一株耐堿好氧反硝化菌的分離鑒定及其脫氮性能

段興帆，亢 昕，趙毅彪，陳小華，沈根祥，趙曉祥

(1.東華大學 環境科學與工程學院, 上海;2.上海市環境科學研究院, 上海)

自進入工業化生產以來,人們生活水平顯著提高,但由于各種工農業污水的過度排放,致使水體含氮量超標,生態環境惡化,不利于人體健康及環境的可持續發展[1],如何高效、環保地處理含氮廢水一直是水處理研究的熱點問題。

常見的廢水脫氮工藝有物理法、化學法及生物法。與物理法和化學法相比,生物法成本低、對環境友好,被廣泛應用于污水處理廠、人工濕地等領域[2]。傳統生物脫氮工藝通常包括兩個過程,首先由自養硝化菌在好氧條件下將氨氮轉化為硝氮或亞硝氮,然后再由異養反硝化菌在厭氧條件下將硝氮或亞硝氮轉化為含氮氣體以達到脫氮目的[3]。因此,傳統生物脫氮過程不能在同一反應器內完成,往往需要大型設備或較長的水力停留時間(hydraulic retention time, HRT)[4]。

好氧反硝化菌是一類能夠在有氧條件下進行反硝化作用的微生物,生長周期短,無需額外設置厭氧反應器,設備維護簡單[5]。目前,關于好氧反硝化菌的研究多集中于常規環境[6-7],而對極端環境下菌株脫氮特性的關注較少[8]。實際上,好氧反硝化菌對pH的變化敏感,其最適pH值范圍一般為6.5～8.0,當pH值超過此范圍,好氧反硝化菌的活性就會受到抑制,進而影響菌株的反硝化作用[9]。如在處理化工、制藥等含堿廢水中,還需添加酸來保障反應的正常進行[10]。此外,鹽質量濃度也是影響細菌活性的重要因素,含鹽量過高會導致細胞失水甚至裂解。盡管近年來陸續有科學家篩選出能夠適應強堿、高鹽環境的好氧反硝化菌,但大部分局限于單一耐受性的研究[11]。如王兆陽等[12]雖然分離出一株嗜堿好氧反硝化菌,但并未對其耐鹽性做進一步研究;唐婧等[13]篩選出的耐鹽好氧反硝化菌在pH值為8.0時反硝化效果最佳。因此,急需篩選能耐受強堿環境及一定鹽質量濃度的好氧反硝化菌用以簡化處理流程,降低處理成本,以期應用于更廣泛的處理領域。

從土壤中分離出一株耐堿好氧反硝化瓊氏不動桿菌5-2,通過考察其在不同環境因素下的脫氮特性,發現該菌株不僅能夠高效去除環境中的硝氮,還能適應強堿環境(pH=10.0～12.0)及一定鹽質量濃度(10～30 g/L)。此外,還對此菌的好氧反硝化相關酶活性及功能基因進行了檢測,有望為好氧反硝化菌處理復雜含氮廢水的實際應用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源

