電針預(yù)處理抑制腦缺血后神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接通訊功能及其作用機(jī)制

邢學(xué)良,曲陽,辛貴樂,周海純

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué);2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院;3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第四醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150001)

腦缺血指由于腦血管病變或其他原因?qū)е履X部血流量減少,使腦組織缺乏足夠的氧和營養(yǎng),引起腦功能障礙或損傷的一種病理狀態(tài)[1]。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞之間通過縫隙連接形成功能網(wǎng)絡(luò),實(shí)現(xiàn)物質(zhì)和信息的交換[2]。縫隙連接是一種由兩個半通道組成的細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu),在正常情況下,縫隙連接對維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和組織功能有重要作用[3]。然而,在一些病理情況下,如缺血、創(chuàng)傷、感染等,縫隙連接可能發(fā)生異常改變,引起細(xì)胞內(nèi)外離子與小分子平衡失調(diào),從而加重細(xì)胞損傷或死亡[4]。研究[5]發(fā)現(xiàn),縫隙連接通訊在腦缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化及血管反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。因此,調(diào)控縫隙連接通訊功能是防治腦缺血的有效策略。

研究[6]表明,藥物、高壓氧、亞低溫等預(yù)處理方式都能誘導(dǎo)腦缺血耐受現(xiàn)象,但上述預(yù)處理措施仍存在一定局限性[7]。電針是一種利用微弱的電流刺激針刺腧穴以防治疾病的中醫(yī)療法,臨床可操作性強(qiáng),應(yīng)用前景廣闊。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),電針預(yù)處理可誘導(dǎo)腦缺血耐受,降低腦缺血區(qū)皮層細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)。本研究旨在探討電針預(yù)處理對大鼠局灶性腦缺血后神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接通訊功能的影響及其作用機(jī)制,以期探尋腦缺血防治的新靶點(diǎn),為電針作為腦缺血的防治措施提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

選取96只成年雄性大鼠,體重220～250 g,飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)SPF級鼠房的鼠籠內(nèi),溫度22～24 ℃,濕度50%,每6只大鼠飼養(yǎng)于一個鼠籠中;適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,在此期間大鼠可以自由進(jìn)食和飲水,每日12 h明暗交替光照。本實(shí)驗(yàn)方案已獲黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)(ZHY-L-2022015)。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要儀器 MSZ25熒光顯微鏡(日本尼康)、CRYOCUT-1800冰凍切片機(jī)(德國徠卡)、JW-3021HR 高速冷凍離心機(jī)(安徽嘉文)、TXDRB恒溫加熱板(湖北天鑫)、Western blots蛋白電泳儀(美國/伯樂)、VE-186 轉(zhuǎn)膜儀(上海天能)、SDZ-III 電針儀(蘇州華佗)。

1.2.2 主要試劑 生理鹽水、氯胺酮(人福醫(yī)藥集團(tuán)股份公司)、PVDF膜(美國西格瑪奧德里奇公司)、Trizol、RIPA裂解液及BCA測定試劑盒(美國賽默飛世爾科技公司)、Western blot 檢測試劑盒(美國/伯樂)、縫隙連接通訊阻滯抑制劑CBX(四川省維克奇生物科技有限公司)。山羊抗兔二抗(貨號ab6721,Abcam,英國)。見表1。

