用于乳腺腫瘤細胞三維培養的纖維-水凝膠復合支架的制備及表征

傅思佳，劉星星，胡夢博，李超婧，1b，王富軍，1b，王 璐，1b

(1.東華大學 a.紡織學院,b.紡織面料技術教育部重點實驗室, 上海;2.復旦大學附屬華山醫院泌尿外科, 上海)

乳腺癌是女性最常見的癌癥,僅2020年就有230萬新病例,已成為全球主要新發癌癥類型[1]。正常乳腺組織非常柔軟,而乳腺腫瘤組織的機械剛度通常高于周圍正常組織,較高的組織硬度會影響腫瘤細胞的增殖、遷移、表型和對藥物的敏感性[2-3]。乳腺腫瘤學研究通常在傳統的二維(2D)結構中進行培養,但這忽略了細胞外基質(extracellular matrix,ECM)與細胞相互作用的復雜性,導致細胞生物學行為的改變并高估藥物療效[4-5]。與2D培養相比,在模擬ECM三維(3D)結構中培養的腫瘤細胞表現出與體內更接近的生長形態和化學敏感性特征,能夠更準確地概括復雜的腫瘤微環境和預測藥物治療效果[6]。

大部分人體正常組織或腫瘤組織的ECM均是由兩種不同形態的組分構成的3D大分子網絡。其一是由膠原蛋白、彈性蛋白等糖蛋白組成的蛋白質纖維網,起到構建細胞微環境中機械特質的作用;其二是由糖胺聚糖組成的凝膠狀基質,能夠指導細胞遷移、基質沉積和降解[7-8]。因此,ECM可被視為一種纖維-水凝膠復合結構[9]。為了仿生天然ECM結構,將靜電紡絲纖維與水凝膠結合以提高與天然ECM結構的相似性、力學性能和細胞信號傳導能力[10]。其中,水凝膠是高度親水的3D聚合物網絡,具有與天然ECM相似的物理和生化特性,可為細胞擴散和物質交換提供支持[11]。海藻酸鈉(sodium alginate,SA)是一種從褐藻中提取的天然陰離子多糖,可作為ECM中糖胺聚糖的替代物,已用作封裝和固定多種類型細胞[12]。然而,SA力學性能較差且缺乏細胞黏附位點,阻礙了其作為細胞長期培養支架的應用[13]。將具有優異生物相容性和可降解性的聚乳酸-乙醇酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid,PLGA)纖維納入水凝膠基質,兩者表面在互鎖效應下發生機械結合,纖維通過調整應力分布可以改善水凝膠的力學性能[14]。此外,纖維還可以引導細胞聚集并影響細胞行為[15]。

本研究制備了一個結構均勻的靜電紡絲-水凝膠3D細胞培養支架。在靜電紡絲過程中加入SA粉末,支架在水溶液中潤濕的過程中,SA粉末迅速向各方向發生溶脹,使PLGA纖維層間膨脹并改善致密的纖維排列。SA與PLGA纖維形成互穿網絡,經凍干后留下高度多孔的纖維-水凝膠復合支架三維結構如圖1所示。為改善支架對腫瘤細胞的引導效果,在纖維-水凝膠復合支架中負載富血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)以提高支架的生物活性。PRP是從全血中提取的富含高濃度血小板的血液衍生產品,是生長因子(growth factor,GFs)、細胞因子和纖維蛋白原的天然來源,因此已被用于組織工程和3D細胞培養平臺的開發[16]。乳腺腫瘤周圍存在高濃度的纖維蛋白,在Ca2+/凝血酶作用下,PRP中的纖維蛋白原重新聚合形成具有微納米尺度和黏彈性的纖維蛋白網絡[17]。本研究將支架用作體外腫瘤模型來培養和評估乳腺腫瘤細胞的生物學行為,并比較2D培養和3D培養所導致的藥物敏感性差異。