采集距地面深約10 cm的稻田土壤300 g,將收集到的新鮮土壤立即低溫運輸至實驗室并保存在4 ℃的冰箱中,用于后續細菌的篩選分離。

1.1.2 培養基

培養基具體配方如下所述。富集培養基：魚粉蛋白胨質量濃度為5.00 g/L,酵母提取物質量濃度為5.00 g/L,NaCl質量濃度為10.00 g/L。馴化培養基：CH3COONa質量濃度為 1.30 g/L,KH2PO4質量濃度為0.09 g/L,MgSO4·7H2O 質量濃度為0.20 g/L,KNO3質量濃度為 0.72 g/L。LB培養基：胰蛋白胨質量濃度為10.00 g/L,酵母提取物質量濃度為5.00 g/L,NaCl質量濃度為10.00 g/L。微量元素溶液：EDTA質量濃度為15.00 g/L,ZnSO4質量濃度為0.20 g/L,MnCl質量濃度為1.50 g/L,FeSO4·7H2O質量濃度為0.50 g/L,CuSO4·7H2O 質量濃度為0.50 g/L,CoCl·6H2O質量濃度為0.30 g/L,Na2MO4·2H2O質量濃度為0.20 g/L,CaCl2質量濃度為0.10 g/L。好氧反硝化培養基(ADM)：CH3COONa質量濃度為 0.62 g/L,KH2PO4質量濃度為0.09 g/L,MgSO4·7H2O質量濃度為0.20 g/L,KNO3質量濃度為0.29 g/L,微量元素溶液體積為2 mL。溴百里酚藍培養基(BTB)：在ADM培養基配方中加入體積為1 mL的1% BTB酒精溶液(0.10 g溴百里酚藍溶于10 mL酒精)。

在上述培養基配方中加入質量濃度為20.00 g/L的瓊脂即可得到相應固體培養基,試驗試劑為分析純,培養基在121 ℃下滅菌15 min后使用。

1.1.3 試驗儀器

JA-SERIES型分析天平;UV-1800PC型紫外分光光度計;DSX-280KB24型手提式壓力蒸汽滅菌鍋;SPH-2102C型立式雙層搖床;TECHCOMP CT15RT型離心機;VS-840-1型超凈工作臺;SU8010型掃描電子顯微鏡;JY92-II型超聲波細胞粉碎機。

1.2 試驗方法

檢測指標與方法如表1所示。硝氮或總氮的去除率(η)計算式為：η=(ρ1-ρ2)/ρ1×100%,其中ρ1和ρ2分別為試驗前后培養基中硝氮或總氮的質量濃度,分析圖表采用Excel及Origin 8.6軟件進行繪制。

表1 檢測指標與方法Table 1 Detection indicators and methods

1.3 菌株的分離鑒定

1.3.1 菌株的富集及分離

稱取5 g土樣置于盛有100 mL滅菌生理鹽水的錐形瓶中,在30 ℃、100 r/min的搖床中振蕩20 min后,吸取5 mL懸浮液于富集培養基培養48 h后,再從中吸取2 mL菌液至馴化培養基中培養,重復此操作6次后即可得到好氧反硝化細菌富集液。將富集液按照10倍稀釋法梯度稀釋,吸取0.1 mL稀釋倍數為108的菌液涂布于BTB固體培養基上,于30 ℃培養24 h,挑取使培養基變藍的單菌作為初篩菌株。將純化后的單菌株分別接種在ADM培養基中培養48 h,選取硝氮去除率最高的菌株作為后續試驗對象。

1.3.2 菌株形態學及掃描電子顯微鏡觀察

1)形態學觀察及革蘭染色。將菌株挑取至LB固體培養基上,于30 ℃培養24 h后觀察菌落狀態。同時,對菌株進行革蘭染色并觀察其在光學顯微鏡下的染色情況。

2)掃描電子顯微鏡觀察。取培養至對數期的菌液5 mL 在8 000 r/min條件下離心10 min(離心半徑為30 mm),用體積分數為2.5%的戊二醛溶液固定12 h,使用掃描電子顯微鏡放大5 000倍觀察。

1.3.3 菌株鑒定及功能基因的擴增

使用上海派森諾生物公司提供的正向引物27F(5′- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)及反向引物1492R(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)進行16 S rDNA測序,同時以基因組 DNA 為模板,擴增好氧反硝化相關基因(napA、nirK、nirS)[14],引物序列見表2。將測序結果與NCBI數據庫中獲得的其他微生物16 S rDNA序列進行BLAST比對,并使用MEGA 11.0軟件構建系統發育樹。

