姜黃素對黃曲霉菌的生長抑制

楊友洋, 張丹鳳, 王永海, 馬志桃, 葉應旺

(合肥工業大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

黃曲霉菌(Aspergillusflavus)是一種土壤腐殖真菌,玉米、花生等谷類收獲前后都會腐爛作物的種子[1]。黃曲霉最適生長溫度范圍為25～42 ℃,其中最適毒素產生溫度為28 ℃[2]。這些真菌會導致食物變質,甚至還會產生有劇毒的毒素,其中黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)因其對肝的毒性和極強的致癌性而備受關注。動物食用含有黃曲霉毒素的谷物,嚴重情況可導致死亡,人類長時間食用含低濃度黃曲霉毒素的食物被認為是導致胃癌、肝癌、腸癌等疾病的主要原因[3]。黃曲霉毒素對人類和牲畜造成嚴重的健康問題,因此超過100多個國家在食品與飼料中嚴格限制毒素水平,其中用于人類和奶牛的玉米受到最嚴格限制,為20/1 000 000 000[4]。近年來,盡管引進了新的抗真菌藥物和防腐劑,但是由于耐藥性和環境污染逐漸增加,尋找安全可靠的抗真菌藥物引起全世界研究者的興趣。

姜黃素(C21H20O6)是從姜黃根莖中提取的小分子量疏水多酚類化合物,也是姜黃的主要成分,具有抗菌、抗炎、抗腫瘤等廣泛的藥理活性[5-6]。姜黃素被世界衛生組織、聯合國糧食及農業組織歸列為食品添加劑[7],也是我國在《食品添加劑使用衛生標準》(GB 2760—1981)中最早頒布的,是在食品中被允許使用的9種天然色素之一[8]。姜黃素作為天然光敏劑,對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、擬莖點霉、灰霉等致病菌均有抑制效果[9]。由于姜黃素良好的抑菌效果,在食品安全領域得到人們的關注和重視。

1 實驗材料和方法

1.1 材料和試劑

黃曲霉菌株(JXZS-117-1)由中國農業科學院油作物研究所惠贈;姜黃素(純度≥98%)購自Sigma-Aldrich(St. Louis, USA)。

1.2 實驗方法

1.2.1 孢子萌發率和芽管長度

參考文獻[10]的方法,在90 mm的培養皿中加入10 mL的PDA,取100 μL收集的孢子液并用玻璃涂布棒在平板表面涂抹均勻。放置在28 ℃的恒溫培養箱中靜置培養12 h。在光學顯微鏡下觀察萌發情況。記錄和計算平板上孢子的芽管長度和萌發率,萌發率計算公式如下:

其中:S1為總的孢子個數;S2為萌發的孢子個數。

1.2.2 抑菌劑對致病菌生長抑制效果

根據文獻[11]的方法,將在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養基培養7 d正常生長的黃曲霉使用5 mm打孔器,取菌餅于含0.3 mmol/L的姜黃素PDA的培養皿正中央,在空白對照組中只加入PDA。將樣品放入28 ℃的恒溫培養箱中培養3 d。觀察并測量黃曲霉菌落直徑。每個處理重復3次,進行3次實驗。

1.2.3 毒素檢測

根據文獻[12]的方法并稍作改動。在10 mL的試管中加入5 mL的馬鈴薯葡萄糖培養液(potato dextrose broth,PDB),添加姜黃素使最終濃度為0.3 mmol/L,加入100 μL已過濾的5×105個/mL的黃曲霉孢子液,然后放置在轉速為180 r/min、溫度為28 ℃的恒溫搖床中。在搖床中培養7 d后收集菌絲和培養液。將收集的菌絲在50 ℃的烘箱中烘干水分并不時地記錄菌絲質量,待質量不再變化記錄最終菌絲干重。

