滋腎清熱利濕化瘀方對PCOS 大鼠的干預作用實驗研究

★ 丁志玲 梁瑞寧（.江西中醫藥大學中醫婦產科學研究所 南昌 333004；. 江西中醫藥大學第二附屬醫院 南昌 330004）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育齡女性最常見的生殖內分泌代謝性疾病。PCOS 患病率約15%，且逐年攀升，同時其并發癥的終生風險亦非常高，嚴重影響婦女的生殖健康及生活質量［1-2］，對后代亦產生較大影響［3-5］。由于PCOS 發病機制尚未明確，西醫對該病多采用對癥治療，而中醫治療該病具有一定優勢。因此，探索中醫藥治療PCOS 的作用對于中醫藥的推廣應用具有重要意義。

滋腎清熱利濕化瘀方（ZQLHF）是梁瑞寧教授臨床實踐得出的PCOS 治療驗方。臨床研究表明，該方能恢復部分患者自主排卵，有效重建 PCOS 患者月經周期，并能改善患者高雄激素體征，且無明顯不良反應，能夠最大限度使患者性激素內環境趨于穩態［6］。為了進一步研究ZQLHF 防治PCOS的作用，設置ZQLHF 低、中、高3 個劑量濃度對PCOS 模型大鼠療效的研究，為后續進一步研究ZQLHF 治療PCOS 分子生物學機制奠定基礎，同時為ZQLHF 的臨床推廣提供科學依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SPF 級SD 大鼠50 只，雌性，6 周齡，體重180～200 g，購于湖南萊斯克景達實驗有限公司使用許可證號：SCXK（湘）2019-0004。SPF 級實驗室條件飼養大鼠，12 h 光照晝夜交替，飼養條件的相對溫度、濕度分別是20～26 ℃、40%～70%。江西中醫藥大學動物倫理委員會已批準本實驗研究方案（倫理證號：JZLLSC20230466）。

1.2 實驗藥物

滋腎清熱利濕化瘀方：知母10 g，山茱萸10 g，丹參10 g，桃仁10 g，薏苡仁15 g，白芥子10 g，黃柏10 g，玄參10 g，甘草6 g，購買于江西中醫藥大學第二附屬醫院中藥房。藥物制備方法：中藥煎煮前用冷水浸泡30 min，分2 次煎煮，第1 次煎煮放入6 倍中藥量的水，先用武火煎煮，待水沸后，再煎煮30 min；第2 次煎煮放入與第1 次煎煮等量的水，水沸后煎煮分別濃縮成不同要求的生藥濃度。來曲唑由江蘇恒瑞醫藥股份有限公司生產。

1.3 實驗主要試劑

瑞氏-姬姆薩復合染液、1%的羧甲基纖維素溶液（北京雷根生物技術有限公司，批號分別為0514A20、cc0113）；大鼠睪酮（T）ELISA 試劑盒、大鼠黃體生成素（LH）ELISA 試劑盒；大鼠促卵泡素（FSH）ELISA 試劑盒（江蘇酶免實業有限公司，批號分別為200624R15、200715R13、200715R21）。

2 實驗方法

2.1 PCOS 模型大鼠的構建

將購買的52只大鼠放在檢疫室適應性飼養1周，隨后按照隨機分法設為正常組（10 只）、模型組（40 只）。PCOS 模型構建參照文獻［7］，用1% 羧甲基纖維素溶液（10 mL/kg）溶解來曲唑（1.0 mg/kg），每天灌胃1 次，持續21 d。來曲唑造模結束后，隨機從各組中挑選2 只大鼠麻醉處死，對大鼠卵巢組織行HE 染色，顯微鏡下觀察PCOS 模型大鼠卵泡是否呈囊狀樣。

2.2 大鼠分組及給藥

造模結束后給予ZQLHF 灌胃，連續14 d。正常組與模型組均給予等體積的生理鹽水灌胃作為對照；ZQLHF 低劑量組：給予含生藥量4.55 g/（kg·d）水煎劑灌胃；ZQLHF 中劑量組給予含生藥量9.1 g/（kg·d）水煎劑灌胃；ZQLHF 高劑量組給予含生藥量18.2 g/（kg·d）水煎劑灌胃。有關劑量的換算按照人與動物的體表面積進行的折算比值，給予大鼠的ZQLHF 劑量是成年女性6 倍，以大鼠的等效劑量設為中劑量，按照10 mL/kg 體積灌胃。