圖1 纖維-水凝膠復合支架的制備方法Fig.1 Fabrication of the fiber-hydrogel composite scaffold

1 材料和方法

1.1 材料

PLGA(mPLA/mPGA=50：50,Mw=105 000 g·mol-1)購自濟南岱罡生物工程有限公司;N,N-二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide,DMF)、三氯甲烷(chloroform,CF)、海藻酸鈉、無水氯化鈣(CaCl2)均購自國藥集團化學試劑有限公司;凝血酶購自羅恩試劑;兔富血小板血漿(PRP)均購自廣州鴻泉生物科技有限公司;人乳腺癌細胞(MCF-7)由中國科學院上海細胞庫提供;胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、最低必須培養基(minimum essential medium,MEM)、胰酶、雙抗均購自美國Thermo Fisher Scientific公司;4′,6-二脒基-2苯基吲哚(4,6-diqmino-2-phenyl indde, DAPI)溶液、異硫氰酸熒光素酯(fluorescein isothiocyanate, FITC)標記鬼筆環肽均購自北京索萊寶科技有限公司;CCK-8試劑盒購自翌圣生物科技上海有限公司;阿霉素(DOX)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 支架制備

為了比較支架的結構及組分對3D腫瘤模型性能影響,本研究構建了3種3D腫瘤支架,分別為純SA水凝膠支架,SA與PRP雙網絡水凝膠(sodium alginate-PRP,SAP)支架,以及負載富血小板血漿的纖維-水凝膠(sodium alginate-PRP-PLGA,SPP)復合支架。具體制備方法如下：

SA水凝膠支架的制備是以去離子水配置10 mg/mL的SA溶液,20 mmol的 CaCl2作為交聯劑并進行冷凍干燥得到的。

SAP水凝膠支架是通過將10 mg/mL的SA溶解在稀釋2倍后的PRP中,以0.5 U/mL凝血酶和20 mmol的CaCl2作為交聯劑并進行冷凍干燥得到的。

制備SPP支架需在進行PLGA靜電紡絲的同時添加SA粉末,隨后以20 mmol的CaCl2進行交聯并冷凍干燥成型以形成PLGA-SA互穿結構。再將其充分浸潤在PRP中,通過0.5 U/mL凝血酶和10 mmol的CaCl2誘導形成纖維蛋白網絡并激活血小板,冷凍干燥后得到SPP支架。

1.3 支架表征

1.3.1 支架的化學結構表征

支架的化學結構和元素組成通過傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet6700,Thermo Fisher Scientific,美國)、X射線光電子能譜儀(Escalab 250Xi,Thermo Fisher Scientific,美國)、能量分散譜儀(EDS)確定。用傅里葉變換紅外光譜測試支架的化學鍵,記錄波數為4 000～400 cm-1。使用X射線光電子能譜儀(Escalab 250Xi,Thermo Fisher Scientific,美國)分別分析測試3種支架的所含元素。EDS能譜分析通過使用配備有EDS檢測器的FESEM在10 kV加速電壓下進行,以獲得大面積和隨機選擇的樣品區域內元素組成的平均分布圖。

1.3.2 形貌分析

使用場發射電子顯微鏡(SU8010,Hitachi,日本)觀察各支架表面和截面的微觀形貌。使用多孔材料孔徑分析儀(CFP-1100AI,Porous Materials,美國)測定3D支架的孔徑尺寸。每種支架選取50個孔以計算平均孔徑。

孔隙率的測量是通過將支架浸入無水乙醇中,使乙醇充分滲透到支架中,支架在溫度為25 ℃條件下保持隔夜[18]。支架的孔隙率通過式(1)計算而得。

P=(m1-m0)/(ρV0)×100%

(1)

式中：P為支架孔隙率,%;m0為干燥支架的質量;m1為乙醇滲透后支架的質量;ρ為25 ℃下乙醇的密度;V0為干燥支架的體積。

1.3.3 溶脹性能

將凍干支架在PBS中于37 ℃溫育。以固定的時長間隔取出溶脹的支架并用濾紙吸收表面上的過量水后稱重m2[19]。根據式(2)計算溶脹率(%)：

R=(m2-m0)/m0×100%

(2)

