Piezo1通道激活促進(jìn)大鼠冠脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高的機(jī)制研究*

蔡泳江， 鄭燕湘， 王梓帆， 鄺素娟， 楊 慧， 饒 芳， 鄧春玉，3△

（1南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515；2南方醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，醫(yī)學(xué)研究部臨床藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510080；3華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006）

Piezo1是一種機(jī)械敏感性離子通道蛋白，主要存在于內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells， VSMCs）和成纖維細(xì)胞等細(xì)胞中，能介導(dǎo)Na+、K+、Ca2+和Mg2+等陽(yáng)離子內(nèi)流，但對(duì)Ca2+具有偏向性[1］。Ca2+是VSMCs 內(nèi)重要的第二信使，可以激活鈣蛋白酶并調(diào)控多種轉(zhuǎn)錄因子，參與VSMCs 多種生理病理過程。VSMCs 中Ca2+調(diào)控方式包括細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)Ca2+庫(kù)的Ca2+釋放。Piezo1 能感應(yīng)機(jī)械力刺激并將機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)Ca2+信號(hào)，這種鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可參與調(diào)控多種心血管生理功能已被明確[2］，而且Piezo1 介導(dǎo)鈣信號(hào)失調(diào)也與血管病變有關(guān)[3-4］。研究表明，Piezo1 介導(dǎo)細(xì)胞鈣調(diào)控信號(hào)與心血管疾病存在密切關(guān)系，但是Piezo1 對(duì)細(xì)胞鈣調(diào)節(jié)方式的研究報(bào)道較少，尤其是促進(jìn)冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì) 胞（coronary artery smooth muscle cells， CASMCs）內(nèi)Ca2+濃度升高的作用機(jī)制，更鮮為報(bào)道。因此，本研究主要在細(xì)胞水平上，探究Piezo1 參與調(diào)控大鼠CASMCs中Ca2+穩(wěn)態(tài)的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

SPF 級(jí)9～11 周 齡 雄 性SD 大 鼠30 只，體 質(zhì) 量250～300 g，由廣州銳格生物科技有限公司提供，許可證號(hào)為SCXK（粵）2021-0059。本研究所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已通過廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查（No. KY-Z-2021-581-01）。

2 主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

SP5FCS 激光共聚焦顯微鏡（Leica）；LSM900 激光共聚焦顯微鏡和Stemi DV4型體視顯微鏡（Zeiss）；蛋白電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（北京市六一儀器廠）；LAS500超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀（GE）。

DMEM 培養(yǎng)液（C11885500BT）、澳洲胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）、0.25%胰蛋白酶-EDTA 和青霉素-鏈霉素均購(gòu)自Gibco；Piezo1 激動(dòng)劑Yodal（HY-18723）、Piezo1 抑制劑GsMTx4（HY-P1410A）、鈣庫(kù)操縱性鈣通道（store-operated calcium channel，SOCC）抑制劑BTP2（HY-100831）、雷諾丁受體（ryanodine receptor， RyR）抑制劑dantrolene（HY-12542）和1，4，5-三磷酸肌醇受體（inositol 1，4，5-triphosphate receptor， IP3R）抑制劑xestospongin C（HY-103312）均購(gòu) 自MedChemExpress；肌 漿/內(nèi) 質(zhì) 網(wǎng)Ca2+-ATP 酶2（sarco-/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase 2， SERCA2）抑制劑毒胡蘿卜素（thapsigargin， TG； 049M4032V）、L 型 鈣 通 道 抑 制 劑 硝 苯 地 平（nifedipine， Nif；57H1139）和二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide， DMSO；015K0151）均購(gòu)自Sigma；Piezo1抗體（MA5-32876）購(gòu)自Thermo Fisher；基質(zhì)相互作用分子1（stromal interaction molecule 1， STIM1）抗體（#5668）和SERCA2抗體（#9580）購(gòu)自Cell Signaling Technology；GAPDH 抗體（60004-1-lg）、TOM20 抗體（11802-1-AP）和lamin B1 抗 體（112987-1-AP）均 購(gòu) 自Proteintech；Piezo1siRNA （si-Piezo1）購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；STIM1siRNA （si-STIM1）購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因有限公司；Lipofectamine 3000 （L3000075）購(gòu)自Invitrogen；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

