肌球蛋白輕鏈家族基因MYL2和MYL3在雞皮膚組織中的表達研究

魏瑩暉,葛 瑩,劉 航,王歡歡,李慶海,章學東,范京輝

(杭州市農業科學研究院,浙江 杭州 310024)

動物皮膚的顏色差異主要是受色素沉著的影響,其中黑色素的形成尤為關鍵。黑色素是影響動物皮膚和頭發顏色的主要原因,廣泛存在于皮膚、黏膜、視網膜和卵巢中。黑素生成的來源是表皮黑素單位,它是由一個個單一的黑素細胞組成的,通過樹突與10～36個相鄰的角質形成細胞連接。黑素生成是指黑色素在黑素小體中產生,并從黑素細胞的樹突狀尖端轉移到角質形成細胞的過程,而此過程也稱為黑素小體的轉運。研究證明,黑素細胞內的黑素小體分布是由微管和肌動蛋白依賴性轉運之間的競爭引起的。這說明了肌球蛋白在黑色素轉運中起到了至關重要的作用。

肌球蛋白的基本結構是由一條或兩條重鏈和幾條輕鏈組成。肌球蛋白輕鏈家族中肌球蛋白輕鏈2(MYL2)和肌球蛋白輕鏈3(MYL3)基因的主要生理作用是調節肌纖維的活性,影響骨骼肌的生長發育,且與肌肉的收縮有關。另外,在非肌肉細胞中起到了細胞骨架的作用,同時參與細胞物質運輸、能量代謝及信號傳導等途徑。然而,MYL2和MYL3作為肌球蛋白輕鏈家族的關鍵因子,尚不清楚它們在雞的皮膚組織中是否與黑色素沉著過程相關。因此,本實驗通過檢測不同顏色雞皮膚中的MYL2和MYL3基因的表達水平,研究其與雞皮膚差異的相關性。研究結果可為進一步了解MYL2和MYL3基因在黑色素轉運中的作用奠定了一定的理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗動物 試驗動物為杭州市農業科學院采用東鄉綠蛋殼雞和江山烏骨雞的雜交后代HW1系,從中選擇5只HW1系公雞與3只HW1系母雞交配,連續10天收集產蛋并孵育。所有孵化出的雛雞逐一帶翅號,并在相同的條件下飼養。在91日齡時收集白色和黑色皮膚的個體,并選擇了6對進行實驗。屠宰時迅速收集胸部皮膚,用液氮冷凍保存。

1.1.2試驗儀器及試劑 CR400 型美能達色差計(Minolta,日本),SuperScriptTMIII First-Strand Synthesis SuperMix 試劑盒(Invitrogen公司,貨號為11752-050),SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(TaKaRa公司,貨號為RR420Q),兔抗MYL2抗體、MYL3抗體、GAPDH抗體(Abcam公司,貨號為ab48003、ab137767、ab181602),TRIzol?Plus RNA PurificationKit(Invitrogen公司,貨號為12183-555),RNase-FreeDNase Set(Qiagen公司,貨號為79254),BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術有限公司,貨號為P0010),PVDF轉印膜(Millipore公司,貨號為IPVH00010),ECL DualVue WB Marker(Advansta公司,貨號為RPN810)。

1.2試驗方法

1.2.1皮膚膚色測定 用美能達色差計測定雞膚色亮度(L*)、紅度(a*)、黃度(b*)值。L*值越大表示明度越白;a*如果是正值,說明偏紅,如果是負值,說明偏綠;b*值如果是正值,說明偏黃,如果是負值,說明偏藍。

1.2.2RNA提取與cDNA鏈的合成 使用TRIzol?RNA純化試劑盒提取皮膚組織的總RNA,采用電泳測定其含量、純度及質量,-80 ℃貯存。采用SuperScriptTM試劑盒將提取的總RNA反轉錄合成cDNA,-20 ℃貯存備用。

1.2.3引物的設計與合成 從 NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 網站上查找引物序列,通過 Primer Premier 5.0 軟件設計相應引物。引物信息見表1。