表1 特異性一抗及內(nèi)參的種類、濃度、貨號、廠家

1.3 方法

1.3.1 大鼠分組及MCAO模型構(gòu)建 (1)實(shí)驗(yàn)大鼠分組：假手術(shù)組(A組)、大腦中動脈閉塞模型(MCAO)組(B組)、電針預(yù)處理+MCAO組(C組)、縫隙連接抑制劑甘珀酸(CBX)+MCAO組(D組),每組各24只。A組大鼠不進(jìn)行MCAO模型構(gòu)建。B組大鼠僅接受MCAO模型構(gòu)建;C組大鼠于電針治療3周后,接受MCAO模型構(gòu)建;D組大鼠于術(shù)前2 h向大鼠側(cè)腦室注射10 μL濃度為5 μg/μL的CBX,接受MCAO模型構(gòu)建。(2)電針預(yù)處理方法：選取大鼠百會穴,45 °進(jìn)針,深度2 mm,連接電針治療儀,正極接百會穴,負(fù)極夾在大鼠耳朵上,選取疏密波,頻率、刺激強(qiáng)度分別設(shè)置2/15 Hz、1 mA,刺激30 min,每周治療5 d,1次/d。(3)CBX注射方法：將大鼠在鼠腦立體定位儀上固定,將其切開頭皮,暴露項(xiàng)骨找到Bregma點(diǎn),保持原點(diǎn)和Bregma點(diǎn)對齊,緩慢移動定位儀,向后0.8 mm旁開1.4 mm處鉆孔,直至鉆破顱骨,固定微量注射器,自項(xiàng)骨起,進(jìn)針深度3.8 mm,進(jìn)針正確指回抽可見清亮液體。將CBX緩慢注射后,停留約15 min,將枕頭緩慢拔出后對頭皮進(jìn)行縫合。(4)MCAO大鼠模型構(gòu)建方法：對大鼠進(jìn)行術(shù)前12 h禁食處理,采用水合氯醛進(jìn)行全身麻醉,同時保持其體溫(37.0±0.5)℃;在消毒頸部正中進(jìn)行切口,露出頸總動脈、頸外動脈及頸內(nèi)動脈,將頸總動脈和頸外動脈進(jìn)行結(jié)扎,于頸總動脈分叉下方做一小切口,向頸內(nèi)動脈內(nèi)插入3.0尼龍單纖絲線(一頭末端烤成圓頭),深度17～18 mm;采用激光多普勒流量計(jì),觀測并確認(rèn)大鼠的腦血流阻斷情況。模型構(gòu)建成功的標(biāo)志是中腦動脈腦血流下降至基線值的30%以下;對頸內(nèi)動脈進(jìn)行結(jié)扎,并等待120 min以形成腦缺血,然后移除尼龍線以使血流恢復(fù)。

1.3.2 取材 分別于再灌注12 h、再灌注3 d進(jìn)行取材,每次每組取12只大鼠。快速斷頭取腦,分離右側(cè)大腦皮層,置于冰箱-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 免疫熒光雙標(biāo)法觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞上Cx43表達(dá)情況 采用冰凍切片機(jī)將大鼠腦組織制成10 μm的連續(xù)切片,貼附于玻片上(已采用多聚賴氨酸包被過)。放置3 min晾干,保存于-80 ℃冰箱待測。采用SP法雙重染色,進(jìn)行Cx43、GFAP雙標(biāo),觀察Cx43在星形膠質(zhì)細(xì)胞上的表達(dá)量及表達(dá)位置的變化。具體方法參照試劑盒說明。采用500 mL/L的甘油封片,于熒光顯微鏡下觀察并拍攝照片。設(shè)置陰性對照,采用山羊血清稀釋液替代一抗,二抗與實(shí)驗(yàn)組相同。

1.3.4 Western blot檢測缺血半暗區(qū)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接通訊相關(guān)蛋白表達(dá)情況 根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行蛋白提取和濃度測定。使用預(yù)冷蛋白提取液對樣本進(jìn)行稀釋后,保存在-80 ℃冰箱中。從每個樣本中取等量蛋白,進(jìn)行SDS-PAGE以將蛋白分離后,將蛋白轉(zhuǎn)膜,加入一抗、二抗進(jìn)行免疫反應(yīng),DAB染色反應(yīng),將完成染色并干燥的膜拍照,并分析結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞上Cx43表達(dá)情況

Cx43主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞膜表面與突起部位表達(dá)。再灌注12 h,B組、C組、D組Cx43、GFAP熒光強(qiáng)度均高于A組(P<0.05);B組、C組、D組各組間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。再灌注3 d,B組、C組、D組Cx43、GFAP熒光強(qiáng)度均高于A組(P<0.05);C組、D組Cx43、GFAP熒光強(qiáng)度均低于B組(P<0.05);C組與D組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1及圖2。

2.2 各組大鼠缺血半暗區(qū)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接通訊相關(guān)蛋白表達(dá)情況

再灌注12 h,B組、C組、D組Cx43、p-Cx43-S368、p-Cx43-S262、GFAP、PKC、AT1R均高于A組(P<0.05),NeuN、eNOS均低于A組(P<0.05);B組、C組、D組各組間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。再灌注3 d,B組、C組、D組Cx43、p-Cx43-S368、p-Cx43- S262、GFAP、PKC、AT1R均高于A組(P<0.05),NeuN、eNOS均低于A組(P<0.05);C組、D組Cx43、p-Cx43-S368、p-Cx43-S262、GFAP、PKC、AT1R 均低于B組(P<0.05),NeuN、eNOS均高于B組(P<0.05);C組與D組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