將去除菌絲的培養液加入到50 mL的離心管中并加入1 g NaCl,用pH=7的磷酸緩沖液稀釋至25 mL,將溶液震蕩混勻并超聲30 min,過濾備用。準確量取5 mL濾液加入到免疫親和柱中,然后將免疫親和柱接到5 mL的注射器下,調整注射器流速使溶液以2 mL/min的流速緩慢流過免疫親和柱,再以2 mL/min的流速用0.1%吐溫/PBS清洗,用10 mL的蒸餾水清洗2次。棄去全部流出的液體,并將3 mL的空氣注入免疫親和柱,再用2 mL的色譜級甲醇洗脫毒素,收集洗脫液。洗脫液用0.22 μm的有機相過濾器過濾收集。準確吸取300 μL的樣品加入樣品收集瓶中待測。液相條件為:流動相為甲醇和水(體積比為70∶30),流速1 mL/min,柱溫40 ℃。熒光檢測激發波長360 nm,發射波長440 nm。

計算單位質量菌絲產生的毒素,計算公式為:

其中:T為單位菌絲產生的毒素量;c為毒素的檢測濃度;m為菌絲的干質量。

1.2.4 洋蔥穿透實驗

參照文獻[13]的方法,準備一個新鮮、無損傷的洋蔥,用刀片在內表皮上切出一個邊長1 cm的正方形,用無菌的鑷子剝去洋蔥的表皮,將撕下的洋蔥內表皮裝入含有50 mL無菌水的培養瓶中。密封之后將培養瓶放置在68 ℃的水浴鍋中加熱1 h以殺死洋蔥細胞。加熱結束后使用無菌蒸餾水將內表皮清洗2遍,清除表皮上的多余組織。配制5×105個/mL的黃曲霉孢子液,并在孢子液中加入姜黃素使其濃度為0.3 mmol/L,設置不含有姜黃素的空白對照。然后用移液槍取100 μL的孢子液加入到洋蔥表皮,將孢子液在表皮涂抹均勻。將處理后的洋蔥表皮放置在培養皿中保濕、避光、室溫下孵育12 h后,加入0.25%的臺盼藍染液染色4 min,然后用移液槍小心地除去染液,再吸取無菌蒸餾水吹洗掉剩余的染液。最后制片在普通光學顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5 侵染花生實驗

參考文獻[14]的方法,并且稍作改進。準備孢子懸浮液并用血球計數板計數,制成5×105個/mL的孢子液100 mL。將花生粒稱重記錄,用1%的次氯酸鈉浸泡1 min,取出后用無菌水沖洗2次,放置在超凈臺吹干。將花生放入孢子液中浸泡30 s,取出后放置在含少量無菌水濾紙的培養皿中,將培養皿放置在28 ℃恒溫培養箱中培養7 d。對照組是用未處理的黃曲霉孢子液浸泡,設置空白對照。每個處理重復3次,進行3次實驗。

1.2.6 花生感官評價

為了評價姜黃素的加入對花生的感官是否會產生影響,參考文獻[15]的方法,對加入姜黃素的花生進行感官評價。具體操作為:將花生加入到0.3 mmol/L的姜黃素中進行浸泡,使用清水浸泡的花生做空白對照,浸泡結束后將花生放置在通風處晾干,2 d后將部分姜黃素處理的花生進行清水清洗。實驗邀請13位人員對花生進行感官評價,通過對樣品仔細觀察、嗅聞和品嘗,對各項指標進行評分,具體評價標準見表1所列。

表1 花生感官評價標準

1.2.7 抑菌劑對病原菌形態學的影響

根據文獻[16]的方法并稍作修改,從7 d正常生長的黃曲霉菌板中截取菌餅,加入到含無菌水的培養瓶中,振蕩充分,用兩層擦鏡紙進行過濾,取10 μL菌液放置在血球計數板中進行計數,獲得5×105個/mL的孢子液;然后在添加0.3 mmol/L姜黃素的PDA培養皿中,吸取100 μL的孢子液加到培養皿中,用玻璃涂布棒將孢子液涂抹均勻,放置在28 ℃的恒溫培養箱中培養7 d;再將處理后的黃曲霉菌重新提取孢子,加入含姜黃素的平板中,進行連續3代的培養并觀察菌落形態和色素產生情況。每個處理重復3次,進行3次實驗。

