精氨酸及其代謝物抑制熱應激誘導仔豬支持細胞凋亡的機制

霍元楠,邱美佳,張姣姣,楊煒蓉,王鮮忠*

(1.西南大學動物醫學院,重慶 400715;2.西華師范大學生態研究所,南充 637009)

公豬支持細胞(sertoli cells,SCs)主要通過為生殖細胞提供生理和營養支持來調節精子發生[1],SCs的數量決定了睪丸的大小和產生精子的能力[2-3]。由于豬陰囊溫度普遍低于正常體溫2～8 ℃,因此公豬對環境溫度變化十分敏感,更容易受到高溫影響[4]。有研究發現,熱應激導致生精細胞凋亡[5],其凋亡程度取決于熱應激的強度和作用時間。凋亡對細胞最直接的影響會使細胞數量減少[6],熱應激通過導致SCs凋亡,引起生殖細胞數量減少[7]。研究熱應激條件下SCs的凋亡機制對于闡明精子發生的調控機制和提高雄性生殖能力具有重要意義。

精氨酸(arginine,Arg)是一種多功能氨基酸,在細胞凋亡中發揮重要作用。在動物機體內主要以L-精氨酸的方式存在,能提高生長和育肥豬的抗氧化能力,減輕熱應激的影響[8],并防止脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導的綿羊腸上皮細胞凋亡[9]。一氧化氮(nitric oxide,NO)是由NO合成酶產生的自由基,可催化精氨酸向 L-瓜氨酸的轉化[10],精氨酸-一氧化氮(Arg-NO)途徑產生的NO在細胞凋亡中具有雙重作用[11]。在生理條件下,動物體內合成的精氨酸量不能滿足動物機體生長代謝的需要,大多數動物需要從食物中獲取Arg[12]。Arg不僅可作為NO前體,還參與腐胺、精胺和亞精胺的生成[13],其中精胺具有抗氧化與抗衰老能力[14],可作為氧自由基清除劑,保護核酸等細胞組分免受氧化損傷,調節細胞死亡過程[15]。但目前尚不清楚精氨酸調節熱應激下支持細胞凋亡的機制。外源性精胺通過減少活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產生和抑制PERK-eIF2α通路的激活來阻止內質網應激誘導的心肌細胞凋亡[16]。然而,Arg-NO和 Arg-精胺如何調節熱應激處理支持細胞的凋亡還需要進一步研究。

本試驗以體外培養的仔豬睪丸支持細胞為研究材料,采用試驗前期建立的熱應激模型,經靶向代謝物測序,篩選出差異氨基酸;通過添加外源性氨基酸,分析外源性氨基酸是否會影響熱應激誘導的細胞凋亡。發現熱應激降低了支持細胞的精氨酸含量及其相關代謝物,改變了Arg代謝途徑,增加了SCs的凋亡率,并進一步探討了精氨酸和精胺在熱應激誘導的支持細胞凋亡中的作用,以便為緩解熱應激的不利影響提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 以來自重慶市北碚區東陽鎮某豬飼養場3周齡健康雄性仔豬為研究對象,試驗中所有動物程序和方法均經西南大學機構動物護理和使用委員會批準。

1.1.2 試驗試劑 DMEM/F12培養基、胎牛血清、新生小牛血清、青鏈霉素(Gibco公司)。IV型膠原酶、 精氨酸、精胺(Sigma公司)。磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline, PBS)粉末(Biosharp 公司)。苯甲基磺酰氟PMSF、蛋白酶抑制劑(MCE公司)。RIPA裂解液、蛋白預染maker(Thermo Scientific公司)。BCA試劑盒(葆光生物)。山羊抗兔二抗、熒光型二抗、NO檢測試劑盒、蛋白上樣緩沖液(上海碧云天生物技術公司)。Rabbit Anti-iNOS、Rabbit Anti-ODC、Rabbit Anti-FAS(北京博奧森生物技術公司)。Rabbit Anti-Bcl-2、Rabbit Anti-BAX、Rabbit Anti-ARG1、Rabbit Anti-SSAT1(武漢三鷹生物技術公司)。凋亡檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。豬精胺ELISA檢測試劑盒(慧嘉生物)。

