五虎湯抑制miRNA 以改善病毒誘發的哮喘氣道炎癥

周 智，王孟清，羅銀河，姚 冰，劉靖雷，馬 嘯，歐德飛，吳立毛

（1.湖南中醫藥大學，長沙 410208；2.長沙市婦幼保健院，長沙 410007；3.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，長沙 410021）

支氣管哮喘是以氣道的炎癥反應、重塑、高反應性為主要病理基礎和表現的慢性疾病，哮喘主要的病理表現是氣道炎癥，其發病的關鍵機制為輔助性T 細胞1（Th1）/輔助性T 細胞2（Th2）介導的抗炎及促炎免疫應答失衡[1]，呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）對哮喘患兒Th1/Th2 細胞因子失衡影響顯著[2]，也是誘發哮喘常見的病原體之一[3]，與學齡前兒童喘鳴和哮喘關系密切，嚴重影響兒童身心健康[4]。隨著醫學水平的不斷發展和在分子生物學上研究的突破，微小RNA（mircroRNA，miRNA）在RSV 誘發哮喘疾病發展中的重要作用被越來越多的研究驗證[5]。其中miRNA-144 與哮喘的發病機制密切相關，并在哮喘的發展過程中存在異常表達[6]。中醫藥在防治病毒誘發哮喘方面有獨特優勢，實驗研究[7-9]證實：五虎湯可有效緩解RSV 誘發哮喘氣道炎癥，調節免疫平衡，但其機制仍未明朗。以兒童哮喘為例，本病分期辨證可分為發作期、遷延期和緩解期[10]。本研究以五虎湯治療RSV 誘發哮喘急性發作期作為主要實驗內容，以期進一步研究病毒誘發哮喘在生命早期的發病機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗選用40 只購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司的SPF 級雄性C57 小鼠，年齡均為3 周，體質量15 ～18 g。實驗動物許可證編號：SCXK（湖南）2019-0004。本實驗經湖南中醫藥大學第一附屬醫院動物實驗倫理委員會審核通過（倫理審批編號：zyfy20220820-04）。

1.2 實驗試劑和藥物

雞卵清蛋白（ovalbumin, OVA），Solarbio 公司生產，批號： 9006-59-1；RSV Long 株和 Hep-2 人喉癌上皮細胞，由武漢大學醫學部病毒學研究所提供；miRNA 逆轉錄試劑盒（中國北京康為世紀，批號：CW2141）；mRNA 逆轉錄試劑盒（中國北京康為世紀，批號：CW2569）；Trizol（美國Thermo，批號：15596026）。利巴韋林（山東齊都藥業有限公司，批號：102302003）；五虎湯方藥組成：生石膏9.0 g，苦杏仁6.0 g，細茶葉4.8 g，麻黃2.4 g，生甘草2.4 g，經嚴格稱質量與制備核實，確保每100 mL五虎湯中生藥含量24.6 g，中藥在湖南中醫藥大學第一附屬醫院購買。制藥過程如下：5 倍量蒸餾水混合藥物后浸泡30 min，使用電子調溫電熱儀煎煮120 min，第1 遍藥液過濾后，加入5 倍量蒸餾水煎煮90 min，第2 遍藥液過濾后混合2 次煎液，倒入旋轉蒸發儀獲取2.46 kg·L-1濃縮藥液。

1.3 實驗儀器

超聲霧化器（南京道芬電子有限公司生產，型號：S888E），臺式高速冷凍離心機（Eppendor，型號：5810R），生物安全柜（賽默飛，型號：1300SERIES A2），實時熒光定量PCR 儀（ABI，型號：Stepone plus），熒光PCR 板（美國Thermo，型號：SPL0960），熒光定量RCP 儀（美國Thermo，型號：PIKOREAL96），臺式冷凍離心機（中國湖南湘儀，型號：H1650R），DSI Buxco PFT 肺功能檢測系統（Pulmonary Function Test，PFT）。

2 實驗方法

2.1 分組與造模

參照課題組前期造模方法[7]，選擇40 只SPF 級雄性C57 小鼠，先隨機將10 只作為空白組，30 只作為模型組，使用移液槍將RSV 鼻腔滴入，每只0.1 mL，復合 OVA 腹腔注射，每只0.2 mL，誘發哮喘小鼠模型，空白組移液槍滴鼻等量生理鹽水，同時腹腔注射等量生理鹽水；造模成功后，空白組10 只小鼠作為空白對照，造模組30 只小鼠隨機分為模型組、五虎湯組、西藥組，每組10 只。實驗期間持續觀察小鼠體質量變化、搔鼻、聳肩、點頭樣喘息、口鼻分泌物等一般情況與行為改變。

