A型流感病毒誘導細胞炎癥反應的研究進展

高 欣,孫怡朋

(中國農業大學動物醫學院,北京 100193)

流感病毒(influenza virus)屬于正黏病毒科,是一種含囊膜病毒,可分為A型流感病毒(influenza A virus, IAV)、B型流感病毒、C型流感病毒和D型流感病毒,其中A型流感病毒能夠感染包括人類、豬、馬、禽等多種物種,具有高度傳染性,是臨床上最重要的病毒之一[1]。IAV 基因組包含8個負鏈RNA片段,根據毒株不同可編碼11～14種蛋白質,其中血凝素(HA)是負責病毒入侵呼吸道細胞的主要糖蛋白,可附著在宿主細胞表面唾液酸殘基,在病毒吸附和穿膜過程中起關鍵作用[2]。IAV感染始于上呼吸道,病毒穿過呼吸道上皮的黏液層后入侵細胞,并誘導宿主先天免疫應答,同時受感染的氣道上皮細胞募集多種免疫效應細胞,包括中性粒細胞、單核細胞和巨噬細胞,導致宿主過度炎癥和局部組織損傷[3]。在免疫能力正常的宿主中,病毒傳播僅控制在上呼吸道內,導致輕度疾病,當宿主年齡較大、患有呼吸系統疾病或免疫狀態低下時,病毒可從上呼吸道擴散至肺組織,表現為上皮細胞死亡、過度炎癥和氣道通透性增加,導致病毒性肺炎和急性肺損傷[4]。此外,由于流感病毒發生抗原漂移,即不同毒株的片段在同一宿主中互換時,病毒將具有高致病性并引起全球大流行,造成大量死亡[5]。H1N1、H5N1和H7N9亞型流感病毒在誘導宿主炎癥反應中占主導地位,更傾向于感染肺組織,引起彌漫性肺泡損傷。

IAV感染引起宿主死亡的主要原因是宿主發生過度炎癥反應,因此抗流感不僅要抑制病毒復制,更要靶向相關炎癥因子在細胞間傳遞,已有多項研究證明,在IAV感染后期,通過靶向NLRP3抑制炎癥小體激活,導致白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和IL-18的分泌受到抑制,對IAV動物模型的恢復有積極影響[6]。目前靶向宿主炎癥開發抗IAV新療法已成為研究熱點,本文就IAV感染誘導的炎癥反應以及相關免疫調節劑進行歸納總結,為未來抗IAV藥物的開發提供依據。

1 對IAV感染的細胞反應

模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)識別IAV后,活化干擾素調節因子3(interferon regulatory factor 3, IRF3)、IRF7以及核因子κB (nuclear factor-κB,NF-κB),導致促炎細胞因子和趨化因子的產生,此外,NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3, NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)、IL-1β和IL-18前體表達也顯著增加,觸發NLRP3炎癥小體組裝和激活,誘導IL-1β和IL-18活化并分泌(圖1)。與炎癥反應相關的炎性介質包括趨化因子、細胞因子以及轉錄因子,在IAV感染中誘導過度炎癥反應,導致宿主組織損傷。

