廣西道地藥材肉桂及陰香的DNA分子鑒定研究

李立,吳桂凡*,羅軼,李麗莉*,凌婕,馬雙成

1(廣西壯族自治區食品藥品檢驗所,國家藥品監督管理局中藥材質量監測與評價重點實驗室,廣西 南寧,530021) 2(中國食品藥品檢定研究院,北京,100050)

中藥肉桂為樟科的植物肉桂(CinnamomumcassiaPresl)干燥樹皮,以“牡桂”之名始載于《神農本草經》,列為上品。肉桂自古藥食同源,其性辛、甘、大熱。歸腎、脾、心、肝經,具補火助陽、引火歸元、散寒止痛、溫通經脈等作用[1]。現代藥理學研究證明肉桂具有鎮痛、抗菌、抗腫瘤的作用,對消化系統、心血管系統和免疫系統疾病也有良好的療效[2-7]。2018年,中華人民共和國國家衛生健康委員會將肉桂列入了《按照傳統既是食品又是中藥材的物質目錄》的征求意見稿中。2021年,廣西壯族自治區中醫藥管理局將肉桂確定為“桂十味”道地藥材品種。廣西作為肉桂藥材的道地產區,其主產區主要在廣西防城港市、東興市、玉林市和貴港市等。肉桂作為藥食兩用中藥材,其相關產品涉及醫藥、食品、日用品、農藥等多個領域,是國際上重要的藥用植物品種[8]。肉桂用量大、栽種時間長、價格高、貨源緊缺,因此在廣西市場上常出現以肉桂同科植物陰香(Cinnamomumburmanni)冒充肉桂出售,其在外觀、性狀、顏色及氣味等方面特征都與肉桂相似,容易造成混用的現象[9-10]。目前鑒別肉桂和陰香主要是通過性狀、組織結構、形態特征、理化性質等傳統鑒別方法[11-14]。這些方法易受樣品形式、組織來源、貯存條件和人員操作等因素的影響,存在人為主觀因素強、實驗穩定性差等弊端,尤其是當肉桂和陰香經研磨成粉后,傳統的鑒別方式很難將二者區別。因此需要建立一種高效、便捷、精確的區分肉桂和陰香的方法。

近年來,隨著分子生物學技術在中藥學領域的滲透與發展,基于DNA分子生物技術的分子鑒定方法稱為中藥4大鑒定方法(基原鑒定、性狀鑒定、顯微鑒定、理化鑒定)的重要補充,得到了不斷的發展與應用。作為實用性強的分子生物技術,不僅具有鑒定方法不受個體形態特征限制、不受個體發育階段影響,從基因水平上能客觀區分物種的優勢,還具有操作方法相對簡便等優勢。本研究通過提取不同產地的肉桂和陰香的基因組DNA,使用psbA-trnH引物擴增后測序,通過查找兩者的psbA-trnH序列差異,設計并篩選出高特異性的鑒別引物,建立了可區別兩者的聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)體系,為藥食同源物種肉桂的質量評價提供了新的DNA分子標記方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉桂藥材的道地產區在廣西,故本實驗的樣品均采集于廣西區內,主要來自企業種植基地、普通農戶自家田地散種以及野外采集。樣品經廣西食品藥品檢驗所黃清泉主管藥師鑒定,硅膠干燥,陰干保存,存放于廣西食品藥品檢驗所標本室,樣品具體信息見表1。

表1 肉桂及其陰香的樣品采集信息表Table 1 Sample collection information table of Cinnamomum cassia and Cinnamomum burmanni

瓊脂糖,BIOWEST公司(批號：111885);GelRed,BIOTIUM公司(批號：41003);PrimeSTAR Max DNA Polymerase、DNA Marker,TAKARA公司(批號：AL52852A、AI5230SA);2X F8 LongFast PCR MasterMix,艾德萊公司(批號：331523AX);KOD OneTM PCR Master Mix,Toyobo公司(批號：041500);Platinu Ⅱ Hot-Start Green PCR Master Mix,ThermoFisher公司 (批號：01147162);Q5酶,NEW ENGLEND公司(批號：0161512);新型植物組織基因組DNA提取試劑盒,天根公司(批號：W0229);引物由華大基因合成,其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

S1000梯度PCR擴增儀,美國Bio-Rad公司;TA96SG梯度PCR擴增儀,德國耶拿公司;Mini-sub cell GT瓊脂糖凝膠電泳儀,美國Bio-Rad公司;Nano Value PLUS微量紫外分光光度計,Cytiva公司;GelDoc XR+全自動凝膠成像系統,美國BIO-RAD公司;ME203型電子天平,Mettler Toledo公司;MIKRO220R高速冷凍離心機,Hettich公司;XW-80A漩渦振蕩儀,Kylin-Bell Lab Instruments公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 DNA提取