1.2 方法

1.2.1 睪丸支持細胞的分離培養及純度鑒定 在無菌條件下采集睪丸組織,然后迅速放入預冷的PBS (按100∶1的比例加入青、鏈霉素混合物),用封口膜將其封口,放入提前加入冰塊的泡沫盒中,在2 h內送至實驗室。按照本實驗室前期方法進行睪丸支持細胞的分離與純化。將分離的細胞置于DMEM/F12培養液中,添加10%胎牛血清,在32 ℃,5% CO2下培養48 h,待培養皿底部細胞長滿至70%～80%后,用支持細胞特異性的標記蛋白GATA-4進行純度鑒定,細胞純度鑒定不低于90%即可用于后續試驗[17-18]。

1.2.2 細胞的熱處理以及細胞活性檢測 純化后的仔豬睪丸原代細胞培養約24～48 h 后,按照之前實驗室建立的熱應激模型對細胞進行熱處理(44 ℃,30 min),再進行后續試驗[19]。使用CellTiter-LμMiTM穩態發光細胞活力測定試劑盒評估細胞活力。將細胞接種于96孔細胞板,每孔加入100 μL CellTiter-LμMiTMSteady發光試劑,振蕩2 min促進細胞裂解。室溫孵育10 min后使用多功能酶標儀進行化學發光檢測,并根據化學發光顯示值計算細胞的相對活力,記錄試驗結果并進行分析。

1.2.3 細胞凋亡檢測 使用熒光素異硫氰酸酯(FITC) /PI試劑盒進行凋亡分析[20]。將支持細胞接種于6孔板,于 DMEM/F12培養基中培養24 h, 0.05 mmol·L-1精氨酸處理24 h, PBS洗滌,重懸于結合緩沖液中。將100 μL細胞與5 μL Annexin V-FITC在25 ℃下孵育20 min,得到的混合物加入5 μL PI和400 μL結合緩沖液,用流式細胞儀進行分析。通過NovoExpress1.2.1軟件進行數據分析,并將結果進行歸一化處理。

1.2.4 細胞的代謝物檢測 通過添加精氨酸和熱處理后,用0.1 mol·L-1PBS洗滌細胞。用細胞刮刀刮取細胞,將細胞收集于凍干管中。采用超高效液相色譜系統進行分離,質譜分析采用質譜儀在正離子模式下進行。使用Multiquant軟件提取色譜峰的峰面積和保留時間,采用氨基酸及其衍生物的代謝物鑒定標準校正保留時間,并計算相應代謝物的濃度。

1.2.5 蛋白表達的檢測 使用細胞裂解緩沖液從處理過的細胞中提取總蛋白,并用碧云天BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。采用6%～12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。BSA封閉液25 ℃封膜2 h,4 ℃結合相應一抗12 h,然后將膜與山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗在25℃下孵育2 h,配置顯影液后在化學發光成像儀上曝光顯影。Quantity One軟件定量蛋白條帶強度。

1.2.6 RNA 提取及定量 RT-PCR 將支持細胞培養在細胞培養瓶(4×106個·瓶-1)中,在32 ℃的培養箱(含5% CO2)中培養48 h,分別用精氨酸或精胺處理并進行熱處理。采用Trizol法提取總RNA。然后使用CFX96TMReal-Time System/C1000 TouchTMThermal Cycler進行qRT-PCR試驗。iScriptTM 139 gDNA Clear cDNA Synthesis kit進行反轉錄,并使用SYBR Green?Master Mix進行1 μg總RNA合成的cDNA進行qRT-PCR。使用2-ΔΔCT方法計算目的基因相對β-actin表達量,本試驗所用引物信息見表1。

表1 本試驗所用引物序列

1.2.7 NO 熒光檢測以及精胺的檢測 添加精氨酸、精胺和熱處理后用0.1 mol·L-1PBS洗滌細胞,然后使用0.25%胰蛋白酶消化細胞2 min, 1 500 r·min-1離心5 min后棄上清。按照DAF-FM DA試劑說明書進行操作,將1 mL懸浮細胞與10 μmol·L-1DAF-FM DA混合,在37 ℃的細胞培養箱中避光孵育20 min。使用流式細胞儀測定每個樣品的熒光強度。按照豬精胺酶免疫測定試劑盒的說明書,在給定的標準濃度下形成標準曲線,最后根據450 nm處吸光度值測定試驗組精胺濃度。

1.3 統計分析

試驗數據使用GraphPad prism7.0軟件進行統計分析,兩組數據采用非配對樣本 Student′st-test進行顯著性分析,兩組以上采用單因素方差分析,采用Tukey試驗多重比較各組間的差異。如果數據不符合正態分析,先進行正弦轉化。試驗均設有3次獨立重復,*為P<0.05表示差異顯著,**為P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 熱應激對支持細胞活力和凋亡率的影響