圖1 IAV誘導炎癥反應示意圖Fig.1 Schematic diagram of IAV inducing inflammatory response

1.1 趨化因子

趨化因子是由多種細胞產生的小分子,與白細胞的特定表面受體結合后,改變白細胞形狀和行為,從而通過血管內皮遷移到炎癥部位,參與維持體內平衡,控制免疫細胞的遷移[7]。在IAV感染期間,免疫細胞的募集對機體免疫反應、病原體清除和組織穩態重建至關重要。在IAV感染早期,趨化因子大量產生,特別是趨化因子C-C基序配體2(chemokine C-C motif ligand 2, CCL2)的表達顯著增加,誘導NK細胞和炎性單核細胞的募集,在控制早期病毒復制中發揮重要作用[8]。英國牛津大學Maclean等[9]研究發現,小鼠再次感染IAV之前,常駐記憶B細胞稀疏地散布在小鼠肺組織中,IAV再次感染可誘導趨化因子C-X-C基序配體9(chemokine C-X-C motif ligand 9, CXCL9)和CXCL10的表達,導致表達趨化因子C-X-C基序受體(chemokine C-X-C receptor, CXCR3)的常駐記憶B細胞招募到感染部位,迅速分化為漿細胞,增加局部抗體濃度。然而,趨化因子CCL2的大量產生以及炎性單核細胞的過度募集會增加IAV感染的發病率,同時CCL2受體的抑制會降低小鼠對細菌繼發感染的易感性[10]。趨化因子CXCL1和CXCL2也在IAV感染中發揮重要作用,激活后能夠募集大量中性粒細胞,使IAV感染誘導的小鼠肺損傷更嚴重,小鼠死亡率增加[11]。肺上皮細胞產生的CXCL2與IAV急性肺損傷密切相關,是IAV誘導急性肺損傷的主要因子[12]。此外,在IAV和細菌合并感染模型中,CXCL2的過度產生與小鼠肺損傷增加、體重減輕和死亡有關[11]。

1.2 細胞因子

IAV誘發肺炎的一個主要表現即為體內炎癥因子過度表達而出現的“細胞因子風暴”[13]。TNF-α被認為是IAV細胞因子風暴中心的促炎細胞因子,負責在IAV入侵后上調IL-1和IL-6的產生,TNF-α升高表明IAV的高致病性,動物試驗結果顯示,與野生型小鼠相比,TNF-α受體缺失鼠感染H5N1流感病毒后發病率顯著下降,但病毒滴度沒有顯著差異[14]。因此,促炎細胞因子TNF-α在IAV感染中引起機體炎性損傷,靶向TNF-α可能是治療IAV感染患者的潛在方法。IL-1α和IL-1β是NLRP3炎癥小體激活后切割IL-1的產物,通過募集白細胞和誘導其他細胞因子的產生,導致T細胞活化,與IAV引起的肺損傷相關[15]。IL-6是參與機體炎性反應的重要促炎細胞因子,在IAV感染中發揮重要作用[16]。IL-6能夠活化內皮細胞,誘導P-選擇素、E-選擇素和整合素的表達增加,是白細胞募集到肺部所必需的,阻斷小鼠IL-6可降低IAV感染小鼠的嚴重程度[17]。IL-17在IAV感染中也發揮非常重要的作用,在感染早期促進中性粒細胞進入肺部,同時在H1N1感染小鼠募集B細胞[18]。另有一項研究表明,IL-17不能增加病毒清除率,而是通過增強炎癥反應促進IAV感染的病理變化[19]。與此一致的是,在H1N1 IAV大流行期間,患者血清中發現高水平的IL-17,導致機體發生嚴重的炎癥反應,發病率顯著增加,預后不良[20]。

1.3 轉錄因子

病毒感染引發炎癥反應取決于幾種轉錄因子的激活,包括NF-κB、干擾素調節因子(interferon regulatory factor,IRF)、激活蛋白(activitor protein 1,AP-1)、信號轉導及轉錄活化因子(signal tronsducer and activitor of transcription,STAT)和CCAAT增強子結合蛋白β(CCAAT/enhancer-binding protein β,C/EBPβ)等。NF-κB在炎癥反應中發揮重要作用,IAV入侵細胞可導致IKBα/NF-κB解離,從而釋放NF-κB并易位到細胞核,調節TNF-α、IL-6等促炎介質的轉錄[21]。研究發現H5N1 IAV感染患者誘導大量促炎介質均依賴NF-κB[22]。Bernasconi等[23]發現IAV在A549細胞中活化IKK,導致NF-κB的持續激活,產生高水平的IL-8,IL-8誘導炎癥和組織損傷。AP-1是MAPK通路的主要底物,主要由c-Fos和c-Jun組成,調節促炎細胞因子的水平,Wan等[24]發現使用AP-1信號抑制劑U0126或c-Jun siRNA處理巨噬細胞可降低IL-1β和caspase-1前體的mRNA,并抑制H3N2 IAV感染時NLRP3炎癥小體的活化。此外,不同病毒激活轉錄因子的方式存在很大差異,這導致不同病毒產生不同的趨化因子和細胞因子。

