鹽酸不溶灰分測定方法影響肉雞飼糧代謝能準確性的比較研究

宋明強,解競靜,歐 娟,王鈺明,侯 嘉,譚高明,田 凱,朱 云,薩仁娜,趙 峰*

(1.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所 畜禽營養與飼養重點實驗室,北京 100193;2.杭州康德權飼料有限公司 包膜飼料添加劑省級重點農業企業研究院,杭州 311107)

鹽酸不溶灰分(acid insoluble ash,AIA)作為一種不能被畜禽消化吸收的硅類化合物,測定其在飼糧及排泄物中的含量即可表征畜禽采食量和排泄量的關系[1]。因此,精準測定飼糧和排泄物中AIA的含量至關重要,它直接影響到內源指示劑法測定飼糧養分消化率的準確性。目前,使用AIA作為指示劑測定飼糧養分消化率時通常添加0.5%～1.2%的硅藻土[1-6]以提高飼糧中AIA的含量,從而減少飼糧AIA的測定誤差。這是由于在飼糧本底AIA含量較低的條件下,現有的方法測定AIA相對偏差較大,從而影響飼糧養分消化率測定的準確性。然而,Scott和Hall[1]發現,即使飼糧中添加硅藻土提高了AIA的含量,全收糞法和AIA指示劑法測定137個小麥飼糧和97個大麥飼糧的代謝能(AME)的平均差值依然高達0.690 MJ·kg-1DM。這表明,現有方法測定飼糧或排泄物中AIA的精度難以滿足對AME的準確測定。在AIA的測定上,國標方法[7]及美國油脂化學家協會(The American Oil Chemists′ Society,簡稱AOCS)標準方法[8]對分析過程進行了詳細的規范,即通過馬弗爐高溫灼燒,去除樣品中的有機物質,然后與濃鹽酸進一步反應后用無灰濾紙進行過濾,從而得到AIA。然而,該方法測定一個樣品需要馬弗爐灼燒3次,轉移2次,耗時3 d,且樣品在馬弗爐反復灼燒及多次轉移均會導致一定程度的損耗,從而影響結果的精確度[9]。其次,生產中飼糧的AIA含量通常在0.1%～0.3%[10],這就要求測定方法的檢測限低于0.1%且檢出限在0.005%內才能夠滿足對飼糧養分消化率準確測定的需要。為進一步提高AIA測定方法的精度及準確性,本研究對AOCS測定方法進行優化,比較AOCS改進法和AOCS標準方法測定AIA評價肉雞對飼糧AME與全收糞法測值的差異,為養殖現場高效、精準地測定飼糧養分的消化率提供參考。

1 材料與方法

1.1 飼糧及排泄物樣品

本研究使用的肉雞代謝試驗飼糧、排泄物樣品來自Song等[11]描述的試驗。13個試驗飼糧,包括1個玉米-豆粕基礎飼糧以及12個由基礎飼糧與其中1個飼料原料按照一定比例配制的試驗飼糧。12個飼料原料包括3個能量飼料(1個玉米、2個面粉)、3個油籽粕(1個豆粕、1個花生粕、1個棉籽粕)、3個粗蛋白質(CP)含量不同的玉米蛋白粉(A、B和C)和3個不同加工工藝的羽毛粉(1個酶解羽毛粉、1個水解羽毛粉、1個膨化羽毛粉)。每個試驗飼糧對應的排泄物包括6個重復,每個重復的排泄物來自4只25～28日齡的愛拔益加肉公雞。