式中：R為支架溶脹率,%。

1.3.4 水接觸角

使用接觸角測試儀(OCA15EC,Dataphysics,德國)對3種支架進行靜態水接觸角測試。采用微量注射器滴加4 μL超純水至支架試樣表面,拍攝表面形成的液滴,并用水接觸角測試軟件處理捕獲的成像液滴。每種試樣隨機選取4個點進行測量并取平均值。

1.3.5 力學特性

將3種支架在PBS中徹底再水合作用后,使用人體內生物管道壓縮彈性測試儀測量支架的壓縮應力-應變行為。使用直徑為20 mm的圓柱形壓頭,以5 mm/min 的速率壓縮樣品,直到其應變達50%。每種類型的支架至少測試3個樣本,數據記錄為平均值(±標準差)。彈性模量由壓縮試驗得到的應力-應變曲線的初始斜率計算[20]。

1.4 乳腺腫瘤細胞增殖

采用人源乳腺腫瘤細胞MCF-7評估在2D培養板,SA水凝膠支架、SAP水凝膠支架和SPP支架培養對腫瘤細胞生物學行為的影響。MCF-7在補充有FBS(體積分數為10%)和青霉素-鏈霉素(體積分數為1%)的MEM培養基中培養,并在具有CO2(體積分數為5% )的加濕培養箱中于溫度為37 ℃條件下生長。

使用CCK-8試劑盒量化細胞的增殖能力。將3種支架均在酒精缸中滅菌24 h后,在超凈臺中通風12 h并進行紫外線照射滅菌。分別在傳統2D培養板、 SA水凝膠支架、SAP水凝膠支架和SPP支架上以2×104個細胞/孔的密度接種。每2 d更換培養基。培養7 d后,向每孔中加入1 mL工作液(培養基與CCK-8體積比為9∶1),孵育2 h后,將溶液轉移到96孔板中以測量450 nm處的光密度(OD)值(每組n=8)。

1.5 細胞形態觀察

通過DAPI/FITC鬼筆環肽染色評估細胞在支架中的分布和形態。培養7 d后,用PBS洗滌各支架,用體積分數為4%的多聚甲醛固定細胞30 min,并采用體積分數為0.1% 的TritonX-100對細胞進行透化。細胞骨架用FITC標記鬼筆環肽染色60 min,細胞核用DAPI避光孵育10 min。使用激光共聚焦顯微鏡(CLSM,ZEISS,德國)觀察細胞形態和分布。

1.6 化療藥物敏感性的體外評估

為評估在2D培養板、SA水凝膠支架、SAP水凝膠支架和SPP支架中培養的細胞的耐藥性差異,將2×104個MCF-7細胞分別接種在2D培養板、SA水凝膠支架、SAP水凝膠支架和SPP支架上,培養5 d后去除培養基,加入含質量濃度為100 μg/mL的DOX的新鮮培養基,處理細胞48 h。

用上述CCK-8測定法測定藥物治療后的細胞活力,根據式(3)計算細胞活力(%)：

(3)

式中：MCF-7(處理)為藥物治療組;MCF-7(未處理)為不加藥物組。

1.7 統計分析

所有試驗均獨立進行,至少重復3次,并計算平均值以確保重現性。使用單因素方差分析(ANOVA) 檢驗,然后使用Tukey檢驗進行事后成對比較,顯著性差異水平p<0.05表示數據在統計學上存在顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 支架的化學結構分析

圖2 支架的化學結構表征Fig.2 Chemical structure of the scaffolds

XPS元素分析證明SAP水凝膠支架和SPP支架中N元素的存在,如圖2(b),且N元素在SPP支架中分布均勻,如圖2(c)所示。在PLGA靜電紡絲纖維、SA水凝膠支架中未檢測到N元素,證實PRP在SPP支架中成功負載,如圖2(d)所示。

