鼠肝組織的亞鐵離子含量、脂質過氧化水平降低，GPX4 活性恢復，表明中、高劑量清胰湯均能減輕肝缺血再灌注損傷介導的鐵死亡，且高劑量清胰湯作用優于中劑量清胰湯，呈劑量依賴性。

綜上所述，中、高劑量清胰湯均可體內減輕模型小鼠的肝臟氧化應激水平，減少肝缺血壞死，改善肝功能，對于肝缺血再灌注損傷的肝臟具有保護作用，其潛在機制可能與干預肝鐵死亡的發生有關，且其作用呈劑量依賴性。結合前期臨床研究結果，提示清胰湯或通過干預肝鐵死亡的發生改善肝缺血再灌注損傷，從而發揮抗SALD 的療效作用，這為進一步拓展清胰湯的臨床應用提供了部分科學依據。