取適量樣品用75%(體積分數)乙醇擦拭表面,晾干,用球磨儀研磨成粉末。取約20 mg,采用天根新型植物基因組DNA提取試劑盒提取樣品的DNA,然后使用微量紫外分光光度計測定DNA的濃度和純度,合格的DNA樣品于-20 ℃保存備用。

1.3.2 PCR擴增及產物測序

利用植物藥DNA條形碼通用引物psbA-trnH序列對提取的DNA進行擴增并測序。PCR擴增反應體系總體積為20 μL,其中2X F8 LongFast PCR MasterMix 10.0 μL,psbA-trnH上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,DNA模板1.0 μL,滅菌蒸餾水8.0 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,運行35個循環;72 ℃延伸10 min。將擴增所得產物送至測序公司進行雙向測序。

1.3.3psbA-trnH序列分析

將測得的序列去除測序低質量數據,使用BioEdit軟件對正向及反向序列進行拼接。使用MEGA 6.0軟件對肉桂及其陰香的拼接序列進行對比分析,尋找可供特異性引物設計的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點。通過圖1的序列比對發現,肉桂和陰香基本上是不連續的單堿基差異,在第34個堿基至第35個堿基處,肉桂為AA,陰香為GT;在第37個堿基至第38個堿基處,肉桂為AG,陰香為CT;在第40個堿基至第41個堿基處,肉桂為AC,陰香為TT。

圖1 肉桂及陰香的psbA-trnH序列比對

1.3.4 特異性引物設計

根據肉桂及陰香在葉綠體psbA-trnH基因序列中發現的特異性位點,使用引物設計軟件Primer Premier 5分別設計肉桂及陰香的特異性引物。引物序列信息見表2。

表2 特異性引物信息表Table 2 Specific primers information table

2 結果與分析

2.1 PCR反應條件的篩選與優化

2.1.1 退火溫度考察

使用艾德萊2X F8 LongFast PCR MasterMix酶,按PCR擴增反應體系,退火溫度分別考察了50、52、54、56、58、60 ℃。經試驗,如圖2所示,當退火溫度由50 ℃升高至60 ℃后,肉桂和陰香經肉桂引物擴增后,只有在54 ℃時肉桂在100～200 bp出現單一擴增條帶,而陰香沒有擴增條帶,其他溫度下擴增陰香均有干擾;因此選擇54 ℃作為肉桂引物擴增時的最佳退火溫度。另外,2個品種經陰香引物擴增后,在56 ℃時陰香在200～300 bp有明顯的單一擴增條帶, 而肉桂沒有擴增條帶,當溫度進一步升高,條帶亮度減弱,因此陰香引物擴增時的最優退火溫度為56 ℃。

M-D1000 DNA Marker;1-空白對照;2、4、6、8、10、12-陰香藥材;3、5、7、9、11、13-肉桂藥材A-肉桂引物退火溫度考察;B-陰香引物退火溫度考察圖2 不同退火溫度條件下凝膠電泳檢測結果

2.1.2 反應循環數考察

如圖3和圖4所示,肉桂引物在35個循環的時候得到明顯亮度的單一條帶,陰香引物在40個循環出現明顯亮度的單一條帶,最終確定肉桂引物的循環數為35,陰香引物的循環數為40。

M-D1000 DNA Marker;11-空白對照;2、4、6、8、10-陰香藥材;1、3、5、7、9-肉桂藥材圖3 肉桂引物不同循環次數條件下凝膠電泳檢測結果

2.1.3 DNA模板量的考察

本實驗考察了1、2、5、10、20、40 ng的DNA模板量,結果顯示(圖5、圖6),肉桂引物在加入模板量為5 ng時有隱約可見的條帶,加入量為20 ng時條帶亮度明顯;陰香引物在模板加入量為20 ng時才出現條帶,40 ng時條帶亮度明顯。

M-D1000 DNA Marker;1～5-1、2、5、10、20 ng;6-空白對照圖5 肉桂引物不同模板量下凝膠電泳檢測結果

M-D1000 DNA Marker;1～6-40、20、10、5、2、1 ng;7-空白對照圖6 陰香引物不同模板量下凝膠電泳檢測結果

2.1.4 摻偽檢出限的考察

制備陰香質量分數分別為1%、5%、10%、20%、50%的肉桂和陰香混合粉末樣品,提取基因組DNA后進行PCR實驗,結果顯示(圖7),陰香質量分數為10%以上時出現陰香特異性條帶,說明混合樣品中陰香檢出限為10%。