1.2 試驗設計

本研究包括2個試驗。試驗一比較AOCS標準方法和AOCS改進法測定樣品AIA含量的重復性和可加性。第1部分采用單因素完全隨機設計,選用3個飼糧(玉米飼糧、花生粕飼糧、玉米蛋白粉B飼糧)及對應的3個排泄物樣品(同一個飼糧的6個排泄物樣品,等重量混合為1個樣品),分別用兩種AIA測定方法連續測定3批次,每個批次4個重復。比較AIA測定結果的批內、批間及總變異系數(CV);第2部分分別以3個飼糧(玉米飼糧、花生粕飼糧、玉米蛋白粉B飼糧)及3個排泄物樣品為基礎,按一定比例混合后,得到6個不同AIA濃度的混合飼糧和6個不同AIA濃度的混合排泄物樣品(表1)。采用兩種方法測定樣品的AIA含量。根據混合飼糧或排泄物樣品中各成分的組成比例及AIA計算其總AIA含量。比較樣品AIA的計算值與實測值的差異。試驗二采用配對試驗設計,分別比較AOCS標準方法和AOCS改進法測定AIA計算13種飼糧的AME與全收糞法AME測值的差異,檢驗兩種方法測定AIA計算飼糧AME的準確性。

表1 混合飼糧及混合排泄物的組成(干物質基礎)

1.3 AIA測定方法

AOCS標準方法根據AOCS(Ba 5b-68)[8]描述的過程進行測定。AOCS改進法以AOCS標準方法的測定原理為參考,主要針對樣品的上樣量和殘渣的過濾流程進行了改進,它包含以下測定流程:稱取20 g飼糧或5 g排泄物樣品置于陶瓷坩堝中,用電陶爐灼燒直至有機物燃燒殆盡,然后在馬弗爐中(600±15)℃煅燒7 h;冷卻后加入5 mL濃鹽酸,加熱煮沸直至干燥,并持續加熱30 min;重新加入5 mL濃鹽酸并加熱至沸騰,再加入20 mL蒸餾水煮沸;用恒重后的砂芯坩堝(G4:孔徑為4～16 μm)連接真空泵進行過濾混合物,并用20 mL加熱后的蒸餾水沖洗5次,每次沖洗時間為3 min;剩余殘渣與砂芯坩堝放置于恒溫烘箱105 ℃恒重4 h,得到的殘渣即為AIA。

1.4 數據處理與統計分析

所有數據以絕干基礎表示,飼糧AME的計算公式[12]如下:

AME(MJ·kg-1DM )=GEdiet-(AIAdiet/AIAexcreta)×GEexcreta。

AIAdiet:飼糧AIA含量;AIAexcreta:排泄物AIA含量;GEdiet:飼糧總能;GEexcreta:排泄物總能。

數據采用SAS 9.4的MEANS模塊對基本統計量進行分析。采用GLM模塊對試驗一中AOCS標準方法和AOCS改進法在不同批次間測定AIA的含量進行方差分析,以Duncan′s進行多重比較。批內、批間及總變異系數的計算參考蔣紅衛和夏結來[13]的公式。采用T-TEST模塊對試驗一中兩種方法測定混合飼糧和混合排泄物樣品AIA含量的實測值與計算值進行比較,并采用REG模塊對實測值與計算值進行線性回歸分析,檢驗斜率與1、截距與0的差異顯著性;采用T-TEST模塊對試驗二中兩種方法測定AIA評價的13個飼糧的AME與全收糞法測定的AME進行差異顯著性分析;采用REG模塊對AIA測定的AME值與全收糞法測定的AME進行線性回歸分析,檢驗斜率與1、截距與0的差異顯著性。P<0.05為顯著性水平。