表1 相關引物信息

1.2.4熒光定量分析 熒光定量PCR反應體系:cDNA 1.0 μL;10 μmol/L的上、下游引物各0.5 μL;SYBR? Green 酶10.0 μL;水8.0 μL。反應條件:95 ℃ 1 min;40個循環(95 ℃ 15 s;63 ℃,25 s);收集55～95 ℃熔解曲線。每個樣品重復3次。目的基因的引物序列見表1。以甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內對照。目的基因相對表達量=2(內參基因的Ct值-目的基因的Ct值)。

1.2.5Western印跡分析 取雞皮膚組織,總蛋白提取物在4%～20% Sure PAGE凝膠上進行電泳分離,并通過電印跡轉移到PVDF膜。非特異性結合位點用5%牛血清白蛋白在TBST中孵育1 h。然后將膜與含有0.25%牛血清白蛋白的一抗(1∶1 000)在TBST中孵育過夜。在TBST中洗滌3次后,用稀釋的(1∶2 000)二抗兔(Abcam,ab6721)在室溫下孵育1 h。使用ECL化學發光法對條帶進行顯色。將目的蛋白的表達值歸一化為GAPDH作為加載對照。

1.2.6統計分析 使用SPSS 21.0統計軟件對試驗數據進行統計分析。先對數據進行正態性檢驗和方差齊性檢驗,然后采用t-test和單因素方差分析。使用GraphPad Prism 9.0軟件繪制基因表達量的柱狀圖。每個試驗重復數n≥3。試驗結果用平均數±標準誤差(mean±S.E)表示。以*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01)。

2 結果

2.1膚色測定 屠宰前將6對試驗雞進行膚色測定,由圖1A可知,黑膚的L*和b*值極顯著低于白膚(P<0.01),而a*值顯著小于白膚組(P<0.05)。之后,將6對試驗雞屠宰后對皮膚進行拍照,也能看出膚色的明顯差異(圖1B)。

圖1 黑膚組與白膚組皮膚膚色值和照片注:*、#、&,P<0.05,表示差異顯著;**、##、&&,P<0.01,表示差異極顯著(圖2～3亦同)。

2.2不同膚色中MYL2和MYL3 mRNA的表達 通過熒光定量PCR對白皮膚和黑皮膚樣品中MYL2和MYL3的轉錄水平進行檢測。如圖2所示,黑皮膚組較白皮膚組MYL2和MYL3的表達均極顯著下調(P<0.01)。

圖2 黑膚組與白膚組皮膚組織中MYL2和MYL3的轉錄水平

2.3不同膚色中MYL2和MYL3蛋白水平的表達 從Western Blot結果(圖3A～C)可以看出:黑皮膚組與白皮膚組相比,MYL2的蛋白表達量下調(P<0.05),且MYL3的蛋白表達量極顯著下調(P<0.01)。

圖3 黑膚組與白膚組皮膚組織中MYL2和MYL3的蛋白表達水平

3 討論

肌球蛋白是一種多功能的蛋白質,在細胞的運動和細胞內物質傳遞方面起著重要作用。肌球蛋白輕鏈2(MYL2)是一種蛋白質編碼基因,作為調節性輕鏈,由位于第17號染色體上的基因編碼167個氨基酸組成。與MYL2 相關的途徑包括指導線索和生長錐運動以及 cAMP 依賴性蛋白激酶A的激活。肌球蛋白輕鏈3(MYL3)也是肌球蛋白家族成員,由199個氨基酸組成。早期研究發現,MYL3通過與鈣離子結合促進肌肉發育,從而參與橫紋肌的收縮。有研究報道,MYL2已被證明是在胃腸道疾病中改變細胞旁通透性的關鍵調節蛋白,這說明MYL2可能在黑素小體從樹突釋放,再到傳遞給周圍角質細胞過程中起作用。另外值得注意的是,MYL2和MYL3在心肌細胞中高度表達,而在其他組織中的表達量不高,但是本文實驗結果在雞皮膚組織中也檢測到MYL2和MYL3的表達,并且在不同顏色的皮膚組織中表達有顯著差異。這暗示MYL2和MYL3不僅在雞的皮膚中也有表達,而且可能參與了雞皮膚顏色加深這一過程。