1.2.8 黃曲霉菌對姜黃素的耐受性分析

為了探究黃曲霉菌對姜黃素的長期處理會不會產生耐受性,在含有0.3 mmol/L姜黃素的PDA 平板上培養黃曲霉菌,待產孢后觀察菌落形態并收集孢子,用無菌水過濾黃曲霉孢子,制成5×105個/mL的黃曲霉孢子懸浮液;取100 μL孢子懸浮液加入到含姜黃素和不含姜黃素的PDA板中,然后用玻璃涂布棒涂抹均勻。將接種好的平板放置在28 ℃的培養箱中,培養7 d。第7天收集平板上的孢子過濾,得到第1代姜黃素處理的孢子液;繼續將得到的孢子液在姜黃素處理的平板中連續培養3代,獲得第3代姜黃素處理后的黃曲霉孢子。然后使用第3代孢子進行花生侵染實驗。每個處理重復3次,進行3次實驗。

1.3 數據分析

所得數據使用Excel 2013進行統計計算,并用SPSS 17.0進行方差分析(ANOVA),計算平均值之間是否存在顯著性差異用Duncan多重檢驗法,P<0.05認為差異顯著,不同字母表示不同處理之間具有顯著性差異。文中柱狀圖使用Origin 8.0進行繪制。

2 結果與分析

2.1 孢子萌發率和芽管長度分析

真菌侵染花生、玉米等主要通過如下途經孢子附著在其表面、在適當的環境下萌發、菌絲不斷擴張,從而導致食物污染。抑制孢子萌發率和芽管長度是抑制真菌污染的重要指標。

姜黃素連續處理對黃曲霉的孢子萌發率和芽管長度抑制情況如圖1所示。

圖1 姜黃素對黃曲霉孢子萌發率和芽管長度的抑制作用

由圖1可知:與污染陽性對照組相比,姜黃素處理組的黃曲霉孢子萌發率和芽管長度降低;污染陽性對照組的黃曲霉孢子萌發率為92.7%,姜黃素處理組的黃曲霉孢子萌發率為81.3%,降低了11.4%;黃曲霉孢子芽管長度實驗中污染陽性對照組長度為45.8 μm,姜黃素處理組為32.6 μm,芽管長度降低了28.8%。結果表明,姜黃素連續處理可以在一定程度上抑制黃曲霉孢子萌發率和芽管長度(P<0.05)。

2.2 抑菌劑對病原菌抑制效果

為了探究姜黃素對黃曲霉是否抑制,首先在體外實驗中,通過平板實驗,在培養基中加入姜黃素觀察其對黃曲霉菌落的生長情況。

姜黃素對黃曲霉的抑制情況如圖2所示。從圖2可以看出:姜黃素處理后明顯地抑制了黃曲霉菌落的生長;相對于污染陽性對照組,黃曲霉正常生長直徑平均為14 cm,而姜黃素處理組的黃曲霉生長直徑為11 cm,抑制生長率為21.4%。可以看出,加入姜黃素對黃曲霉的生長具有抑制作用(P<0.05)。

圖2 姜黃素對黃曲霉生長抑制情況

2.3 姜黃素對AFB1產生量的抑制作用

農產品遭受黃曲霉的污染主要是由于其能夠產生致命性黃曲霉毒素B1,通過檢測黃曲霉毒素B1含量,能夠進一步評估姜黃素對黃曲霉的抑制作用。樣品經過濾處理后,通過免疫親和柱的富集,再經過三氟乙酸進行柱前衍生,樣品置于高效液相色譜(high performance liquid chromatogrphy,HPLC)熒光檢測器檢測。黃曲霉毒素B1產量如圖3所示。