2 IAV感染誘導炎癥反應的機制

IAV基因組編碼的幾種蛋白中,已報道HA、聚合酶堿性蛋白2(polymerase basic protein 2,PB2)、PB1、核蛋白(nucleoprotein,NP)、基質蛋白2(matrix protein 2,M2)、非結構蛋白1(nonstructural protein 1,NS1)以及PB1-F2在宿主炎癥反應中發揮重要作用(表1)[25-31]。

表1 IAV蛋白質誘導的炎癥反應

2.1 HA蛋白

IAV 片段4編碼HA蛋白,是構成IAV囊膜纖突的主要成分之一,在調節宿主炎癥反應中發揮重要作用。Zhao等[25]發現H1N1 HA處理HUVECs細胞后,細胞ICAM-1和IL-6 mRNA和蛋白水平均增加,促進細胞的炎癥反應,體內尾靜脈注射給小鼠,小鼠肺組織出現明顯的彌漫性病理損傷,表現為肺泡間隙擴大伴有肺泡血管擴張,肺泡腔和間質炎性浸潤,肺泡腔內紅細胞滲出。Nieto等[32]進一步發現在A/California/04/09 (CAL)引入HA S110 L突變在人和小鼠細胞中不會改變IAV pH穩定性、遷移率和入侵細胞能力,對病毒復制能力的影響也較小,但與野毒株相比,HA S110 L突變會顯著抑制病毒的致病性,降低小鼠的肺損傷和炎癥反應,同時具有更少的炎性細胞浸潤。此外,HA含有二硫鍵,在內質網經過折疊和糖基化形成最終構象。Chamberlain等[33]發現抑制肺上皮細胞中蛋白質二硫鍵異構酶的活性,降低二硫鍵的形成,可減少H1N1和H3N2流感病毒HA的寡聚化,顯著降低肺上皮細胞的炎癥反應,在體內使小鼠缺失蛋白質二硫鍵異構酶,也可導致IAV感染后炎癥反應顯著降低。因此,二硫鍵在HA的功能中發揮重要作用。

2.2 聚合酶

IAV聚合酶是由PB2、PB1和聚合酶酸性蛋白(polymerase acid protein, PA)組成,均已報道參與宿主炎癥反應,其中PB2是IAV宿主范圍和毒力的主要決定因素。Forero等[26]研究發現,攜帶1918年大流行IAV PB2的重組病毒感染小鼠可增加病毒的適應性導致小鼠致死率上升,并證明1918年大流行IAV PB2能夠增強宿主的炎癥反應,促進肺部炎性細胞浸潤,抑制對肺再生和修復至關重要的Wnt信號通路,從而促進IAV相關的病理損傷。禽IAV在哺乳動物適應性增強的標志PB2 E627K突變,增強病毒在哺乳動物細胞中復制的同時,也影響了宿主的炎性反應。Yu等[34]發現H9N2禽流感病毒的PB2 627位點發生點突變時在BALB/c小鼠中表現出不同的致病性,這種病理變化與炎癥激活因子NLRP3相關,與627K相比,627E的IAV感染后第3天,小鼠肺中NLRP3、IL-1β和TNF-α表達顯著升高。DesRochers等[35]發現北美高毒力H7N3和低毒力H7N9禽流感病毒在DBA/2小鼠體內發病機制的差異主要取決于PB2和PA聚合酶基因,H7N3 PB2 E358V突變以及PA P190 S和Q400P突變降低了病毒毒力,同時PB2 E358V突變和PA P190 S突變也導致H7N3禽流感病毒感染后宿主炎癥反應降低,小鼠肺組織CCL2、CCL3和IL-1β顯著減少。PB1可通過傳感器參與宿主炎癥反應。Kuriakose等[27]發現雙鏈DNA傳感器ZBP1可識別PB1,通過RIPK1-RIPK3-caspase-8觸發細胞炎癥反應,此外Z-DNA結合蛋白(Z-DNA binding protein 1, ZBP1)能夠調節NLRP3炎癥小體活化以及促進IAV感染誘導的細胞凋亡、壞死性凋亡和焦亡,ZBP1缺失可降低小鼠在IAV感染期間的炎癥反應和上皮損傷,從而免于死亡。