黑素細胞中的黑素體轉運被認為是兩個步驟。在合成后,黑素體被認為通過由小 GTPase Rab7調節的驅動蛋白和動力蛋白馬達的作用沿著微管進行快速、長距離運輸到樹突中。它們通過與肌球蛋白募集介導的肌動蛋白細胞骨架相互作用而保留在那里。該模型基于對源自稀釋突變小鼠(缺乏肌球蛋白)的黑素細胞的觀察,其中黑素體聚集在細胞核周圍,而不像野生型黑素細胞那樣遍布外周細胞質和樹突。另外兩只突變小鼠,缺乏 Rab27a 蛋白和缺乏嗜黑素蛋白(Mlph),表現出相似的黑素體分布,這些蛋白質似乎將肌球蛋白Va 運動錨定在黑素小體上。這種機制允許黑素體保留在樹突中,并在轉移到角質形成細胞之前沿著肌動蛋白絲向質膜進行短的肌球蛋白驅動運動。本實驗對肌球蛋白組成結構中的肌球蛋白輕鏈進行測定,結果顯示黑皮膚組織中MYL2和MYL3的表達顯著下調。這顯示MYL2和MYL3的表達或許與肌球蛋白Va影響黑色素的生成是負相關。有結果證明,在小鼠黑素細胞中,其中依賴于微管的黑素體運動是雙向的。有實驗證明在人的黑素細胞中,與微管相關的雙向黑素體運動受到了細胞質動力蛋白和驅動蛋白控制。黑素小體在驅動蛋白的作用下向微管的正方向運動即往樹突方向轉運黑色素細胞,相反動力蛋白則向反方向運動。黑素小體到達微管端部必須依賴于兩種動力相互協調的作用。這表明轉運至樹突遠端的黑素小體為了使其靠近樹突胞膜必須調控好其反向細胞核周圍的反向運動。樹突遠端是肌動蛋白的富集區域,當黑素小體一旦與肌球蛋白Va完成結合,這種長距離雙向運動就會馬上停止。此時,黑素小體就會只限定于樹突的遠端區域并做短距離的局部運動。這提示MYL2和MYL3或許在黑素小體與肌球蛋白結合過程中起到了抑制作用,即二者在雙向運動中阻止黑素小體靠近樹突遠端,從而導致黑素小體轉運受到抑制,黑色素形成受阻,最終皮膚膚色變淡。至于MYL2和MYL3基因如何調控的,還有待于進一步研究。

肌球蛋白已被證明在囊泡運輸、肌動蛋白組織和細胞運動中發揮作用。激酶和磷酸酶是許多細胞過程的關鍵調節成分。肌球蛋白發揮其作用時以激酶-磷酸酶途徑最為突出,即肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)和肌球蛋白輕鏈磷酸酶(MLCP)。肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK),是一種鈣調素(calmodulin,CaM)依賴酶。當MLCK活性和表達增強時,將催化肌球蛋白輕鏈的磷酸化,誘導細胞內Ca+增加,導致肌動球蛋白激活其ATP酶,從而導致平滑肌進行收縮。有研究顯示MYL2磷酸化誘導的肌球蛋白環收縮是調節腸黏膜的生理和病理的關鍵途徑,肌球蛋白環收縮會導致緊密連接結構和組成的分子重組,包括閉合蛋白內吞作用。至于雞皮膚組織中是否由于肌球蛋白輕鏈磷酸化影響導致MYL2和MYL3表達的下調,進而引起雞膚色的加深還有待于進一步研究。

本實驗通過對黑膚雞和白膚雞皮膚組織中MYL2和MYL3基因表達的檢測,發現MYL2和MYL3表達的下調可能使得雞皮膚顏色加深,提示肌球蛋白輕鏈家族很可能影響肌球蛋白的功能,進而參與了雞皮膚黑色素轉運這一過程。