樣品前處理對測定含果粒酸奶中蛋白質的影響

楊麗花，楊 云，宋振娟，于建臣，張云鮮，劉麗云，張廣福

蒙牛乳業（焦作）有限公司，河南焦作 454000

0 引言

蛋白質作為維持生命的重要基礎物質之一，可為人體提供能量，維持細胞生長和更新，提高免疫力[1～4]。隨著人們生活質量的提高，社會各界更關注食品營養健康問題。食品中蛋白質成分含量與人體健康有密切關系，因此，對蛋白質進行準確、可靠的前處理和測定尤為重要，相關檢驗人員必須嚴格落實工作[5～8]。

測定蛋白質方法有3 種：凱氏定氮法、分光光度法、燃燒法，其中凱氏定氮法使用最廣泛、經典，是國家標準指定的方法之一[6，9]。測定含果粒酸奶中的蛋白質時，樣品前處理需使用粉碎設備來打磨粉碎，使果粒破壁、混勻后測定其蛋白質含量。

目前含果粒酸奶的測定過程常出現蛋白質含量值偏高，留樣再測結果偏差較大[10～13]。本研究使用不同型號、不同參數的搗碎機和不同規格的料理杯對同批次含果粒酸奶進行粉碎，對比蛋白質的測定數據，分析粉碎條件對蛋白質含量結果的影響，確定粉碎設備的參數及樣本量，避免結果偏離，提升含果粒酸奶蛋白質測定的準確性。

1 試劑和儀器

1.1 試劑

硫酸銅（CuSO4·5H2O）、硫酸鉀（K2SO4）、濃硫酸（H2SO4）。

1.2 試劑配制

硼酸溶液（1%）：稱取10 g硼酸，加水溶解后稀釋至1 000 mL。

氫氧化鈉溶液（400 g/L）：400 g氫氧化鈉溶于1 000 mL水中。

溴甲酚綠-甲基紅混合指示劑溶液：稱取0.07 g甲基紅及0.1 g溴甲酚綠指示劑，溶于無水乙醇，定容至100 mL。

混合指示劑硼酸溶液（1∶100）：10 mL混合指示劑加入1 000 mL 1%硼酸溶液。

硫酸標準溶液[C（1/2H2SO4）=0.05 mol/L]。

1.3 儀器參數條件

電子天平：精度為0.1 mg。

凱氏定氮儀（全自動定氮儀）：加水稀釋體積50 mL；氫氧化鈉體積30 mL；延遲時間5 s；蒸餾強度90%。

消化爐：180 ℃消化10 min；220 ℃消化10 min；350 ℃消化10 min；420 ℃消化1 h。

尾氣處理裝置。

消化管、瓶頂移液器（移取硫酸，需調到所用刻度）。

2 分析步驟

半固體有果粒樣品可用均質機、料理機或搗碎機等打磨均勻，制備過程應避免帶入水分或其他雜質，制備好的樣品選擇合適密閉容器保存，避免水分揮發及雜質落入。稱取充分混勻的樣品0.5～2.0 g至消化管中，再加入硫酸銅、硫酸鉀及濃硫酸于消化爐進行消化，當消化爐溫度達420 ℃后，繼續消化1 h，此時消化管中液體呈綠色透明狀[14]，取出冷卻后，于自動凱氏定氮儀（使用前加入氫氧化鈉溶液、硫酸標準溶液、含有混合指示劑的硼酸溶液）上自動加液、蒸餾、滴定和記錄滴定數據。

3 結果分析

3.1 使用1號搗碎機粉碎果粒酸奶的蛋白質測定結果

使用1號搗碎機粉碎樣品，將250 mL料理杯用樣品充滿，設置轉速為13 000 r/min，粉碎時間為2 min。粉碎后樣品呈均勻狀態，無泡沫，見圖1。對該條件下粉碎的15 個樣本進行蛋白質測定，稱取0.5～2.0 g樣品，加入催化劑及硫酸溶液，同時做空白試驗，于消化爐進行消化，冷卻后上機蒸餾，測定結果為2.40～2.51 g/100 g，數據范圍正常，見表1。