表2 好氧反硝化相關基因序列Table 2 Aerobic denitrification-related gene sequence

聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)體系(50.00 μL)： 1.00 μL基因組DNA,5.00 μL 10×Buffer(含 2.50 mmol/L Mg2+),1.00 μL dNTP,1.00 μL Taq聚合酶,1.50 μL 27F,1.50 μL1492R,39.00 μL ddH2O。PCR反應溫度條件： 95 ℃ 預變性5 min,95 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃ 延伸120 s,35個循環。

1.3.4 好氧反硝化酶活性測定

將在LB培養基中培養至對數期的菌株,于10 000 r/min離心10 min后(離心半徑為30 mm),用濃度為10 mmol/L磷酸緩沖鹽(phosphate buffered saline, PBS)(pH=7.4)溶液清洗3次后重懸菌體于離心管中。使用超聲波細胞粉碎機破碎15 min,再次離心后收集上清液即為細胞粗酶液。將適量細胞粗酶液分別加入相應酶反應體系,在35 ℃、90 r/min條件下反應30 min,通過各體系中硝氮及亞硝氮的消耗量來計算酶活力及酶比活力。超聲波細胞粉碎機具體工作條件及酶反應體系的構建參照文獻[15]。

酶活性單位(U)定義為1 min能轉化1 μmol反應物的酶量。酶活力(U/mL)是指1 mL粗酶液中含有的酶活性單位,酶比活力(U/mg)是指1 mg蛋白質中含有的酶活性單位。蛋白質濃度使用Solarbio BCA法試劑盒測定。

1.4 菌株脫氮能力研究

1.4.1 脫氮條件優化

將培養至對數期的菌液以體積分數為2%的接種量分別接種于單一因素變量的ADM培養基中以優化其脫氮條件。具體試驗條件如下：

1)在m(C)/m(N)值為12、初始pH值為10.0、轉速為90 r/min、溫度為35 ℃、鹽質量濃度為0 g/L的條件下,優化碳源(甲醇、葡萄糖、蔗糖、檸檬酸、乙酸鈉);

2)以乙酸鈉為碳源、初始pH值為10.0、轉速為90 r/min、溫度為35 ℃、鹽質量濃度為0 g/L的條件下,優化m(C)/m(N)值(8、10、12、14、16);

3)以乙酸鈉為碳源、m(C)/m(N) 值為12、轉速為90 r/min、溫度為35 ℃、鹽質量濃度為0 g/L的條件下,優化初始pH值(6.0、7.0、8.0、10.0、12.0);

4)以乙酸鈉為碳源、m(C)/m(N) 值為12、初始pH值為10.0、溫度為35 ℃、鹽質量濃度為0 g/L的條件下,優化轉速(30、60、90、120、150 r/min);

5)以乙酸鈉為碳源、m(C)/m(N) 值為12、初始pH值為10.0、轉速為90 r/min、鹽質量濃度為0 g/L的條件下,優化溫度(20、25、30、35、40 ℃);

6)以乙酸鈉為碳源、m(C)/m(N)值為12、初始pH值為10.0、轉速為90 r/min、溫度為35 ℃的條件下,優化鹽質量濃度(10、20、30、40、50 g/L)。

培養72 h后測定細菌生物量(OD600)并計算硝氮及總氮的去除率,所有試驗重復3次。

1.4.2 脫氮特性研究

在最優條件下,將菌株接種于ADM培養基中,每隔24 h測定其硝氮、亞硝氮、氨氮、總氮質量濃度及OD600值,進一步評價菌株反硝化能力。

2 結果與分析

2.1 好氧反硝化菌的分離

在篩選試驗中共得到5個具有好氧反硝化能力的單菌,計算其在24、48 h的硝氮去除率,結果如圖1所示。其中菌株5-2在48 h的硝氮去除率最高(91.64%),故選擇菌株5-2用于后續試驗。