2.3 大鼠體質量測定

大鼠造模前、造模及中藥干預的期間，每周在固定的時間點記錄大鼠的體重，觀察大鼠體質量變化情況。

2.4 大鼠動情周期檢測

通過觀察大鼠陰道脫落細胞組成比例了解其動情周期階段。正常大鼠動情周期由4個階段組成：動情前期（未角化的有核細胞占比為主）、動情期（全是落葉狀的角化無核細胞）、動情后期（白細胞、有核細胞、無核細胞3 種細胞）、動情間期（白細胞占比為主）。不同的干預方法期間陰道涂片均持續記錄10 d。

2.5 樣品采集與保存

造模結束當晚20∶00 開始禁食12 h，次日8∶00 給予異氟烷麻醉，眼眶取血，常溫下靜置2 h以上，3 000 r/min 離心15 min，分離血清并凍存于-80 ℃冰箱。ZQLHF 干預結束后，第2 天給10%水合氯醛進行腹腔麻醉后行心臟采血。鈍性分離兩側卵巢組織，分別置于10%的福爾馬林溶液和凍存管中。

2.6 卵巢病理切片制作

卵巢組織在10%的福爾馬林溶液固定48 h 后，梯度酒精脫水，二甲苯透明、石蠟包埋，切成厚度約4 μm 片子，HE 染色，中性樹膠封片，鏡下觀察卵巢形態。

2.7 血清指標的檢測

血清性激素（T、LH、FSH）的檢測，使用ELISA 檢測方法，嚴格按照各檢測指標試劑盒說明書進行操作。血糖采用羅氏血糖儀檢測，脂代謝（TG、TC、HDL-C、LDL-C）均采用全自動生化分析儀進行檢測。

2.8 統計學方法

數據采用SPSS 19.0 軟件進行統計學分析處理，計量資料用（）表示，組間采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 造模結果

一般4～5 d 是正常大鼠的動情周期，于造模的第10 天開始對大鼠進行陰道涂片。結果發現，PCOS 模型組大鼠逐漸處于動情間期，涂片上的細胞種類幾乎均是白細胞，至造模結束大鼠全部處于動情間期。由此提示，PCOS 模型大鼠出現無排卵。見圖1。

圖1 造模期間2組大鼠動情周期變化

與正常組大鼠比較，PCOS 模型組大鼠血清T、LDL-C 及INS 水平顯著增加，HDL-C 水平降低（P＜0.05），其它糖脂代謝指標未見明顯差異（P＞0.05）。由此提示，PCOS 模型大鼠出現高雄激素血癥及部分脂代謝異常。見表1。

表1 2組大鼠T、GLU、INS、TG、TC、HDL-C、LDL-C水平比較（）

表1 2組大鼠T、GLU、INS、TG、TC、HDL-C、LDL-C水平比較（）

注：與正常組比較，*P＜0.05。

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正常組大鼠卵巢組織的卵巢內可見不同發育階段各種卵泡及多個黃體，PCOS 模型組大鼠的卵巢內見許多卵泡呈囊狀樣擴張改變，且黃體極少見。見圖2。

圖2 正常組與模型組卵巢組織形態學比較（HE，×50）

3.2 滋腎清熱利濕化瘀方對PCOS 模型鼠干預作用

造模前（適應期）各組大鼠體質量無明顯差異（P＞0.05）；造模3 周時間內，來曲唑所構建的各組PCOS 模型組體質量增加量較正常組顯著升高（P＜0.05），同時模型組之間大鼠體質量增加（P＞0.05）。ZQLHF 干預2 周后，與正常組比較，模型組大鼠組體質量增加量仍非常顯著（P＜0.01）；與模型組比較，ZQLHF 干預1 周后，其各組大鼠體質量的增加無明顯差異（P＞0.05），但ZQLHF干預的第2 周各組體質量增加量呈下降趨勢，其中ZQLHF 高劑量明顯下降（P＜0.05）。由此表明，ZQLHF 對PCOS 模型大鼠的體質量具有降低作用。見表2。