2.2 支架的形貌分析

腫瘤支架的孔徑和孔隙率影響細胞的滲透以及氧氣、營養物質和代謝廢物的轉運,并與支架的溶脹性能和力學性能有關。為探索各支架的微觀結構,使用掃面電鏡進行微觀結構分析支架的形貌和孔徑表征,如圖3所示。由圖3可知,SA水凝膠支架、SAP水凝膠支架和SPP支架均呈現出互連的大孔結構。其中SA水凝膠支架具有最大的平均孔徑(169.77±11.30)μm,但孔徑大小分布不均(圖3(a)～(c)藍色虛線為SA孔隙)[9]。增加的交聯網絡和柔性的纖維蛋白聚合物鏈使SAP水凝膠支架具有孔徑較小但更均勻的孔隙,孔徑為(41.70±16.46)μm。已有研究[23-24]指出,孔徑過大將不利于細胞黏附且損害支架的力學性能。此外,在SAP水凝膠支架和SPP支架的表面和內部都能觀察到互連的纖維蛋白網絡(見圖3(b)、(c)黃色箭頭指示),這些蛋白網絡連接在SA形成的大孔和PLGA纖維間,豐富的纖維蛋白網絡能夠為細胞提供黏附表面,促進細胞增殖。進一步觀察發現,SPP支架中微納米級的PLGA纖維存在于SA孔隙中,支架中存在的多孔(平均孔徑為(25.83±7.38)μm)和纖維使細胞黏附在孔壁上,并通過相鄰層間懸垂的纖維(見圖3(e))進行細胞-細胞、細胞-基質相互作用[15]。測試的3種支架的孔隙率均高于80%,能為細胞的浸潤、增殖提供充分的空間和渠道(見圖3(f))。

圖3 支架的形貌和孔徑表征Fig.3 Morphology and pore size of the scaffolds

2.3 溶脹性能和水接觸角

支架表面潤濕性對細胞的附著、增殖、遷移和活力具有重要意義。支架的水接觸角和溶脹性能如圖4所示,通過水接觸角測試表征加入PLGA纖維后對支架表面潤濕性的影響。由圖4(a)可知,SA水凝膠支架顯示出高親水性,水滴在接觸表面0.14 s后立即被吸收到水凝膠中。相比之下,SAP水凝膠支架的水滴吸收速度略慢(為0.72 s)。這是因為纖維蛋白原在轉變成纖維蛋白時疏水性略有增加,導致SAP水凝膠支架的親水性略有下降,但當纖維蛋白為凝膠狀時,其是完全親水的[25]。PLGA靜電紡絲纖維的接觸角為126.83°±2.70°,表明PLGA纖維是疏水的,與文獻[21]研究結果一致。將PLGA纖維加入支架體系,水滴仍能在0.65 s內迅速滲透到SPP支架內,說明引入水凝膠后,支架由疏水轉為親水,具有較好的表面潤濕性。細胞膜具有親水的寡糖鏈,SPP支架的表面親水性將有助于細胞在支架上黏附,適用于細胞培養[26-27]。

圖4 不同支架的水接觸角和溶脹性能Fig.4 Swelling properties and water contact angles of the scaffolds

吸收液體后的溶脹能力是用于3D支架細胞培養的支架的另一個重要特性,主要取決于其微觀結構和親水性。溶脹性能有效地反映水凝膠對養分和代謝物的滲透和運輸能力,并影響水凝膠的力學性能和結構穩定性。本研究測量了支架在PBS中水合24 h后的溶脹率,如圖4(b)所示。由圖4(b)可知,3種支架均表現出優異的溶脹性能,其中,SA水凝膠支架的溶脹率最高為(3 468±14)%,但試驗中觀察到,SA水凝膠支架在溶脹過程中逐漸失去穩定的形態結構。由于交聯網絡的增加,SAP水凝膠支架溶脹率低于SA水凝膠支架,為(2 733±43)%。SPP支架溶脹率為(2 234±81)%略有降低但與SAP水凝膠支架無顯著性差異,由此可知纖維的存在不會影響水凝膠的溶脹。纖維組分均勻分布在水凝膠中,其在溶脹過程中始終保持良好的形態結構,如圖4(c)所示。這是因為纖維的存在會限制水凝膠的過度溶脹,這將有助于支架維持結構穩定以適用于細胞長期培養。