2.2 給藥

按臨床量效關系觀察結果，擬定五虎湯組以1 倍量臨床用量灌胃，依據人與小鼠體表面積折算，五虎湯劑量為3.2 g·kg-1，灌胃每只0.4 mL；西藥組用利巴韋林抗病毒治療[11-12]，同樣以1 倍量臨床用量灌胃，依據人與小鼠體表面積折算后給藥利巴韋林0.1 g·kg-1＋生理鹽水，灌胃每只0.4 mL；模型組與空白組灌胃等容積生理鹽水，每天1 次，連續1 周。

2.3 DSI Buxco PFT 肺功能檢測系統檢測各組小鼠肺功能變化

將小鼠麻醉，體表消毒后剪開頸部正中皮膚并分離氣管，行氣管插管術，用DSI Buxco PFT 動物肺功能測定儀檢測各組小鼠肺功能指標殘氣量與肺總量比（RV/TLC），反映各組小鼠氣流受限的程度。

2.4 肺組織病理學檢測

立即用濃度為4%的多聚甲醛溶液浸泡保存無菌條件下解剖的小鼠肺組織左葉，隨后石蠟包埋、切片，采用Masson、PAS 和HE 法染色。將染色樣本在顯微鏡下觀察，記錄影像，以研究小鼠肺組織的病理變化。

2.5 用ELISA 法分別測定肺泡灌洗液中IL-10、IL-17、TNF-α 和TGF-β 的含量

測定肺泡灌洗液中IL-10、IL-17、TNF-α 和TGF-β 的含量時，參照ELISA 試劑盒的使用說明，按照順序測定IL-10、IL-17、TNF-α 和TGF-β 含量，隨后使用標準曲線分別計算濃度。

2.6 通過qPCR 法測定小鼠肺組織中miRNA-144 的表達

小鼠解剖后，取出0.02 g 右側肺部組織，在勻漿器中添入Trizol1 mL 勻漿，在室溫下裂解5 min；隨后加入三氯甲烷200 μL 振蕩15 s，在室溫下靜置3 min；設定半徑9 cm，溫度4℃，轉速12 000 r·min-1條件下使用離心機離心15 min；另用RNase-Free 離心管放置上清液，加等量異丙醇后在室溫靜置10 min；繼續在離心半徑9 cm，溫度4℃，轉速12 000 r·min-1條件下離心10 min；丟棄上清后加入75%乙醇1 mL 用于洗滌沉淀；隨后設定溫度4 ℃，半徑9 cm，轉速12 000 r·min-1條件下離心3 min，隨后丟棄上清；空氣干燥10 min 后，無菌無酶水30 μL 用于溶解沉淀；最后濃度檢測時在260 ～280 nm處使用紫外分光光度計測試吸光度數值。本研究設計合成miRNA-144 的qPCR 引物（北京擎科生物科技股份有限公司）序列見表1。

表1 miRNA-144 的qPCR 引物序列

2.7 統計學方法

使用SPSS 27.0 分析數據，數據結果采用均數±標準差（±s）表示，2 組數據對比采用t檢驗，采用Pearson檢驗進行相關性分析，P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 一般情況及行為改變

3.1.1 各組小鼠體質量改變 為了解RSV 對小鼠的整體影響，本研究在實驗期間持續稱量各組小鼠體質量，實驗結束時體質量變化見表2。

表2 各組小鼠體質量變化（±s ，n = 10） g

表2 各組小鼠體質量變化（±s ，n = 10） g

注：與空白組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

組別 體質量空白組 25.58±1.20模型組 20.96±0.71#五虎湯組 23.60±0.60△西藥組 22.82±0.79△

3.1.2 各組小鼠行為改變 空白組小鼠一般行為前后變化不大；與空白組比較，模型組小鼠出現行為改變，主要表現為呼吸急促，同時有聳肩、搔鼻、口鼻分泌物等呼吸癥狀；與模型組比較，五虎湯組、西藥組小鼠的呼吸頻率降低，聳肩、搔鼻、口鼻分泌物等呼吸現象減少，口、鼻處分泌物減少。

3.2 各組小鼠肺功能RV/TLC 比較

見表3。

表3 各組小鼠肺功能RV/TLC 比較（±s ，n = 10）

表3 各組小鼠肺功能RV/TLC 比較（±s ，n = 10）

注：與空白組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△△P ＜0.01

組別 RV/TLC空白組 0.023±0.007模型組 0.110±0.014##五虎湯組 0.052±0.019△△西藥組 0.037±0.018△△

3.3 各組小鼠肺組織病理學情況比較

3.3.1 HE 染色觀察各組小鼠肺組織氣道炎癥細胞浸潤情況 空白組小鼠支氣管黏膜呈現表面平整，結構基本正常，支氣管周圍無明顯炎癥細胞浸潤；與空白組比較，模型組小鼠支氣管黏膜周圍有炎癥反應改變；與模型組比較，西藥組和五虎湯組小鼠炎癥細胞浸潤明顯改變。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理形態改變（HE，×100）