與對照組相比,熱應激后支持細胞的熒光強度顯著降低了42% (P<0.01,圖1A)。其次,熱應激使支持細胞的凋亡率從3.14%增加到7.36%,增加了134% (P<0.01,圖1B)。這表明,熱應激增加了支持細胞的凋亡率。

A. 熱處理后支持細胞的活性;B. 熱處理后支持細胞的凋亡率和凋亡率量化統計。*. P<0.05;**. P<0.01,下同A. The activity of sertoli cells under heat stress; B. Apoptosis rate and quantitative statistics of apoptosis rate of sertoli cells under heat stress. * . P<0.05; **. P<0.01, the same as below

2.2 熱處理對精氨酸及精氨酸代謝物的影響

經過熱處理后,支持細胞中的精氨酸含量降低了54.9% (P<0.01,圖2A)。進一步檢測精氨酸的代謝,發現熱應激后Inos的mRNA水平升高了60%(P<0.01,圖2B),iNOS蛋白水平升高了12% (P<0.01,圖2B),NO含量升高了57% (P<0.01,圖2C),代謝副產物瓜氨酸含量降低了39.8% (P<0.05,圖2 D);代謝產物腐胺和鳥氨酸含量分別提高了103%(P<0.05)和70% (P<0.01,圖2D),但精胺含量無顯著變化(P>0.05,圖2E)。本研究還檢測了精氨酸-精胺代謝途徑相關酶的mRNA水平,結果發現與對照組相比,熱應激后Arg1、Arg2和OdcmRNA水平分別顯著升高了2000%(P<0.01)、180%(P<0.01)和10%(P<0.05)(圖2F)。上述結果表明,熱應激增強了支持細胞中Arg-NO的代謝途徑,但對精胺的量無顯著影響。

2.3 外源性精氨酸降低熱處理后支持細胞的凋亡率

熱處理后的精氨酸含量相對于對照組下降了54.9%(P<0.01,圖3A)。與單純熱應激組相比,0.05 mmol·L-1外源性精氨酸處理使熱應激組支持細胞中精氨酸的含量上升了143%(P<0.01,圖3A)。此外,外源精氨酸使熱應激條件下支持細胞的凋亡率降低8% (P<0.01,圖3B),BAX蛋白水平降低32% (P<0.05,圖3C),FAS蛋白水平降低8% (P<0.05,圖3C)。以上結果表明,外源精氨酸可減少熱應激引起的支持細胞凋亡。

A.精氨酸的變化;B.支持細胞的細胞凋亡率、凋亡量化統計;C.凋亡相關蛋白的表達及量化統計A. Changes in arginine; B. Apoptosis rate and apoptosis quantitative statistics of sertoli cells;C. Expression and quantification of apoptosis-related proteins

2.4 外源性精氨酸改變熱應激后支持細胞的精氨酸代謝

與單純熱應激組相比,外源性精氨酸使INOS蛋白水平降低15.3% (P<0.01,圖4A),NO含量降低29.5% (P<0.01,圖4B),而瓜氨酸水平無顯著變化(P>0.05,圖4C)。與對照組相比,熱應激下,精氨酸-精胺代謝途徑中的關鍵酶ARG1、ODC和SSAT1的蛋白表達顯著增加了20.8%、18.3%和400% (P<0.05,圖4D)。與熱應激相比,外源性精氨酸使ODC升高了41.5%(P<0.01),ARG1下降了23%(P<0.01),但SSAT1升高不顯著(P>0.05,圖4D),并且鳥氨酸和腐胺含量變化不顯著(P>0.05,圖4E),而精胺含量提高了10.2% (P<0.01,圖4F)。上述結果表明,外源性精氨酸抑制了ARG-NO途徑,增強了精氨酸-精胺途徑。

A. INOS 蛋白的表達及蛋白量化統計;B.NO 熒光表達及統計;C.瓜氨酸含量統計;D. ARG1、SSAT1、ODC 蛋白的表達及量化統計;E.鳥氨酸代謝物、腐胺代謝物的變化;F.精胺代謝物的變化A. Expression and quantitative statistics of INOS protein; B.NO fluorescence expression and statistics;C.Citrulline content statistics; D. Expression and quantitative statistics of ARG1,SSAT1 and ODC proteins;E. Changes in ornithine metabolites and putrescine metabolites; F. Changes in spermine metabolites

2.5 外源性精胺改變支持細胞的凋亡和NO含量

5 μmol·L-1精胺使熱應激條件下支持細胞凋亡率降低53.9% (P<0.01,圖5A),BAX蛋白水平顯著降低30.9%(P<0.05,圖5B),BCL-2蛋白水平升高16.8%(P<0.05,圖5B),NO含量降低24.3% (P<0.01,圖5C)。這表明外源性精胺可以降低NO含量,從而減弱熱應激誘導的細胞凋亡。