2.4 支架的力學性能

3D支架的力學性能應能支持腫瘤細胞在較長時間內的生長和增殖。支架壓縮應變達50%時(L0為支架高度,圖5(a)),應力-應變曲線如圖5(b)所示。應變為0～10%時,添加纖維對支架的彈性模量無顯著性影響(見圖5(c))。這是因為纖維-水凝膠復合支架在壓縮過程中承載壓縮載荷時有兩個階段的變形。在壓縮過程中,水凝膠基質在載荷的方向上被壓縮,導致垂直于作用力方向的膨脹。第一階段,纖維先被拉直,這需要較小的變形力[28]。第二階段,當應變增加到10%～15%時,SPP支架的彈性模量為(4.79±0.45)kPa,顯著高于SAP水凝膠支架(見圖5(d))。這時需要更大的力使拉直的纖維持續變形,且隨著壓縮過程中纖維密度的增加,纖維和水凝膠互連引起負載轉移,從而顯著增加變形力[29]。此外,SPP支架與乳腺腫瘤組織的模量((4～23)kPa)相當,可以為乳腺癌細胞提供生理相關的微環境[14]。

圖5 支架的力學性能Fig.5 Mechanical properties of scaffolds

2.5 細胞增殖和形態表征

MCF-7細胞在2D培養板、SA水凝膠支架、SAP水凝膠支架和SPP支架培養下的增殖結果,如圖6所示。由圖6可知,培養時間為7 d以內,2D培養和3D支架組的吸光度值均增加,表明MCF-7在SA水凝膠支架、SAP水凝膠支架和SPP支架上均能增殖,證實支架適合細胞生長。與2D培養下的快速增殖相比,在3D支架上培養的腫瘤細胞的增值速度較慢,與自然腫瘤的生長速度更接近,這一結果與已有研究[30]一致。SAP水凝膠支架與SA水凝膠支架的比較表明,加入PRP能提高MCF-7增殖,且這種促進作用隨著培養時間的增加而逐漸顯著。在細胞培養第三天時,SAP水凝膠支架比SA水凝膠支架的細胞增殖率高3.6%;在第七天時,SAP水凝膠支架比SA水凝膠支架的細胞增殖率高4.4%。這是因為PRP中的纖維蛋白能與細胞非特異性結合且不溶于水,為細胞提供更穩定的生長環境。纖維蛋白通常存在于晚期腫瘤的ECM中,且與惡性腫瘤有關,其為腫瘤生長提供初始結構支持,以促進腫瘤細胞分泌形成細胞外基質[31]。

圖6 MCF-7細胞在2D和3D培養下的增殖結果Fig.6 MCF-7 proliferation in 2D monolayer culture and 3D scaffolds

培養7 d后,添加PLGA纖維的SPP支架細胞增殖能力比SAP水凝膠支架高33.1%(p<0.01),這可能是因為SPP支架的彈性模量((4.79±0.45)kPa)與乳腺腫瘤組織的ECM剛度更相近且具備纖維和水凝膠這兩種ECM必要結構。據文獻[2]研究表明,增加的基質剛度可以增強腫瘤細胞-ECM相互作用并促進腫瘤細胞增殖。Jabbari等[32]的研究表明,在模量為5 kPa的水凝膠中培養的MCF-7細胞生成的最好。此外,靜電紡絲形成的PLGA纖維能夠高度模仿天然ECM的纖維網絡,靜電紡絲纖維基質已被證明可提供形態學線索,從而改善細胞黏附和增殖[33]。上述研究結果證明SPP支架從化學組成和結構兩方面促進了乳腺腫瘤細胞的增殖能力。