圖3 姜黃素對AFB1產生量的抑制作用

由圖3可知:姜黃素處理組的黃曲霉毒素B1的產生量為23.8 ng/g,污染陽性對照組的產生量為47.5 ng/g;相比之下,姜黃素處理組毒素降低了46.9%。分析結果可知,姜黃素能夠顯著降低黃曲霉毒素B1的產生(P<0.05)。因此,姜黃素作為天然的抑菌劑具有極大的開發潛力。

2.4 洋蔥穿透實驗結果

黃曲霉在發生侵染時,本文首先通過芽孢萌發產生菌絲,然后通過菌絲汲取生存所需要的養分。菌絲的活力強弱會影響黃曲霉侵染的嚴重程度。通過對菌絲做洋蔥表皮穿透實驗,測試菌絲活力。

臺盼藍染色后在顯微鏡下觀察,孢子穿透洋蔥表皮如圖4所示。從圖4可以看出,污染陽性對照組在萌發生長后,菌絲穿透洋蔥表皮進入洋蔥細胞內,這會導致在洋蔥細胞外部的菌絲會被臺盼藍染成藍色,而留在內部的菌絲未被染色。姜黃素處理組的黃曲霉菌絲大都被染上了藍色,黃曲霉的菌絲活性降低,說明姜黃素降低了黃曲霉菌絲的穿透能力。

圖4 姜黃素對黃曲霉菌絲穿透力的影響

2.5 侵染花生實驗結果

因為花生易受黃曲霉的侵染,所以在之前平板抑制實驗的基礎上,進一步評估姜黃素對黃曲霉的防控效果。黃曲霉侵染花生情況如圖5所示。

圖5 姜黃素對花生黃曲霉病的抑制作用

從圖5可以看出,培養7 d后,污染陽性對照組花生全部發病,而姜黃素處理組的花生僅是輕微感染,發病情況明顯低于污染陽性對照組,因此姜黃素具有開發為新型抑菌劑控制食品和飼料原料中黃曲霉污染的前景。

2.6 花生感官評價結果

花生感官評價結果見表2所列。由表2可知,濃度為0.3 mmol/L姜黃素的加入并不會顯著影響花生的口感和氣味(P>0.05),但是對于花生的色澤產生了顯著性的影響(P<0.05),使用清水清洗后會顯著減少姜黃素對花生色澤的影響(P<0.05)。結果表明,姜黃素的加入并不會影響花生的氣味和口感,對姜黃素應用具有重要的意義。

表2 花生感官評價結果

2.7 抑菌劑對病原菌形態學的影響

通過實驗發現,姜黃素連續處理3代對黃曲霉形態的影響如圖6所示。由圖6可知,在添加抑菌劑的黃曲霉中,姜黃素處理組連續處理3代孢子的顏色呈現出乳白色,而污染陽性對照組培養連續3代仍然呈現黃綠色。結果表明,姜黃素會抑制黃曲霉孢子色素的合成。

圖6 姜黃素連續處理3代對黃曲霉形態的影響

2.8 黃曲霉對姜黃素的耐受性

為了探究黃曲霉對姜黃素的耐受性,通過對黃曲霉3代的不斷培養,第3代孢子感染花生情況如圖7所示。

圖7 姜黃素平板連續培養3代黃曲霉侵染花生發病情況

從圖7可以看出,在污染陽性對照組中花生全部發病,而在姜黃素處理組中,花生僅部分感染。這說明經過姜黃素處理3代后的黃曲霉孢子侵染能力明顯下降。結果表明,經過姜黃素處理后產生的黃曲霉孢子的活性同樣受到一定的抑制作用,黃曲霉對姜黃素并沒有產生耐受性,因此姜黃素具有作為一種長期抑菌劑的潛力。

3 結 論

本文主要研究了姜黃素對黃曲霉的抗真菌效果。通過姜黃素對黃曲霉抑制效果、形態學影響、菌絲的活力檢驗、毒素產量檢測、侵染花生實驗以及黃曲霉對姜黃素的耐受性實驗,初步證明姜黃素對黃曲霉具有抑制作用。下一步實驗將對相關抑制機理進行研究,以期對黃曲霉抑制提供新的思路。