幽門螺桿菌相關慢性胃炎的胃微生態特征分析

牛占岳, 石巖巖, 李司柱, 薛 艷

(北京大學第三醫院, 1. 消化科, 2. 臨床流行病學研究中心, 北京, 100191)

中國慢性胃炎患病率接近90%[1], 幽門螺桿菌(H.pylori)是慢性胃炎最重要的危險因素。研究[2]顯示, 16S rRNA測序技術揭示了更多的胃黏膜菌群,且與H.pylori相關疾病的發生有關。本研究通過檢測H.pylori相關慢性非萎縮性胃炎和慢性萎縮性胃炎患者的胃黏膜菌群,探討H.pylori相關慢性胃炎的胃菌群特征和差異,以及胃菌群對H.pylori相關慢性胃炎的影響,現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年7月—2019年7月在北京大學第三醫院消化科就診的H.pylori感染患者為研究對象。慢性胃炎分為慢性非萎縮性胃炎和慢性萎縮性胃炎,診斷標準[3]: ① 慢性非萎縮性胃炎。內鏡下可見黏膜紅斑、黏膜出血點或斑塊,黏膜粗糙伴或不伴水腫及充血滲出等基本表現,病理組織學以慢性炎性細胞(單個核細胞,主要是淋巴細胞、漿細胞)浸潤為主,同時可見急性炎性細胞(中性粒細胞)浸潤。② 慢性萎縮性胃炎。內鏡下可見黏膜紅白相間,以白相為主,皺襞變平甚至消失,部分黏膜血管顯露,可伴有黏膜顆粒或結節狀等表現,病理組織學為胃黏膜固有腺體萎縮,確診以病理診斷為依據。根據木村-竹本分型評估慢性萎縮性胃炎的病變范圍。根據組織病理學結果將萎縮嚴重程度分為輕度、中度和重度。納入標準: ① 年齡18～65歲者; ② 胃鏡結合組織病理學明確診斷為慢性非萎縮性胃炎或慢性萎縮性胃炎者, Warthin-Starry(WS)染色確診H.pylori感染。排除標準: ① 既往接受過H.pylori根除治療者; ② 合并胃癌、消化性潰瘍、自身免疫性胃炎、Zollinger-Ellison綜合征、膽汁反流、脂肪肝等影響胃菌群的疾病者; ③ 4周內服用質子泵抑制劑、H2受體拮抗劑、鉍劑或抗生素等影響研究結果的藥物者; ④ 有胃或食管手術史者; ⑤ 肝腎功能異常者; ⑥ 合并嚴重的心血管、呼吸、血液、內分泌、神經或精神系統疾病者; ⑦ 妊娠或哺乳期女性患者; ⑧ 患者有濫用酒精或其他任何可能增加風險的臨床情況。本研究通過北京大學第三醫院醫學科學研究倫理委員會審核批準(批準文號: M2017389), 所有受試者均知情同意。

1.2 研究方法

本研究為前瞻性研究。符合研究標準的患者行胃鏡檢查,于胃竇部取黏膜1塊,行快速尿素酶試驗(RUT), 陽性患者于胃竇小彎及胃體小彎各取黏膜1塊,放入凍存管中,并置于-80 ℃冰箱凍存。再取胃竇部及胃體部黏膜1塊,行組織病理學檢查和WS染色,經組織病理學確診慢性胃炎且WS染色陽性,取凍存標本行胃菌群檢測。根據組織病理學結果,將患者分為慢性非萎縮性胃炎組和慢性萎縮性胃炎組。慢性非萎縮性胃炎患者多于慢性萎縮性胃炎患者,根據患者納入研究的順序,納入前6例明確診斷慢性萎縮性胃炎的患者,按1∶3的比例納入前18例明確診斷慢性非萎縮性胃炎的患者。