2 結 果

2.1 AOCS標準方法和AOCS改進法測定飼糧及排泄物AIA含量的重復性

AOCS標準方法和AOCS改進法測定飼糧及排泄物AIA的含量列于表2。AOCS標準方法測定玉米飼糧、花生粕飼糧和玉米蛋白粉B飼糧的AIA含量在3個批次間均存在顯著差異(P<0.05),批次間CV分別為11.66%、4.53%和5.60%。AOCS改進法分別測定玉米飼糧、花生粕飼糧和玉米蛋白粉B飼糧的AIA含量在3個批次間的測值無顯著差異,批次間CV分別為3.55%、0.23%和0.34%。AOCS標準方法在3個批次間測定花生粕飼糧對應排泄物的AIA含量存在顯著差異(P<0.01),批次間CV為5.52%;而測定玉米飼糧對應排泄物和玉米蛋白粉B飼糧對應排泄物的AIA含量在3個批次間測值無顯著差異,批次間CV分別為1.37%和0.76%。AOCS改進法測定花生粕飼糧對應排泄物的AIA在3個批次間測值無顯著性差異,批次間CV為1.11%;而測定玉米飼糧對應排泄物和玉米蛋白粉B飼糧對應排泄物的AIA含量在3個批次間存在顯著差異(P<0.01),批次間CV分別為1.52%和2.68%。

表2 AOCS標準方法和AOCS改進法測定飼糧1及排泄物2中AIA的重復性(干物質基礎)

2.2 AOCS標準方法和AOCS改進法測定飼糧及排泄物中AIA含量的可加性

AOCS標準方法和AOCS改進法測定6個混合飼糧AIA含量的實測值與計算值列于表3。配對T檢驗結果表明,AOCS標準方法和AOCS改進法測定飼糧AIA的實測值與計算值均存在顯著差異(P<0.01),AOCS標準方法測定6個混合飼糧AIA的實測值與計算值的差值在0.037%～0.071%,而AOCS改進法測定6個混合飼糧AIA的實測值與計算值的差值僅為0.004%～0.017%。飼糧AIA的實測值對計算值的擬合模型中(表4),AOCS標準方法擬合模型的截距與0存在顯著差異(截距=0.087,P截距<0.05),斜率與1無顯著性差異(斜率=0.854,P斜率=0.212),模型決定系數R2=0.95;AOCS改進法擬合模型的截距與0無差異(截距=0.010,P截距=0.413),斜率與1無差異(斜率=0.999,P斜率=0.986),模型決定系數R2=0.99。總體上,AOCS標準方法測定6個混合飼糧AIA的實測值為計算值的120.1%,AOCS改進法測定6個混合飼糧AIA的實測值為計算值的96.0%。

表3 AOCS標準方法和AOCS改進法測定飼糧及排泄物中AIA實測值與計算值的差異

表4 AOCS標準方法、AOCS改進法測定飼糧及排泄物中AIA的實測值對計算值的回歸

AOCS標準方法和AOCS改進法測定6個混合排泄物AIA含量的實測值與計算值列于表3。配對T檢驗表明,AOCS標準方法測定排泄物AIA的實測值與計算值無差異(P>0.05),AOCS改進法測定飼糧AIA的實測值顯著高于計算值(P<0.05)。AOCS標準方法測定6個混合排泄物AIA實測值與計算值的差值在0.015%～0.072%,而AOCS改進法測定6個混合排泄物AIA實測值與計算值的差值僅為0.002%～0.029%。排泄物AIA的實測值對計算值的擬合模型中(表4),AOCS標準方法擬合模型的截距與0無顯著性差異(截距=0.061,P截距=0.692),斜率與1無顯著性差異(斜率=0.912,P斜率=0.564),模型決定系數R2=0.91;AOCS改進法擬合模型的截距與0無顯著性差異(截距=0.002,P截距=0.814),斜率與1無顯著性差異(斜率=1.011,P斜率=0.968),模型決定系數R2=0.99。總體上,AOCS標準方法測定6個混合排泄物AIA的實測值為計算值的97.2%,AOCS改進法測定6個混合排泄物AIA的實測值為計算值的101.3%。