圖1 不同菌株的硝氮去除情況Fig.1 Nitrate removal effect of different strains of bacteria

2.2 形態學觀察

菌株5-2的外觀形態和染色結果如圖2所示。

圖2 菌株5-2的外觀形態和染色結果Fig.2 Morphological appearance and staining results of the bacteria strain 5-2

由圖2(a)可知,菌株單菌落呈米黃色且形狀規則,邊緣光滑。由圖2(b)可知,在光學顯微鏡下可觀察到菌株的細胞呈藍色,結合《伯杰氏系統細菌學手冊》(第8版),初步鑒定為革蘭陽性菌。由圖2(c)可觀察到細菌呈桿狀,排列緊密無鞭毛。

2.3 菌株鑒定結果

將菌株5-2的16 S r DNA測序結果與NCBI數據庫比對,發現其與瓊氏不動桿菌ATCC 17908存在親緣關系,相似性為99.93%。采用MEGA 11軟件構建的菌株5-2系統發育樹如圖3所示,結果表明該菌為瓊氏不動桿菌。

圖3 根據16S rDNA同源性基因序列構建的菌株5-2系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain 5-2 based on the sequence homology of 16S rDNA gene

2.4 菌株脫氮條件的優化

1)碳源。碳源會影響細菌的代謝及電子傳遞過程,繼而影響細菌對氮的利用[16]。不同碳源下培養72 h后菌株生長及脫氮情況如圖4所示。由圖4可知：以甲醇為碳源時,菌株生長受到抑制(OD600=0.095),硝氮及總氮去除率較低,這可能與甲醇本身具有毒性有關;以檸檬酸為碳源時,OD600值為0.130,硝氮及總氮去除率分別為8.87%及2.25%;以蔗糖為碳源時,OD600值為0.255,硝氮及總氮去除率分別為31.57%及15.78%;以葡萄糖為碳源時,OD600值為0.433,硝氮及總氮去除率分別為68.06%及35.31%;以乙酸鈉為碳源時,菌株OD600值最大為0.561,此時,硝氮及總氮的去除率也達到最高,分別為94.64%及53.27%。這說明瓊氏不動桿菌5-2可利用葡萄糖、蔗糖及乙酸鈉為碳源。相較于葡萄糖與蔗糖,乙酸鈉分子結構更為簡單,無需經過酶的轉化即可直接參與反硝化過程[17]。綜上,選擇乙酸鈉作為后續試驗的碳源。

圖4 碳源對脫氮性能的影響Fig.4 Effect of carbon source on denitrification performance

2)m(C)/m(N)值。m(C)/m(N)值是影響細菌生長的關鍵因素,過低或過高的m(C)/m(N)值會影響菌株的脫氮效果[18]。培養72 h后,不同m(C)/m(N)值下菌株生長及脫氮情況如圖5所示。

圖5 m(C)/m(N)值對脫氮性能的影響Fig.5 Effect of m(C)/m(N) value on denitrification performance

由圖5可知,在一定范圍內菌株脫氮能力隨著m(C)/m(N)值的增加而增強,當超過該范圍,m(C)/m(N)值不再是影響菌株脫氮的關鍵因素。當m(C)/m(N)值由8提高到12時,菌株OD600值由0.415升至0.575,硝氮去除率由73.53%增加到95.71%,總氮去除率由37.24%增加到51.88%;但當m(C)/m(N)值為14和16時,硝氮去除率分別為95.97%及96.47%,總氮去除率分別為52.24%及53.33%,并無明顯增加。在An等[19]的研究中也觀察到相似現象。綜上,瓊氏不動桿菌5-2能夠適應廣泛的m(C)/m(N)值范圍,考慮成本及避免不必要的浪費,確定最佳m(C)/m(N)值為12。