3.3.2 Masson 染色觀察各組小鼠肺組織氣道膠原沉積情況 空白組小鼠的支氣管在顯微鏡下管腔完整，形態規則，基本沒有明顯氣道膠原沉積；與空白組比較，模型組小鼠支氣管氣道壁厚度改變；與模型組比較，西藥組和五虎湯組上述肺組織損傷情況均明顯改變。見圖2。

圖2 各組小鼠肺組織病理形態改變（Masson，×100）

3.3.3 通過PAS 染色觀察各組小鼠肺組織的氣道柱狀上皮細胞增生情況 觀察切片可發現空白組小鼠支氣管管腔基本完好，無明顯氣道柱狀上皮細胞增生；模型組小鼠氣道柱狀上皮細胞發生改變；與模型組比較，西藥組和五虎湯組氣道柱狀上皮細胞增生程度均有所改變。見圖3。

圖3 各組小鼠肺組織病理形態改變（PAS，×100）

3.4 各組小鼠肺泡灌洗液中IL-10、IL-17、TNF-α和TGF-β 濃度變化比較

通過ELISA 法檢測實驗指標，觀察各組小鼠肺泡灌洗液中炎癥因子IL-10、IL-17、TNF-α 和TGF-β濃度變化，見表4。

表4 各組小鼠肺泡灌洗液中IL-10、IL-17、TNF-α 和TGF-β 濃度變化比較（±s ，n = 10）

表4 各組小鼠肺泡灌洗液中IL-10、IL-17、TNF-α 和TGF-β 濃度變化比較（±s ，n = 10）

注：與空白組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△△P ＜0.01

組別 IL-10/（pg·mL-1） IL-17/（pg·mL-1） TNF-α/（pg·mL-1） TGF-β/（pg·mL-1）空白組 65.15±3.09 47.66±5.35 33.25±3.84 5.23±0.62模型組 37.90±1.13## 71.34±7.64## 77.10±6.59## 7.93±0.56##五虎湯組 53.00±4.42△△ 54.22±5.49△△ 57.13±5.35△△ 6.07±0.36△△西藥組 52.78±4.62△△ 55.70±2.31△△ 61.49±6.11△△ 5.70±0.36△△

3.5 各組小鼠肺組織miRNA-144 的表達水平變化比較

見表5。

表5 各組小鼠肺組織miRNA-144 表達水平變化比較（±s，n= 10）

注：與空白組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05

3.6 BALF 中IL-10、IL-17、TNF-α 和TGF-β 水平與miRNA-144 表達水平的相關性分析

小鼠肺組織miRNA-144 水平與BALF 中IL-10有極強的負相關性；BALF 中IL-17、TNF-α 和TGF-β 與小鼠肺組織miRNA-144 水平均有極強的正相關性。見表6。

表6 BALF 中IL-10、IL-17、TNF-α 和TGF-β 水平與miRNA-144 表達水平的相關性分析

4 討論

哮喘是一種以氣道炎癥為主要表現的疾病，并伴有氣道高反應性和氣道阻塞，是兒科常見的慢性呼吸系統疾病[13]，嚴重威脅患兒生命健康，炎癥反應在哮喘發生發展中發揮重要作用[14]。RSV 是下呼吸道感染和哮喘加重的主要原因之一，是兒童哮喘發生的一個重要因素[15]。

現有研究表明，RSV 引起的Th1/Th2 失衡與哮喘氣道炎癥的發生密切相關。T 細胞在病毒誘發哮喘氣道炎癥的發生發展中起主導作用，其中RSV 誘發哮喘發病的重要機制是輔助T 淋巴細胞（thelper cell，Th）兩種亞型Th1 和Th2 的失衡[16]，Th1 細胞主要作用為抗感染和調節免疫，哮喘的核心機制是Th2 細胞的過度活躍，同時導致呼吸道炎癥因子的過度分泌，其與炎癥介質協同作用后引起持續的慢性炎癥，使氣道上皮完整性受損[17]。RSV 誘發哮喘氣道炎癥持續存在的發病機制之一與Th1/Th2 免疫失衡密切相關逐漸被醫學界認同[18]。