2.3 NP蛋白

IAV病毒蛋白和宿主細胞蛋白之間的相互作用可影響宿主的炎癥反應。Kim等[28]發現IAV NP蛋白通過與toll樣受體2(toll-like receptor 2,TLR2)和TLR4結合,以劑量依賴性方式誘導BMDM細胞中NF-κB和MAPK的激活,促進促炎細胞因子和趨化因子產生,此外NP還觸發caspase-1活化以及NLRP3寡聚化,加劇宿主病理損傷。因此,NP主要通過與宿主蛋白相互作用參與宿主炎癥反應。

2.4 M2蛋白

IAV RNA第7段編碼M蛋白為基質蛋白,包括M1和M2,其中M2蛋白與NLRP3炎癥小體密切相關。NLRP3炎癥小體的激活需要兩個信號,信號1由TLR或RIG-Ⅰ樣受體(retinoic-acid inducible gene Ⅰ-like receptor, RLR)啟動,導致caspase-1前體以及IL-1β和IL-18前體上調,信號2是感染或組織損傷產生的應激信號,能夠通過離子通道、溶酶體破裂和活性氧(reactive oxygen species, ROS)三種途徑促進caspase-1募集NLRP3以及caspase-1、IL-1β和IL-18的成熟,最終激活NLRP3炎癥小體[36]。IAV誘導宿主炎癥反應的重要機制之一是激活NLRP3炎癥小體,信號1為巨噬細胞和樹突狀細胞中的TLR7信號激活,導致IL-1β和IL-18等促炎細胞因子的合成,信號2為M2蛋白作為離子通道促進K+與Na+外排,導致離子失衡和ROS大量產生,從而激活NLRP3炎癥小體[29]。此外,在IAV野毒感染BMDM細胞時,細胞能夠分泌IL-1β和IL-18,但當M2蛋白突變失去功能時,IL-1β和IL-18不能正常產生,而將M2重組蛋白刺激BMDM細胞或BMDC細胞可激活NLRP3炎癥小體,能夠正常產生IL-1β和IL-18以及其他炎性因子[29]。因此,M2蛋白作為離子通道是NLRP3炎癥小體活化的重要步驟,在IAV誘導宿主炎癥反應中發揮重要作用。

2.5 NS1蛋白

IAV RNA第8段編碼NS蛋白,包括NS1和NS2,已有研究表明NS1參與宿主炎癥反應過程。Gaba等[30]發現A/Puerto Rico/8/34 (PR8)NS1蛋白能夠與混合譜系激酶結構域樣蛋白(mixed-lineage kinase domain-like protein, MLKL)相互作用,促進MLKL寡聚化和膜易位,增強MLKL介導的NLRP3炎癥小體活化,使IL-β分泌增加,同時MLKL膜易位導致膜破裂和細胞離子穩態喪失,誘發細胞壞死性凋亡。然而,Tao等[37]發現犬H3N2 NS1蛋白通過抑制NF-κB的激活減少促炎細胞因子產生,同時NS1能夠與NLRP3直接相互作用,阻斷凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD, ASC)寡聚化,從而使NLRP3炎癥小體失活,此外,NS1阻斷caspase-1前體裂解,使IL-1β和IL-18前體不能成熟,導致宿主炎癥反應大大降低。兩種不同的研究結果可能與NS1序列相關。Clark等[38]發現2009年大流行的H1N1流感病毒有6個氨基酸發生突變(E55K、L90I、I123V、E125 D、K131E和N205 S),含有這6個突變的NS1蛋白與未發生突變的NS1相比,能夠誘導更低水平的宿主炎癥反應,減少宿主病理損傷,但不影響細胞或小鼠肺中的病毒滴度。NS1誘導較低水平的炎癥可能代表IAV對宿主的適應性增加,為IAV大流行提供了一種新的機制。