1.2.1 微生物多樣性測序: 根據 E.Z.N.A. ? soil DNA kit (Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)說明書進行微生物群落總DNA抽提取,使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量, NanoDrop2000測定DNA濃度和純度; 使用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對16S rRNA基因V3～V4區進行PCR擴增,使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物,利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA)進行純化,并使用QuantusTMFluorometer (Promega, USA)檢測。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit建庫,并用Miseq PE300平臺(Illumina公司)測序。

1.2.2 序列數據分析: 使用Fastp軟件對原始測序序列進行質控, Flash軟件拼接。使用Usearch軟件(version7.0, http://drive5.com/uparse/)根據97%的相似度對序列進行OTU聚類并剔除嵌合體。利用RDP classifier(http://rdp.cme.msu.edu/)對每條序列與Silva數據庫(SSU132)進行比對,設置閾值為70%,得到物種分類注釋結果,并基于此分析物種組成。通過Alpha多樣性分析(樣本內多樣性)反映物種多樣性,包括Shannon、Chao指數。通過Beta多樣性分析(樣本間多樣性)中的PCoA分析,評估組間物種組成差異; 應用Wilcoxon rank-sum test進行2組比較分析,篩選組間差異顯著的物種,以P<0.05作為差異有統計學意義的臨界值。通過相關性網絡分析,分析物種相關性。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 基本信息

本研究共納入24例患者,包括慢性非萎縮性胃炎18例(75.0%)和慢性萎縮性胃炎6例(25.0%)。慢性萎縮性胃炎組中, 3例萎縮范圍為C1, 3例萎縮范圍為C2; 2例萎縮程度為輕度, 4例萎縮程度為中度。慢性萎縮性胃炎組年齡高于慢性非萎縮性胃炎組,差異有統計學意義(P=0.003), 2組性別、體質量指數(BMI)、合并癥及合并用藥情況差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

24例樣本共得到1 265 486條序列(Reads)和981個操作分類單元(OTUs), 平均每個樣本包含52 728條Reads和181個OTUs。按照最小樣本序列對樣品進行隨機抽平處理后,共得到916個OTUs, 每個樣本包含30 041條Reads。

2.2 胃黏膜菌群組成和差異的分析結果

通過Coverage指數測定Good′s物種覆蓋率估計值,評估2組樣本的細菌種類在總細菌種類中的比率, 2組的Coverage指數均大于0.99, 且2組間差異無統計學意義(Wilcoxon秩和檢驗,P=0.099), 證實檢測結果覆蓋胃黏膜絕大多數的細菌種類。

慢性萎縮性胃炎組Alpha多樣性結果顯示,C1型和C2型的Shannon指數(Wilcoxon秩和檢驗,P=0.383)和Chao指數(Wilcoxon秩和檢驗,P=0.822)的差異無統計學意義,輕度和中度的Shannon指數(Wilcoxon秩和檢驗,P=0.663)和Chao指數(Wilcoxon秩和檢驗,P=0.072)的差異也無統計學意義,即不同萎縮范圍和不同萎縮程度的胃黏膜,其物種多樣性和豐度差異無顯著性。Beta多樣性的PCoA分析結果顯示,C1型和C2型的Bray_Curtis分析結果差異無統計學意義(ANOSIM分析,P=0.602), 輕度和中度的Bray_Curtis分析結果差異也無統計學意義(ANOSIM分析,P=0.592),表明不同萎縮范圍和不同萎縮程度的慢性萎縮性胃炎在物種組成、物種豐度和進化關系方面差異無顯著性。

群落組成分析顯示, 2組胃黏膜在門水平的菌群構成均主要為變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門和梭桿菌門,其中慢性萎縮性胃炎的梭桿菌門豐度高于慢性非萎縮性胃炎,差異有統計學意義(Wilcoxon秩和檢驗,P=0.008)。見表2。通過2組胃黏膜菌群的Alpha多樣性(即樣本內多樣性)和Beta多樣性(即樣本間多樣性)評估2組間菌群的構成差異。Alpha多樣性檢測結果顯示, 2組間物種多樣性Shannon指數(Wilcoxon秩和檢驗,P=0.218)和物種豐度Chao指數(Wilcoxon秩和檢驗,P=0.443)的差異均無統計學意義。見表3。Beta多樣性的PCoA分析顯示, 2組間Bray_Curtis結果的差異具有統計學意義(ANOSIM分析,P=0.046), 表明2組間在物種組成、物種豐度和進化關系方面的差異具有顯著性。見圖1。