2.2 耐受性考察

2.2.1 引物酶的種類考察

本實驗采用2X F8 LongFast PCR MasterMix(艾德萊)、PrimeSTAR Max DNA Polymerase(TAKARA)、KOD OneTMPCR Master Mix(Toyobo)等不同品牌的酶對鑒別反應結果影響的檢測。結果表明(圖8、圖9),3種聚合酶都可擴增出肉桂和陰香的特異性條帶,可鑒別出肉桂和陰香。陰香引物用KOD OneTM PCR Master Mix(Toyobo)牌子的酶擴增出的條帶特別亮,可考慮用該引物酶進行擴增。

M-D1000 DNA Marker;1、5、9-空白對照;2、6、10-陰香藥材;3、7、11-肉桂藥材;4、8-空泳道圖8 肉桂引物不同引物酶條件下凝膠電泳檢測結果

M-D1000 DNA Marker;1、5、9-空白對照;2、6、10-肉桂藥材;3、7、11-陰香藥材;4、8-空泳道圖9 陰香引物不同引物酶條件下凝膠電泳檢測結果

2.2.2 PCR儀器品牌考察

本實驗采用美國ABI veriti梯度PCR擴增儀和德國耶拿TA96SG梯度PCR擴增儀對建立的PCR體系的耐受性進行考察,結果均能得到很好的擴增效果(圖10),說明所建立的PCR鑒別體系耐受性良好。

2.2.3 適用性及專屬性考察

利用優化好的實驗條件,對所有采集到的肉桂及陰香進行驗證,結果顯示(圖11、圖12),肉桂經肉桂引物擴增后在100～200 bp處出現特異性條帶,陰香經陰香引物擴增后在200～300 bp處出現特異性條帶,表明本方法具有良好的特異性,能達到對2個品種進行鑒別。

M-D1000 DNA Marker;1、14-空白對照;2～13-肉桂藥材;15～21-陰香藥材A-肉桂藥材PCR擴增產物凝膠電泳檢測結果;B-陰香藥材PCR擴增產物凝膠電泳檢測結果圖11 肉桂及陰香藥材凝膠電泳檢測結果(肉桂引物)

3 結論與討論

近年來有文獻報道采用分子生物學技術對肉桂及其近似物種進行研究。楊培等[15]通過葉綠體psbA-trnH條形碼序列對肉桂及其近似品種的物種內及物種間的遺傳關系進行了研究,成功構建了鑒別肉桂及其近似品種的系統發育樹。但利用DNA條形碼鑒別的弊端在于每次都需要對分析樣品進行測序分析,且相近類群單位點的DNA條形碼缺乏足夠變化,所以不能準確鑒別所有種。DOH等[16]比較了來自越南、中國、日本的肉桂、錫蘭肉桂和香樟等的DNA內部轉錄間隔區的核苷酸序列,可用于肉桂皮、桂枝、煙仔桂植物基原的鑒定,但未能對肉桂和陰香的植物基原進行鑒定。

本實驗通過采用植物組織基因組DNA提取試劑盒提取,提取的DNA濃度高,純度佳,保證了DNA模板的質量。引物設計是整個研究的關鍵點,直接關系到目標物種是否能夠成功檢出。本實驗選取肉桂和陰香的psbA-trnH基因序列作為靶基因,利用MEGA 6.0軟件對其基因序列進行序列同源性比較分析,尋找特異性SNP位點,利用Primer Premier 5分別設計肉桂及陰香的特異性引物,并通過考察退火溫度、反應循環數、引物酶等獲得各自最優的PCR反應體系。結果顯示,肉桂經肉桂引物擴增后在100～200 bp處出現特異性條帶,陰香無條帶;陰香經陰香引物擴增后在200～300 bp處出現特異性條帶,肉桂無條帶。實驗結果不僅可在普通的瓊脂糖凝膠上分辨,還避免了因香辛料加工過程中DNA降解導致的擴增效率降低,提高了鑒定結果的準確性。

與其他分子標記方法相比,SNP方法因其簡便快捷、靈敏度高的優點已在中藥材的真偽鑒別中有應用[17-23]。本研究利用了基于SNP位點建立的PCR體系實現了肉桂和陰香的鑒別,在檢測樣品時無需再對樣品進行測序,可以在較短時間內完成大批量樣品的快速鑒別,具有穩定性好、準確度高、特異性強等特點,為保障肉桂的藥材質量,肉桂初加工及深加工產品的植物來源提供了有力的技術支持。