2.6 PB1-F2蛋白

PB1-F2由IAV基因片段2編碼的非結構蛋白,與病毒的致病性密切相關。Pinar等[31]發現H7N9和A/Puerto Rico/H1N1(PR8)PB1-F2能夠顯著促進線粒體活性氧的產生,激活NLRP3炎癥小體并誘導NLRP3依賴性的肺部炎癥和炎性細胞募集,使用NLRP3特異性抑制劑MCC950治療細胞或小鼠則可顯著降低IL-1β成熟,減少炎性細胞募集和細胞因子產生。PB1-F2還可以與宿主蛋白相互作用從而影響IAV的致病性。Leymarie等[39]通過酵母雙雜交方法鑒定發現PB1-F2能夠與鈣結合和卷曲螺旋結構2(calcium-binding and coiled-coil domain 2,CALCOCO2,也稱NDP52)互作,進而與TRAF6形成三聚體,增強MAVS誘導的NF-κB活性,促進促炎細胞因子TNF-α和IL-8的表達,引起宿主強烈的炎癥反應。PB1-F2影響宿主炎癥反應可能與其特殊的結構相關,PB1-F2沒有固定結構,在水溶液中形成無規卷曲,在極性溶液中形成富含α螺旋或β折疊的結構,根據細胞類型不同,PB2-F2也存在二聚體、三聚體等多聚體結構,并具有形成淀粉樣纖維結構的傾向[40]。Chevalier等[41]通過傅里葉變換紅外光譜技術和深紫外測量顯微鏡確定了IAV感染小鼠中存在PB1-F2淀粉樣纖維結構,并給予NF-κB熒光素酶轉基因小鼠鼻內滴注單體、淀粉樣纖維以及截短形式的PB1-F2,結果發現PB1-F2單體和淀粉樣纖維結構能夠誘導強烈的炎癥反應。因此,PB1-F2誘導的炎性反應與蛋白質序列多態性和寡聚狀態密切相關。

3 免疫調節治療

炎性反應的過度激活與嚴重的肺損傷和死亡相關,因此可采用免疫調節治療改善IAV感染引發的過度炎性反應[42]。給與IAV重癥患者抗炎藥物可能會減輕高水平促炎介質帶來的臨床癥狀,減少與IAV感染相關的并發癥,并且可以與抗病毒藥物協同發揮作用[43]。IAV感染的免疫調節治療需要遵循幾點原則,包括在病毒感染出現癥狀后使用藥物具有顯著療效,針對IAV的抗炎療法應能夠與目前的抗病毒藥物協同作用,抗炎療法應優先降低IAV感染后繼發細菌感染的風險,以及抗炎療法不應干擾宿主抗病毒的能力[44]。表2總結了IAV感染的一些免疫調節策略[45-61]。

表2 IAV感染的免疫調節策略

臨床研究中已發現在IAV感染中有效的免疫調節劑。他汀類藥物是羥甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑,屬于降脂藥物,在臨床上廣泛應用,近幾年的研究發現,他汀類藥物能夠抑制中性粒細胞募集和促炎細胞因子的分泌從而抑制炎性反應,是在IAV感染中常用的免疫調節藥物[62]。研究表明,2009年H1N1流感病毒感染住院患者中給與他汀類藥物可降低死亡率[45]。另有研究發現,在小鼠感染前給與他汀類藥物可改善肺損傷并抑制H5N1、H3N2和H1N1流感病毒的復制[63]。此外,辛伐他汀可以通過抑制與細胞骨架功能相關的蛋白質來降低促炎細胞因子的水平并減少病毒復制[64]。