表3 2組Alpha多樣性檢測結果

2組在屬水平的比較結果顯示,2組的優勢菌屬均為H.pylori菌屬,且慢性非萎縮性胃炎組的H.pylori豐度更高,但組間差異無統計學意義(P=0.218); 2組菌群豐度差異有統計學意義的前5位菌屬分別為梭桿菌屬(P=0.023)、纖毛菌屬(P=0.047)、普雷沃菌屬(P=0.016)、月形單胞菌屬(P=0.042)和密螺旋體屬(P=0.006)。所有差異具有統計學意義的菌屬均在慢性萎縮性胃炎的胃黏膜中豐度更高。見圖2。

2.3 胃黏膜菌群相關性分析結果

相關性網絡分析顯示,H.pylori相關慢性胃炎的胃黏膜菌群中,部分菌屬與H.pylori存在負相關性; 慢性非萎縮性胃炎組中,與H.pylori呈負相關性的菌屬種類多于慢性萎縮性胃炎組。見圖3。

3 討 論

H.pylori相關慢性胃炎的胃黏膜菌群構成主要包括變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門和梭桿菌門,與既往研究[4-5]結果相同。對于H.pylori相關慢性胃炎,H.pylori是胃黏膜菌群構成的主要菌屬[6], 本研究也得到了相同的結果。H.pylori能顯著降低胃黏膜菌群多樣性[5]。研究[6]顯示胃癌的發生與胃菌群的生態失調有關,共生菌群主要通過調節代謝和免疫反應參與腫瘤的發生。對慢性萎縮性胃炎的分析結果顯示,萎縮的范圍和嚴重程度對胃菌群的物種多樣性、物種豐度、物種組成和進化關系均無影響。既往研究[7]顯示,胃癌特有的微環境決定胃菌群的多樣性和構成,而非胃癌的分期或類型,相似的影響可能在胃黏膜萎縮階段已經體現,胃黏膜菌群可能與胃黏膜萎縮狀態的微環境有關,而非萎縮的范圍或嚴重程度。

慢性萎縮性胃炎組的年齡高于慢性非萎縮性胃炎組,與慢性萎縮性胃炎好發于高齡人群有關。涉及美國、英國、哥倫比亞和中國的大規模隊列研究[8]顯示,在美國、英國和哥倫比亞,消化道菌群多樣性與年齡相關,但40歲后趨于穩定,而中國人群的菌群多樣性與年齡無相關性。因此,本研究中的年齡差異對研究結果不存在影響。慢性萎縮性胃炎的梭桿菌門豐度顯著高于慢性非萎縮性胃炎。PCoA分析表明,慢性非萎縮性胃炎和慢性萎縮性胃炎在物種組成、物種豐度和進化關系方面的差異具有統計學意義。屬水平差異顯著性檢驗顯示,慢性萎縮性胃炎的胃黏膜H.pylori豐度呈降低趨勢。既往研究顯示,與慢性胃炎相比,胃癌的H.pylori豐度更低[9], 腸化生的H.pylori豐度介于慢性胃炎和胃癌之間[10]。由此可見,在腸型胃癌的發展過程中,H.pylori豐度呈逐漸降低趨勢。本研究結果顯示,與慢性非萎縮性胃炎相比,慢性萎縮性胃炎的胃黏膜菌群中H.pylori豐度更低,支持此變化趨勢。