表2 各組大鼠每周體質量增加量比較（，n=8） g

表2 各組大鼠每周體質量增加量比較（，n=8） g

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

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與正常組比較，模型組性激素T 水平升高非常明顯，FSH 濃度降低十分明顯（P＜0.01），同時LH 水平與LH/FSH 比值明顯升高（P＜0.05）。與PCOS 模型組比較，其中ZQLHF 低、中劑量組性激素T 水平下降明顯（P＜0.01），LH 水平明顯下降（P＜0.05），同時ZQLHF 中劑量組LH/FSH 比值明顯減小（P＜0.05）；而ZQLHF 高劑量組除性激素T水平明顯降低（P＜0.05），其他參數的變化不明顯（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠T、LH、FSH水平及LH/FSH比值比較（，n=8）

表3 各組大鼠T、LH、FSH水平及LH/FSH比值比較（，n=8）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

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正常組大鼠卵巢組織存在各發育階段結構正常的卵泡與黃體多個，卵泡內多層顆粒細胞的形態是完整的且排列整齊；而PCOS 模型組大鼠的卵巢皮質增厚，卵巢存在許多囊狀樣擴張的卵泡，顆粒細胞層數較正常組明顯減少，且細胞排列松散，黃體少見。與模型組比較，ZQLHF 3 個劑量組的卵巢內無卵丘囊性卵泡縮小且數量減少，顆粒細胞層數及黃體數量均較模型組有所增多，其中ZQLHF 中劑量組卵巢組織形態改善最為明顯。見圖3。

圖3 滋腎清熱利濕化瘀方對PCOS大鼠卵巢組織病理學的影響（HE，×50）

4 討論

PCOS 是婦科生殖內分泌領域研究的熱點問題，然對本病臨床取材研究依舊存在重重困難，故成功構建與人體相似的PCOS 模型對深入研究該病具有重要作用。文獻報道較多關于PCOS 動物實驗研究，可供選擇的模型動物僅有家兔、猴、大小鼠。從整體來說，大鼠是PCOS 模型研究較理想的動物研究對象。來曲唑是PCOS 造模中傾向的造模方法，其作用的原理是阻止雄激素向雌激素轉化，關鍵在于抑制芳香化酶的活性從而引起模型動物體內高雄激素水平［8］。在《PCOS 動物模型制備的規范》中，來曲唑構建的PCOS 模型大鼠與PCOS 患者的癥狀有許多類似之處，其吻合度達到70%以上［9］。本實驗研究結果顯示，來曲唑連續灌胃第11 天至造模結束，模型組大鼠均處于動情間期、體重顯著增加、血清性激素明顯提高，卵巢組織病理切片下可見大量囊狀樣擴張卵泡及黃體少見，由此提示本實驗成功復制了PCOS 模型大鼠［10］，同時模型鼠出現代謝異常。由此可見，來曲唑復制的模型與人PCOS 代謝情況相似，則更加適合PCOS 臨床機理研究。

目前西醫多采用藥物或手術的方式對 PCOS患者進行對癥治療，但單純的外源性對癥治療，其糾正PCOS 的性激素失衡具有局限性。中醫認為PCOS 病機是腎虛為本，痰瘀濕熱為標。根據多年的臨床經驗認為PCOS 病位主要在腎與沖任，本病病機以腎陰虧虛為主，腎陰虧損則腎臟氣化不及，血脈失養，燥熱內生，水津不化釀生痰濁、濕熱、瘀血之邪，痰熱濕瘀內阻于沖任為本病之標［11-12］，因此以滋腎清熱利濕化瘀為治法，據此組方滋腎清熱利濕化瘀方。方中山茱萸酸溫補益肝腎；知母、黃柏、玄參滋陰清熱；佐以白芥子、薏苡仁健脾利濕；桃仁、丹參活血通經；甘草調和藥性。諸藥合用，共奏滋陰清熱、活血通經之功，使腎陰得養、虛熱得清、血脈通暢。PCOS 鼠經滋腎清熱利濕化瘀方干預治療14 d 后的體質量及卵巢囊性卵泡數量減少、卵泡顆粒細胞層數增加，表明ZQLHF 對PCOS 模型大鼠具有較好的改善作用。性激素失衡是PCOS 發病特征之一，結果表明，ZQLHF 低、中、高劑量能明顯降低PCOS 鼠T、LH 分泌水平；同時中劑量ZQLHF 能降低LH/FSH 比值，ZQLHF可以通過平衡性激素水平干預PCOS 大鼠。

綜上，ZQLHF 可以降低PCOS 大鼠體質量、調控PCOS 大鼠性激素分泌水平、改善卵巢功能，其中ZQLHF 中劑量對PCOS 大鼠療效更優。