表1 使用1號搗碎機的蛋白質測定結果

圖1 使用1號搗碎機粉碎后的樣品狀態

3.2 使用2號搗碎機粉碎果粒酸奶的蛋白質測定結果

使用2號搗碎機粉碎樣品，將250 mL料理杯用樣品充滿，設置轉速為18 000 r/min，粉碎時間為2 min。粉碎后樣品呈均勻狀態，無泡沫，見圖2。對該條件下粉碎的同批次15 個樣本進行蛋白質測定，稱取0.5～2.0 g樣品，加入催化劑及硫酸溶液，同時做空白試驗，于消化爐進行消化，冷卻后上機蒸餾，測定結果為2.40～2.53 g/100 g，數據范圍正常，見表2。

表2 使用2號搗碎機的蛋白質測定結果

表3 使用3號搗碎機的蛋白質測定結果

圖2 使用2號搗碎機粉碎后的樣品狀態

3.3 使用3號搗碎機粉碎果粒酸奶的蛋白質測定結果

使用3號搗碎機粉碎樣品，加入250 mL樣品時，未將500 mL料理杯充滿，上方有空氣存在，設置轉速為18 000 r/min，粉碎時間為2 min。粉碎后樣品上方有大量氣泡，見圖3。對該條件下粉碎的同批次15 個樣本進行蛋白質測定，稱取0.5～2.0 g樣品，加入催化劑及硫酸溶液，同時做空白試驗，于消化爐進行消化，冷卻后上機蒸餾，測定結果為2.46～2.92 g/100 g，數據范圍偏高，見表6。

圖3 使用3號搗碎機粉碎后的樣品狀態

3.4 3 種搗碎機的比較分析

3.4.1 不同搗碎機打碎樣品時產生氣泡不同

對同批次樣品使用不同粉碎設備，樣本量相同時，料理杯規格不同，粉碎狀態也不同。料理杯充滿時無氣泡；料理杯未充滿粉碎時，因有空氣進入，導致氣泡產生，見表4。

表4 不同搗碎機粉碎同批次樣品的狀態

3.4.2 粉碎過程產生氣泡導致蛋白質結果偏高

上述條件下，對同批次樣本測定蛋白質，發現無氣泡產生的樣本結果正常，最大值2.53 g/100 g，最小值2.40 g/100 g；有氣泡產生的樣本結果偏高，最大值2.92 g/100 g，最小值2.39 g/100 g（表5、圖4）。

表5 不同搗碎機粉碎同批次樣品的蛋白測定數據

圖4 不同搗碎機粉碎同批次樣品的蛋白測定數據分析圖

結果顯示，樣品充滿料理杯，沒有進入空氣的1號搗碎機和2號搗碎機結果相近，絕對差值在0.00～0.05 g/100 g；樣品未充滿料理杯，有空氣進入的3號搗碎機使得蛋白質的測定結果偏高，絕對差值0.01～0.45 g/100 g，其中有5 組數據超出國標允許偏差（即獲得2 次獨立結果的絕對差值不超過算術平均值的10%）。

4 結論

由于含果粒酸奶樣品未充滿料理杯，粉碎時空氣進入，形成的氣泡不易破裂，氣泡不會立即消失，而是越聚越多，使樣品狀態發生變化，導致蛋白質測定結果偏高。日常測定過程中要選擇合適的粉碎設備，設定合適轉速和時間（建議轉速≥10 000 r/min，時間1～2 min）。粉碎時根據料理杯規格，選取匹配的樣本量，或根據樣本量選擇合適規格的料理杯，使樣品充滿料理杯，避免粉碎過程引入空氣，產生氣泡使蛋白質結果偏離。