2.3 以AIA計算飼糧AME與全收糞法測定飼糧AME的比較

配對T檢驗顯示,通過AOCS改進法與AOCS標準方法測定AIA計算13個飼糧的AME與全收糞法AME之間均沒有顯著差異(P>0.05),且AOCS改進法測定AIA計算飼糧AME與全收糞法測值的差在0.021～0.251 MJ·kg-1DM之間(表5),小于AOCS標準方法測定AIA計算飼糧AME與全收糞法測值的差(0.025～1.799 MJ·kg-1DM)。從變異系數看,AOCS改進法測定AIA計算飼糧AME的平均CV為1.25%,與全收糞法(CV=1.12%)相似,但均遠低于AOCS標準方法測定AIA計算飼糧AME的CV(2.61%)。將全收糞法測定的13個飼糧AME分別對AOCS標準方法和AOCS改進法測定AIA計算的AME值進行線性回歸分析發現(圖1),全收糞法AME對AOCS標準方法測定AIA計算的AME的回歸模型中,截距與0存在顯著性差異(截距=7.792 MJ·kg-1DM,P截距<0.01),斜率與1存在顯著差異(斜率=0.458,P斜率<0.01),決定系數R2=0.55;全收糞法AME對AOCS改進法測定AIA計算的AME的回歸模型中,截距與0存在顯著性差異(截距=1.798 MJ·kg-1DM,P截距<0.05),斜率與1存在顯著性差異(斜率=0.874,P斜率<0.05),決定系數R2=0.97。總體上,AOCS改進法測定AIA計算飼糧的AME更加接近全收糞法的測值。

a. ▲表示全收糞法測定13個飼糧的AMETC對AOCS標準方法測定AIA計算飼糧AMEAIA的回歸模型。AMETC=0.458×AMEAIA + 7.792 (P =0.004;R2=0.55;RMSE=0.405 MJ·kg-1 DM;P斜率=0.001,[H0:斜率=1,Hα:斜率≠1]; P截距=0.001,[H0:截距=0,Hα:截距≠0])。b. ■表示全收糞法測定13個飼糧的AMETC對AOCS改進法測定AIA計算飼糧AMEAIA的回歸模型。AMETC=0.874×AMEAIA+1.798 (P<0.001;R2=0.97;RMSE=0.102 MJ·kg-1 DM;P斜率=0.018,[H0:斜率=1,Hα:斜率≠1];P截距=0.018,[H0:截距=0,Hα:截距≠0])a. The solid line (▲) is the regression model for determined AME (AMETC) of 13 diets using total collection method against AME (AMEAIA) from AIA by AOCS standard method. AMETC=0.458×AMEAIA+7.792 (P=0.004; R2=0.55; RMSE=0.405 MJ·kg-1 DM; Pslope=0.001,[H0: slope=1, Hα: slope≠1]; Pintercept=0.001,[H0: intercept=0, Hα: intercept≠0]). b. The solid line (■) is the regression model for determined AME (AMETC) of 13 diets using total collection method against AME (AMEAIA) from AIA by AOCS modified method. AMETC=0.874×AMEAIA+1.798 (Pregression<0.001; R2=0.97; RMSE=0.102 MJ·kg-1 DM; Pslope=0.018,[H0: slope=1, Hα: slope≠1]; Pintercept=0.018,[H0: intercept=0, Hα: intercept≠0]).

表5 AOCS標準方法、AOCS改進法測定飼糧AIA計算AME與全收糞法AME測值的差值

3 討 論

AIA測定的主要原理是將樣品進行灼燒去除有機物,再用濃鹽酸在高溫條件下將可溶性礦物質溶解,用無灰濾紙過濾得到剩余殘渣,從而定量樣品中AIA[7-9]。該方法測定步驟繁瑣且周期長,導致在測定樣品(尤其是AIA含量低的樣品)時存在重復性差等問題[14],大大降低了AIA作為指示劑表征畜禽采食量與排泄量關系的準確性。研究發現,現有的方法測定AIA含量大于0.6%的樣品時測值較為穩定[3]。本研究根據AIA的測定原理優化了AOCS標準方法的測定步驟,通過改變上樣量和過濾介質簡化測定步驟、提高測定精度。此外,AOCS標準方法采用無灰濾紙過濾,須再次轉移至馬弗爐灰化,而AOCS改進方法采用砂芯坩堝過濾殘渣后可直接置于恒溫烘箱進行恒重,大幅度提高了測定效率。本課題組前期研究發現,優化后的方法可以準確且穩定地測定AIA含量為0.03%的樣品。根據飼糧及排泄物樣品中AIA的平均含量,本研究推薦AOCS改進方法測定AIA時飼糧的上樣量為20 g,排泄物的上樣量為5 g。