慢性萎縮性胃炎的胃黏膜中梭桿菌屬顯著富集。核梭菌與口腔癌的發生密切相關,能夠激活細胞增殖、促進細胞侵襲、誘導慢性炎癥和免疫逃避[11]。此外,梭桿菌增加亞硝酸鹽的產生,使胃黏膜炎癥持續存在,促進胃癌的進展[12], 其分子途徑可能是梭桿菌誘導胃癌細胞外泌體HOTTIP上調,通過miR-885-3p/EphB2/PI3K/AKT軸促進胃癌進展[13]; 同時,梭桿菌能夠激活Toll樣受體4(TLR4)信號通路上調細胞色素P450單氧酶表達水平,促進CRC細胞代謝產生12, 13-EpOME,最終誘導腫瘤細胞發生上皮-間質轉化[14]。胃黏膜梭桿菌在慢性萎縮性胃炎中富集,證實了梭桿菌對慢性胃炎進展的影響。單因素相關性分析結果顯示,梭桿菌與除H.pylori外的其他菌群存在正相關性,梭桿菌可能通過與其他菌群的共同作用對慢性胃炎產生影響。

慢性萎縮性胃炎的胃黏膜纖毛菌屬同樣呈顯著富集。研究[15-16]顯示纖毛菌屬在胃癌和結腸癌的癌組織富集。在H.pylori感染率相近的情況下,胃癌高風險地區人群的胃黏膜中纖毛菌屬顯著富集[17]。因此,纖毛菌屬可能對腸型胃癌的發展過程存在影響,本研究中纖毛菌屬豐度的變化也支持纖毛菌屬對腸型胃癌的影響。普雷沃菌屬是胃癌相關致病菌,隨著腸化生、胃上皮內瘤變和胃癌的進展,其在胃黏膜菌群構成中豐度逐漸升高; 同時,胃癌旁組織中的普雷沃菌屬呈高豐度聚集[18]。研究[19]證實,胃癌的胃黏膜菌群中普雷沃菌屬富集,且胃炎持續存在與普雷沃菌屬有關; 同時,口腔普雷沃菌屬與胃黏膜萎縮的出現和持續存在相關性。本研究證實慢性萎縮性胃炎的胃黏膜中普雷沃菌屬豐度更高,支持普雷沃菌屬在腸型胃癌發展過程中存在影響。

研究[20]發現月形單胞菌屬在胃癌黏膜中富集。雖然月形單胞菌屬在胃黏膜菌群中的豐度較低,但其豐度在慢性胃炎至胃癌階段呈現持續富集狀態,且隨著慢性胃炎至胃癌的發展,豐度持續增加[21]。本研究結果顯示,在慢性非萎縮性胃炎到慢性萎縮性胃炎的發展過程中,月形單胞菌屬豐度增加,對腸型胃癌的發展可能存在影響。密螺旋體屬能夠通過調節腫瘤微環境和炎癥關鍵蛋白活性影響消化道腫瘤的發生[22]。密螺旋體屬在慢性萎縮性胃炎的胃黏膜富集,可能對腸型胃癌的發展過程存在影響。H.pylori感染的胃黏膜中,部分菌屬和H.pylori呈負相關性,且差異顯著性分析顯示,慢性萎縮性胃炎的胃黏膜中與H.pylori呈負相關性的菌屬種類減少,豐度明顯升高,可能與H.pylori豐度降低導致對其他菌群的抑制作用減弱有關,也可能與慢性萎縮性胃炎的胃酸減少更顯著有關。研究[23]顯示,在胃癌高危地區,H.pylori根除治療和安慰劑治療的參與者在人群水平的胃癌發生率相似。因此,在慢性胃炎的發展過程中,其他菌群可能對胃癌的發生存在獨立影響。

綜上所述,慢性非萎縮性胃炎和慢性萎縮性胃炎的胃黏膜菌群存在差異,且與胃黏膜萎縮的微環境有關,而與萎縮程度和萎縮范圍無關。慢性萎縮性胃炎胃黏膜中的梭桿菌屬、纖毛菌屬、普雷沃菌屬、月形單胞菌屬和密螺旋體屬顯著富集,與慢性胃炎進展相關。