另一類在IAV感染期間改善炎性反應的是環氧合酶-2(COX-2)抑制劑,COX-2抑制劑主要作用是鎮痛、抗炎和退熱[65]。H5N1流感病毒感染可導致上皮細胞COX-2顯著上調,抑制COX-2可顯著改善小鼠臨床癥狀,與神經氨酸酶抑制劑聯合使用效果更佳[46]。在H1N1和H3N2流感病毒感染期間,使用撲熱息痛或塞來昔布抑制COX-2可抑制小鼠肺部的病理變化,但不影響病毒的清除率[66]。然而,在人類患者中缺乏此類藥物的臨床數據,因此COX-2抑制劑的作用有待進一步驗證。

在實驗性IAV感染的背景下,過氧化物酶體增殖物激活受體(proxisome proliferator-activated receptor,PPAR)激動劑也具有抗炎作用。PPAR激動劑是代謝紊亂(如糖尿病)的治療藥物,PPAR激活后可抑制NF-κB、AP1和STAT信號通路,導致促炎細胞因子減少[67]。H2N2流感病毒感染小鼠模型中,PPAR激動劑吉非羅齊可發揮抗炎作用,增加小鼠的存活率[68]。吡格列酮和羅格列酮也是治療IAV感染的免疫調節藥物,能夠減少季節性H1N1流感病毒感染模型中的小鼠體重和致死率。此外,曲格列酮顯著降低了IAV感染誘導的肺部損傷[47]。促消退介質也是控制IAV感染誘導炎性的潛在藥物。其中脂氧素和保護素是脂質介質,具有抗炎和促消退的作用,在IAV感染中具有保護作用[69]。脂氧素相關基因下調將導致促炎細胞因子上調,促進病毒傳播到其他器官。保護素作為炎性反應的調節劑,可改善感染H5N1流感病毒小鼠的存活率,抑制IAV復制[48]。已有研究表明,阻斷血小板活化因子受體(platelet activating facor receptor, PAFR)降低小鼠炎性反應,提高感染小鼠的存活率,同時在感染后3 d使用PAFR拮抗劑,仍然具有抑制小鼠炎性反應的作用[49]。此外,PAFR拮抗劑和奧司他韋聯合使用能夠顯著降低感染小鼠的致死率。

細胞受體在炎性反應中發揮重要作用。CC趨化因子受體2(CC chemokine receptor 2, CCR2)是多種白細胞的趨化因子受體,能夠募集單核細胞,從而加劇IAV感染期間宿主的炎性反應,引起肺損傷[70]。CCR2的抑制劑可降低IAV感染誘導的病理、發病率和死亡率,而不影響病毒清除率[50]。可作為IAV感染治療靶點的另一個受體為鞘氨醇-1-磷酸受體(S1P),S1P是鞘脂的代謝產物,與免疫應答相關,參與多種生物過程[71]。使用S1P配體可顯著降低細胞因子和趨化因子水平,改善感染小鼠的組織損傷,但不影響中和抗體的產生,也不會改變病毒清除率[51]。此外抑制補體活化、大環內酯類、PDE4抑制劑、羅布麻寧、過氧化氫酶、N-乙酰基-L-半胱氨酸、A1-AdoR、信號通路抑制劑均具有免疫調節作用。綜上所述,調節炎性反應是改善重癥IAV的潛在策略。

4 展 望

綜上所述,IAV感染可誘導宿主氣道高促炎性免疫反應,上調IL-1β、IL-6等炎癥因子水平,可導致多器官病變,嚴重者甚至死亡。IAV參與宿主炎性反應與其編碼的蛋白質相關,但多集中于表型研究,對機制的研究較少。目前已發現多種免疫調節劑可抑制宿主炎癥反應,可能對IAV治療有效,但臨床研究樣本量不足,局限于動物試驗或體外試驗,且不能完全有效。因此,闡明IAV感染涉及的具體炎癥機制對開發和改進更有針對性的免疫調節劑至關重要。