在兩種方法測定結果的比較上,一方面通過方差分析比較了兩種方法在不同批次下對同一個樣品測值的重復性[15];另一方面通過配對T檢驗比較了兩種方法測定同一個樣品AIA實測值與計算值的差異,檢驗了方法的可加性。從計算值和實測值的差異及變化的一致性,有利于全面地反映檢測方法的可加性[16]。本研究中,AOCS改進法(2.13%～5.83%)分3個批次測定玉米飼糧、花生粕飼糧和玉米蛋白粉B飼糧的AIA總變異系數(TCV)遠低于AOCS標準方法(4.69%～15.37%),這表明改進后的方法提高了測定飼糧中AIA的穩定性。而AOCS改進法測定玉米飼糧對應排泄物和玉米蛋白粉B飼糧對應排泄物的AIA含量在3個批次間存在差異,這主要是由于AOCS改進法測定排泄物樣品AIA的批次內CV低導致批次間AIA數據出現統計學差異。但AOCS改進法(1.71%～2.83%)分3個批次測定排泄物樣品的AIA的TCV低于AOCS標準方法(1.50%～5.79%)。由此可見,改進后的AIA測定方法提高了測值的穩定性和可重復性。AOCS改進法測定混合飼糧AIA的計算值與實測值的差值(0.004%～0.017%)遠遠小于AOCS標準方法(0.037%～0.071%),在排泄物樣品中也呈現了這個規律(AOCS改進法:0.002%～0.029%;AOCS標準方法:0.015%～0.072%)。這表明,改進后的方法大幅度提高了測定樣品中AIA的可加性,尤其是AIA含量極低的飼糧樣品。通過對兩種方法測定AIA評價飼糧AME與全收糞法AME測值進行差異顯著性比較,可以更加直觀地比較兩種方法測定AIA的準確性[17]。本研究中,13個飼糧的全收糞法AME測值與AOCS改進法測定AIA計算的AME更為接近,二者的差值(0.021～0.251 MJ·kg-1DM)低于全收糞法AME測值與AOCS標準方法測定AIA計算的AME的差值(0.025～1.799 MJ·kg-1DM)。然而,全收糞法測定13個飼糧AME時,每個飼糧6個重復(每個重復4只雞)測定值的極差在0.228～0.648 MJ·kg-1DM[11]。這表明AOCS改進法測定AIA計算飼糧的AME在全收糞法測定的變異范圍內,也在Sibbald[18]得出全收糞法測定飼糧AME的允許誤差在2%的范圍內。由此可見,相對于AOCS標準方法,AOCS改進法測定AIA評價飼糧AME的準確性更高。回歸分析也得到同樣的結果,全收糞法測定13個飼糧的AME對AOCS改進法測定AIA評價AME的回歸參數(R2=0.97,斜率=0.872)優于全收糞法測定13個飼糧的AME對AOCS標準方法測定AIA評價AME的回歸參數(R2=0.55,斜率=0.456)。綜上所述,AOCS改進法測定AIA評價肉雞對飼糧AME的準確性優于AOCS標準方法。

4 結 論

相較于AOCS標準方法,AOCS改進方法測定樣品AIA具有更好的重復性和可加性,其測定AIA評價飼糧AME與全收糞法測值更加接近(差值在0.260 MJ·kg-1DM以內),為養殖現場高效、精準地測定飼糧養分的消化率提供技術參考。