3)初始pH值。pH對細菌活性有顯著影響。培養72 h后,不同初始pH值下菌株生長及脫氮情況如圖6所示。由圖6可知,菌株的脫氮能力隨著初始pH值的升高而增強,并始終保持著較高的脫氮率。當初始pH值為10.0時,OD600值為0.592,硝氮及總氮去除率最高,分別為98.75%及58.54%;當初始pH值為12.0時,菌株的脫氮能力下降,硝氮與總氮去除率分別為93.08%及53.78%,高于已有報道[20-21]的耐堿好氧反硝化菌。由此可知,瓊氏不動桿菌5-2能夠很好地適應強堿環境,并表現出優異的反硝化能力。綜上,確定最佳初始pH值為10.0。

圖6 初始pH值對脫氮性能的影響Fig.6 Effect of initial pH value on denitrification performance

4)轉速。溶解氧濃度對菌株的生長速率和傳質速率有重要的影響[22],試驗中通常通過轉速來控制溶解氧的濃度。培養72 h后,不同轉速下菌株生長及脫氮情況如圖7所示。

圖7 轉速對脫氮性能的影響Fig.7 Effect of rotation rate on denitrification performance

由圖7可知,在一定范圍內轉速的增加有利于菌株進行反硝化作用,當超過該范圍,轉速的增加反而會有相反效果。在轉速由30 r/min升至90 r/min時,菌株生長良好(OD600值為0.615),其脫氮能力增強,硝氮與總氮的去除率分別可達97.05%及58.58%;但當轉速升高至120及 150 r/min時,菌株反硝化能力明顯下降,其中轉速為150 r/min時,脫氮效果最差,此時OD600值為0.425,硝氮與總氮的去除率分別為73.37%及41.28%。這說明瓊氏不動桿菌5-2可能存在溶解氧閾值,當超過閾值,提高轉速反而不利于菌株進行反硝化[23]。綜上,確定最適轉速為90 r/min。

5)溫度。已有報道[24]的大多數好氧反硝化菌最適溫度為30～37 ℃。培養72 h后,不同溫度下菌株生長及脫氮情況如圖8所示。由圖8可知,過低或過高的溫度不利于菌株的生長及氮的去除。當溫度為20 ℃,菌株生長不佳,脫氮率最低;當溫度為30～35 ℃時,菌株的OD600值和脫氮率明顯上升,其中溫度為35 ℃時,硝氮及總氮去除率最高分別為97.27%及56.34%;但是當溫度繼續升高至40 ℃時,菌株OD600值和脫氮率又有所下降。由此可見,當溫度低于30 ℃或高于35 ℃時不利于菌株反硝化作用的進行。因此,確定最適宜反硝化溫度為35 ℃。

圖8 溫度對脫氮性能的影響Fig.8 Effect of temperature on denitrification performance

6)鹽質量濃度。鹽質量濃度的增加對細菌的影響顯著。培養72 h后,不同鹽質量濃度下菌株生長及脫氮情況如圖9所示。由圖9可知,隨著鹽質量濃度的增加,菌株的脫氮能力逐漸下降。在鹽質量濃度為10 ～30 g/L時,鹽質量濃度對菌株的生長和反硝化速率影響較小,硝氮去除率均大于90%,這與菌株TJPU04[25]在鹽質量濃度試驗中的表現相似;當鹽質量濃度升至為40和50 g/L時,細菌OD600值及脫氮率出現明顯下降,鹽質量濃度為50 g/L時降至最低,此時OD600值為0.119,硝氮去除率降至8.98%,總氮去除率降至2.12%。總體而言,瓊氏不動桿菌5-2的耐鹽能力要強于一般好氧反硝化菌[26],這可能是由于該菌株能夠產生一些代謝物質使其在一定鹽質量濃度下保持滲透平衡[27]。由此證明瓊氏不動桿菌5-2具有處理一定濃度含鹽廢水的潛力。

圖9 鹽質量濃度對脫氮性能的影響Fig.9 Effect of salt mass concentration on denitrification performance