3 討論

大量研究證實(shí)[8-10],電針百會穴對腦缺血后神經(jīng)元具有保護(hù)作用,但其作用機(jī)制尚未完全明確。星形膠質(zhì)細(xì)胞主要功能包括支持神經(jīng)元存活、維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)等[11]。相鄰星形細(xì)胞之間、相鄰腳板之間存在縫隙連接。縫隙連接通訊是指細(xì)胞間縫隙連接通道,允許第二信使、離子和其他分子量<1.5KDa 的分子通過,直接介導(dǎo)細(xì)胞間的信息交流[12]。Cx43是星形膠質(zhì)細(xì)胞上最常見的縫隙連接蛋白,其在維持神經(jīng)組織的組織穩(wěn)定及物質(zhì)調(diào)控方面發(fā)揮重要作用。在腦缺血再灌注損傷中,Cx43的作用及其影響仍然存在爭議。

部分研究[13-15]認(rèn)為Cx43具有神經(jīng)保護(hù)作用,如任文鑫等[13]以24只雄性SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對象,發(fā)現(xiàn)缺血再灌注組大鼠相較假手術(shù)組Cx43表達(dá)下調(diào)、分布紊亂;另有研究認(rèn)為Cx43具有作用促進(jìn)凋亡的作用,李保龍等[14]指出,MCAO模型組大鼠缺血側(cè)皮層腦組織中Cx43表達(dá)水平明顯高于假手術(shù)組;Zhang等[15]通過構(gòu)建小鼠缺氧/復(fù)氧體外模型發(fā)現(xiàn),缺氧/復(fù)氧損傷導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞活化增加,Cx43水平明顯增加,而丙泊酚治療可通過下調(diào)膠質(zhì)細(xì)胞中Cx43水平而降低MCAO大鼠梗死體積與細(xì)胞凋亡程度。本研究中,再灌注12 h,B組、C組、D組Cx43、GFAP熒光強(qiáng)度及Cx43、p-Cx43-S368、p-Cx43- S262、GFAP、PKC、AT1R蛋白表達(dá)水平均高于A組(P<0.05),NeuN、eNOS蛋白表達(dá)水平均低于A組(P<0.05),提示MCAO模型構(gòu)建成功后,縫隙連接通訊功能異常活躍,影響星形膠質(zhì)細(xì)胞中Cx43表達(dá);而再灌注3 d時上述差異更為明顯,這可能是由于隨著時間的推移,大鼠缺血灶會逐漸擴(kuò)大,縫隙連接通訊將梗死中心區(qū)的死亡信號逐漸傳遞至梗死周邊區(qū),進(jìn)一步影響上述縫隙連接通訊相關(guān)蛋白表達(dá)水平。進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn),再灌注3 d,C組、D組Cx43、GFAP熒光強(qiáng)度及Cx43、p-Cx43-S368、p-Cx43- S262、GFAP、PKC、AT1R蛋白表達(dá)水平均低于B組(P<0.05),NeuN、eNOS表達(dá)水平均高于B組(P<0.05),提示電針預(yù)處理可能通過調(diào)節(jié)上述蛋白的表達(dá),發(fā)揮了腦保護(hù)作用,推測其作用機(jī)制可能由于電針百會穴預(yù)處理通過調(diào)控細(xì)胞間縫隙連接通訊功能,影響Cx43等縫隙連接通訊相關(guān)蛋白分子通過,從而改善腦缺血/再灌注大鼠神經(jīng)功能缺損,減輕缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)病理損傷,縮小腦梗死體積,抑制缺血區(qū)細(xì)胞凋亡及腦缺血/再灌注期間炎癥級聯(lián)反應(yīng),發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。魏靜靜[16]以MCAO大鼠為實(shí)驗(yàn)對象,提出電針百會穴有利于改善其神經(jīng)功能缺損癥狀,具有腦保護(hù)作用,并推測其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Cx43的表達(dá)相關(guān),與本文研究結(jié)論相似。

綜上,電針預(yù)處理可能通過調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接通訊相關(guān)蛋白的表達(dá),促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)血管重構(gòu),發(fā)揮腦保護(hù)作用。