3 討 論

本試驗采用質譜多重反應監測(multiple reaction monitoring,MRM)技術分析了正常和熱處理條件下支持細胞中氨基酸代謝物的變化。研究數據顯示,支持細胞熱處理后,精氨酸和精氨酸代謝相關的物質含量發生了顯著變化,熱應激增強了Arg-NO通路。同時發現,Arg-精胺通路相關酶的mRNA水平明顯上升,但精胺含量無顯著變化,這表明熱應激下精胺作為抗氧化和抗凋亡物質,出現大量消耗,防止細胞的過度凋亡[21]。外源精氨酸或精胺可降低熱應激誘導的支持細胞中NO水平和凋亡率。這些結果表明,熱應激通過增強Arg-NO途徑誘導細胞凋亡,而添加外源精氨酸或精胺加強了精氨酸-精胺通路代謝途徑,抑制了Arg-NO途徑,從而降低了熱處理誘導的支持細胞凋亡。

熱應激對動物泌乳[22]、采食量[23]、免疫功能[24]和生殖功能[25]均有顯著影響,而這些影響與細胞凋亡密切相關[26]。研究發現,熱應激可以誘導各種細胞的凋亡,如小鼠顆粒細胞[27]、小鼠生精細胞[28]、牛肺細胞等[29]。本試驗基于前期研究進一步發現,SCs在遭受熱處理(44 ℃ 30 min)后,FAS和線粒體依賴性細胞凋亡蛋白表達升高,這暗示熱處理后通過內源性途徑和外源性途徑誘導支持細胞發生凋亡。Xi等[30]發現,熱應激(42 ℃ 1 h)可通過調節Bax和Bcl-2的表達水平(內源性途徑)使成年公豬睪丸發生凋亡。在本試驗中,熱應激增加了SCs的凋亡率,這與牛、大鼠和小鼠的42 ℃熱處理1 h或41 ℃熱處理48 h誘導SCs凋亡的結果相似[31-32]。本試驗結果還顯示,熱應激使精氨酸、瓜氨酸含量降低,并提高了腐胺、鳥氨酸和NO含量。NO對細胞凋亡具有雙重作用[33],過量的NO會引起細胞凋亡[34]。本試驗發現,熱應激誘導SCs中NO含量升高,增強了Arg-NO代謝途徑,進而通過線粒體途徑和FAS途徑誘導睪丸SCs發生凋亡[35-36]。因此,熱應激增強Arg-NO代謝途徑是導致細胞凋亡率增加的原因。精氨酸可以調控多種細胞的凋亡[37],并且對凋亡的調節作用和抗氧化作用與其代謝密切相關。精氨酸可以通過上調抗氧化酶預防LPS誘導的綿羊上皮細胞凋亡,也可以通過抑制NO的產生上調Bcl-2基因進而對大鼠肝臟缺血再灌注損傷中的壞死和細胞凋亡提供保護,并且抑制精氨酸-NO途徑可以減輕熱應激誘導的豬上皮細胞凋亡。本試驗發現,添加外源精氨酸后,Arg-NO代謝物NO含量下降,細胞凋亡率降低了,這表明精氨酸參與了SCs功能的調控并且可能和細胞中的NO水平下降有關。

鳥氨酸脫羧酶(ODC)和二胺乙酰轉移酶1 (SSAT1)是精胺合成[38]和分解代謝的關鍵酶[39],共同參與多胺代謝的調節[40]。本試驗中,熱應激后SCs中ODC和SSAT1水平均升高,而精胺的水平沒有明顯變化,這表明熱應激后SCs中精胺的合成和降解速度相當。本試驗添加外源精胺不僅降低了熱處理組細胞的凋亡率和NO水平,而且還降低了促凋亡蛋白BAX水平,增加了抗凋亡蛋白BCL-2水平,這表明精胺可能通過抑制Arg-NO發揮抗凋亡作用。以上結果表明,抑制 Arg-NO通路,增強精氨酸-精胺途徑可能是緩解熱應激誘導細胞凋亡的一種有效方式。

4 結 論

熱應激條件下通過增強Arg-NO代謝途徑誘導支持細胞凋亡。外源精氨酸或精胺可增強精氨酸-精胺代謝途徑,抑制Arg-NO途徑,減輕熱處理誘導的支持細胞凋亡。