進一步觀察MCF-7細胞在2D培養板和3D支架中的形態差異,使用DAPI和鬼筆環肽對細胞核與肌動蛋白進行染色,共聚焦觀察細胞在2D和3D培養下的形態如圖7所示。2D培養的腫瘤細胞在第七天時形成密集的單層,細胞呈現出三角形或多邊形擴散形態(見圖7(a))。在3D培養中,細胞則表現為圓形梭狀的聚集形態。在SA水凝膠支架中細胞聚集但并未形成多細胞腫瘤球(見圖7(b))。這是由于SA水凝膠支架的孔過大,細胞更傾向于沿著孔壁生長而無法聚集成球體[34]。SAP水凝膠支架和SPP支架都促進細胞聚集并形成腫瘤多細胞球。不同的是,細胞在SAP水凝膠支架中更傾向于形成獨立的多細胞腫瘤球且存在更多單個分布的細胞(見圖7(c)),而在SPP支架中觀察到形成了兩個連接的多細胞腫瘤球(見圖7(d)),細胞分布更緊密,這是由于纖維的存在限制了細胞的下沉。此外,2個多細胞腫瘤球體間肌動蛋白的分布表明細胞可能通過纖維交換生化信號以促進細胞交流[35]。

圖7 細胞在2D和3D培養下的形態Fig.7 Morphological of cells in 2D monolayer culture and 3D scaffolds

2.6 化療藥物敏感性的體外評估

研究2D培養板以及SA水凝膠支架、SAP水凝膠支架和SPP支架培養下對抗腫瘤藥物的化學敏感性。培養腫瘤細胞5 d后,使用100 μg/mL DOX藥物處理細胞48 h,經處理后的細胞活力如圖8所示。由圖8可知,SA水凝膠支架、SAP水凝膠支架和SPP支架培養下的細胞均具有更低的化學敏感性,細胞活力均顯著高于2D培養。其中2D培養板細胞活力為15.91%,SA水凝膠支架細胞活力為77.27%,SAP水凝膠支架細胞活力為79.91%,SPP支架細胞活力為88.51%。與SA水凝膠支架和SAP水凝膠支架相比,SPP支架上培養的細胞受到的抑制作用最小,表明SPP支架上培養的MCF-7細胞具有更高的耐藥性。這一結果與較高的基質剛度會提高腫瘤細胞耐藥性的研究[36]一致。這是因為增加的基質剛度會通過改變腫瘤細胞的蛋白和基因表達(例如,提高ABC轉運蛋白和細胞存活促進因子Bcl-2表達)來提高腫瘤細胞的耐藥性。另外,纖維促使細胞聚集得更緊密,這種較高的細胞堆積密度會導致藥物更難擴散和滲透到中央細胞團中。綜上所述,SPP支架通過模擬乳腺腫瘤基質的剛度和物理結構來提高腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性,表明其具有藥物篩選的應用潛力。

圖8 DOX藥物處理48 h后的細胞活力Fig.8 Cell viability after 48 h of DOX drug treatment

3 結 語

本研究成功構建了負載富血小板血漿的纖維-水凝膠復合支架,模擬天然乳腺腫瘤ECM微環境。纖維的加入一方面使水凝膠支架的彈性模量提高了2.18倍,制備的SPP支架具有與乳腺癌腫瘤組織相似的彈性模量;另一方面,加入纖維還提高了支架的結構穩定性,使其更適用于細胞長期培養。負載PRP為細胞黏附和增殖提供了額外的蛋白網絡和生長因子,促進乳腺癌細胞增殖。相比于無纖維增強水凝膠支架,SPP支架上的細胞增殖率提高了33.1%。支架內部乳腺腫瘤細胞呈現促進多細胞球體。在SPP支架上培養的腫瘤細胞具有更低的化學敏感性。研究表明該支架是一種合適的臨床前模型,可作為腫瘤生物學研究和藥物篩選的體外平臺。