2.5 脫氮特性研究

在上述各個因素最佳條件下瓊氏不動桿菌5-2培養120 h后硝氮、亞硝氮、氨氮、總氮的質量濃度及OD600值變化情況如圖10所示。

圖10 瓊氏不動桿菌5-2的反硝化過程Fig.10 Process of denitrification of Acinetobacter junii strain 5-2

由圖10可知：在培養24 h后,菌株進入對數生長期(OD600值為0.557),硝氮質量濃度下降至4.05 mg/L,總氮質量濃度下降為27.22 mg/L,出現明顯的亞硝氮積累(18.92 mg/L)及少量氨氮(5.96 mg/L),其中氨氮的少量積累可能與菌株的生長有關[28];培養48 h后,菌株硝氮質量濃度為2.82 mg/L,亞硝氮質量濃度開始下降(15.24 mg/L),氨氮質量濃度為7.16 mg/L;培養72 h后,菌株的硝氮質量濃度及亞硝氮質量濃度分別下降為1.03及10.55 mg/L,氨氮質量濃度則上升為8.41 mg/L,這可能與部分細菌的衰亡有關;當繼續培養至120 h后,菌株OD600值降為0.566,此時硝氮質量濃度(0.89 mg/L)及總氮質量濃度(14.45 mg/L)均降至最低。結果表明,氮的去除與細菌的生長呈現良好的一致性,并且在整個培養過程中,可觀察到亞硝氮先積累后下降及氨氮的少量積累,Yang等[29]、Zou等[30]報道的好氧反硝化菌也被觀察到類似情況。

2.6 酶活性及脫氮基因的檢測

理論上,好氧反硝化菌主要利用硝酸鹽還原酶(nitrate reductase, NAR)和亞硝酸鹽還原酶(nitrite reductase, NIR)進行反硝化作用。其中NAR常見編碼基因為napA,NIR常見編碼基因為nirK及nirS[31]。因此,可通過檢測相關酶活性及基因來驗證瓊氏不動桿菌5-2的好氧反硝化能力。

表3 瓊氏不動桿菌5-2的關鍵酶活力

瓊氏不動桿菌5-2的基因檢測結果如圖11所示,可以看出只有nirK基因被成功擴增。

圖11 瓊氏不動桿菌5-2反硝化基因的擴增Fig.11 The amplification of denitrification genes of Acinetobacter junii strain 5-2

類似地,在王賀等[32]的研究中也未能檢測出napA基因。據此推測可能有以下3個原因：(1)瓊氏不動桿菌5-2為革蘭陽性菌,而目前篩選得到的好氧反硝化菌大都為革蘭陰性菌,革蘭陽性菌代謝復雜,可能存在其他代謝途徑[33];(2)好氧反硝化機理尚缺乏系統性研究,可能存在未被鑒定出的反硝化酶基因[34];(3)硝氮異化為銨或發生同化作用[35]。此外,nirK基因的成功擴增則表明瓊氏不動桿菌5-2具有將亞硝氮還原為一氧化氮的能力,也符合之前的研究[36]中nirS與nirK基因不能同時表達的觀點。因此,雖然napA基因未能被檢測出來,但是不能否認瓊氏不動桿菌5-2具備好氧反硝化能力。

3 結 論

1)從上海市稻田土壤中分離出一株耐堿好氧反硝化瓊氏不動桿菌5-2,并通過單因素影響試驗確定其最佳脫氮條件。在此條件下,培養120 h后菌株對硝氮及總氮的去除率分別為97.83%及65.85%。

2)瓊氏不動桿菌5-2能適應強堿環境及一定鹽質量濃度范圍。當pH值為10.0～12.0時,鹽質量濃度范圍為10～30 g/L時,菌株均能正常生長并表現出良好的脫氮效率。此外,相關酶活性及基因檢測結果進一步證明瓊氏不動桿菌5-2具有將硝氮及亞硝氮還原為氣體產物的能力,為處理實際復雜廢水提供了理論依據。