炎癥因子IL-10、IL-17、TNF-α 和TGF-β 可共同形成Th1/Th2 細胞免疫失衡[19-21]。RSV 感染引發哮喘發作時，Th1/Th2 失去平衡，Th2 細胞主要分泌的IL-10 是強大的抑炎因子，可抑制Th2 細胞功能，減輕氣道炎癥反應，IL-10 增強單核細胞、中性粒細胞和效應淋巴細胞的募集，通過抑制炎癥介質TNF-α 產生，抑制炎癥發生，研究[22]認為，引起Th1/Th2 失衡的重要機制是IL-10 分泌的減少；RSV誘發哮喘發生時，TNF-α 引起的炎癥反應和免疫應答起關鍵作用，其增加巨噬細胞、集落刺激因子、粒細胞等分泌，通過炎癥介質加重哮喘[23-24]。IL-17與TNF-α 可協同加強炎癥調節，是其他細胞因子強有力的誘導者[25]。TGF-β 作為Th2 的細胞因子，具有促炎和抗炎的雙重作用，與RSV 誘發哮喘氣道炎癥呈正相關[26-27]，共同形成Th1/Th2 失衡，造成哮喘氣道炎癥的發生。

RSV 誘發哮喘的病因與復雜的細胞和基因組相互作用有關[28]，miRNA 是由22 個左右的核苷酸組成的一類內源性非編碼小RNA，可成為RSV 誘發哮喘早期干預和治療策略的新靶點[29]，miRNA 通過調控靶基因參與信號傳導通路引導RSV 誘發哮喘預后的走向，miRNA-144 可通過調控Th1/Th2 促進肺部疾病中的氧化應激，與哮喘的發生關系密切[30]。

中醫藥防治RSV 誘發哮喘有獨特的優勢。中醫認為哮喘屬“喘證”“哮病”范疇，是因宿痰伏肺、肺失肅降，感邪誘發，痰阻氣道，痰氣搏結，氣道攣急而出現的發作性氣喘痰鳴之病，與體內“伏痰”密切相關。《素問·陰陽別論》中提出：“陰爭于內，陽擾于外……使人喘鳴。”清代吳澄在《不居集》提出：“伏痰，略有感冒，便發哮嗽，呀呷有聲，烏巴丸。”清代李用粹在《證治匯補·哮病》曰：“哮即痰喘之久而常發者，因膈有膠固之痰，外有非時之感，內有壅塞之氣……發為哮病。”中醫學認為，哮喘為“外邪引動伏痰”導致[31]，RSV 引起的哮喘多入里化熱，表現為熱性哮喘，因此RSV 可被認為外感之熱邪[32]。

古方五虎湯作為治療哮喘的經典名方，具有止咳平喘、清瀉肺熱之功效，有“痰哮用之如神”的美譽，早在明代萬全《幼科發揮》中就有詳細記載五虎湯治療哮喘：“肺主喘嗽，喘有順逆，嗽有新舊，須明辨之……五虎湯主之。”后世醫家在此基礎上對五虎湯的應用不斷改善，對RSV 誘發哮喘的治療有確切的臨床療效[33-34]，臨床及動物研究已經證實，五虎湯可有效改善小鼠氣道炎癥，影響RSV 誘發哮喘的形成發展，發揮防治病毒誘發哮喘的作用[35]。

本研究使用RSV 鼻腔滴入復合雞卵清蛋白（ovalbumin，OVA）腹腔注射誘發小鼠哮喘，成功建立小鼠哮喘模型。本研究結果顯示，模型組小鼠體質量下降及呼吸道癥狀明顯，RSV 可能通過全身毒性影響機體代謝從而降低小鼠體質量，模型組小鼠肺功能RV/TLC 升高，提示氣流受限明顯，氣道阻塞加重，這與哮喘引發的氣道炎癥密切相關[36-37]，模型組病理學結果提示，肺組織炎癥損傷加重，BALF 中炎癥因子IL-10、IL-17、TNF-α 和TGF-β 顯著改變，引起Th1/Th2 免疫失衡，同時miRNA-144 表達升高；五虎湯組及西藥組上述表現均明顯好轉。此外，相關性分析顯示，各組小鼠肺組織miRNA-144 水平與BALF 中IL-10 有極強的負相關性；小鼠肺組織miRNA-144 水平與BALF 中IL-17、TNF-α 和TGF-β 均有極強的正相關性。通過觀察各組實驗結果后發現，五虎湯可有效改善RSV誘導的哮喘小鼠氣道炎癥，提高肺通氣順應性，這可能與五虎湯調節miRNA-144 的表達密切相關。

綜上所述，五虎湯可能通過抑制miRNA-144的表達，維持Th1/Th2 介導的促炎及抗炎反應平衡，有效改善RSV 誘發哮喘模型小鼠的氣道炎癥損傷，為驗證五虎湯可有效調節免疫平衡進而改善哮喘氣道炎癥的機制增加了證據。但miRNA-144靶點較多，不同靶點對Th1/Th2 免疫平衡的調節也不盡相同，因此五虎湯維持Th1/Th2 免疫平衡，降低哮喘炎癥反應的調控機理需要進一步從分子層面進行探究。