無(wú)鈣臺(tái)式液成分（mmol/L）：NaCl 136.00、KC1 5.40、NaH2PO40.33、MgCl2·6H2O 1.00、D-glucose 10.00 和HEPES 10.00，用NaOH 調(diào) 整pH 至7.35～7.40；含2 mmol/L Ca2+臺(tái)式液成分（mmol/L）：CaCl22.00、NaCl 136.00、KC1 5.40、NaH2PO40.33、MgCl2·6H2O 1.00、D-glucose 10.00 和HEPES 10.00，用NaOH調(diào)整pH至7.35～7.40。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 原代大鼠CASMCs 的獲取及培養(yǎng) 冠狀動(dòng)脈分離方法參考同實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)表的文獻(xiàn)[5］。SD 大鼠吸入CO2麻醉后脫臼處死，75%乙醇消毒皮膚后用無(wú)菌剪刀和鑷子打開胸腔，取出心臟，放入4 ℃預(yù)冷的無(wú)菌PBS 溶液中。在生物安全柜內(nèi)，在體視顯微鏡下使用無(wú)菌顯微剪和顯微鑷分離出大鼠心臟的左前降支、右冠脈和間隔支，去除冠脈周圍脂肪和結(jié)締組織，在直徑35 mm 皿中加入100 μL DMEM 培養(yǎng)液（含20% FBS和1%雙抗），在培養(yǎng)液中將分離好的冠脈剪碎，長(zhǎng)度約0.5 mm，用無(wú)菌巴氏管吸取血管懸液，均勻鋪于25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入5 mL DMEM 培養(yǎng)液（含20% FBS 和1%雙抗），倒置放于恒溫培養(yǎng)箱，于37 ℃、5% CO2條件下靜置1.5 h。待組織塊貼牢后，培養(yǎng)瓶正常放置，繼續(xù)培養(yǎng)。每隔4 d 更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞從組織塊邊緣爬出并生長(zhǎng)至融合成片達(dá)80%后，用0.25%胰酶進(jìn)行消化傳代，后續(xù)使用含10% FBS 和1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，將第2～4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

3.2 原代CASMCs 的siRNA 轉(zhuǎn)染 將第2～4 代的CASMCs 使用Lipofectamine 3000 試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，設(shè)置陰性對(duì)照（si-NC）組和實(shí)驗(yàn)（si-Piezo1/si-STIM1）組。將125 μL Opti-MEM 培養(yǎng)液與5 μL Lipofectamine 3000 試劑混勻后振蕩5 s，制備Lipofectamine 3000 試劑混合液；再將125 μL Opti-MEM 培養(yǎng)液與5 μL 濃度為20 μmol/L 的siRNA 混合，得到siRNA 混合液；按1∶1 體積比混合Lipofectamine 3000 試劑混合液和siRNA 混合液并吹打均勻，室溫靜置15 min；然后與750 μL 無(wú)雙抗的DMEM 培養(yǎng)液（含10% FBS）混合，加入CASMCs中置于培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)染48 h，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用于鈣離子濃度檢測(cè)和Western blot實(shí)驗(yàn)。

3.3 CASMCs 細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度（intracellular Ca2+concentration， [Ca2+］i）檢測(cè) 方法如前期研究所示[5］，將CASMCs 種于激光共聚焦專用皿中，接種密度約50%～60%，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)48 h，需要轉(zhuǎn)染處理的細(xì)胞按“3.2”進(jìn)行干預(yù)。將貼壁的CASMCs用PBS清洗3 次，吸掉PBS 后每皿依次加入1 mL 含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液、3 μL 濃度為5 μmol/L 的Fluo-4 AM 鈣離子指示劑（從此開始全程避光操作），37 ℃、5% CO2孵育30 min；根據(jù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，用無(wú)鈣或者含鈣臺(tái)式液洗2 遍，每皿加入1 mL 的無(wú)鈣或者含鈣臺(tái)式液，分別加入實(shí)驗(yàn)所需抑制劑室溫孵育15 min；在激光共聚焦顯微鏡下選取適合的視野，采用xyt模式掃描6 min或15 min，掃描6 min時(shí)在1 min加入終濃度為10 μmol/L 的Yoda1，掃描15 min 時(shí)分別在1 min 和8 min 加入不同的藥物刺激細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后分別記錄背景熒光值F0，第一次加藥前的基線熒光值F1，第一次加藥后達(dá)到的熒光峰值F2，第二次加藥前的熒光值F3以及之后達(dá)到的熒光峰值F4。計(jì)算第一次加藥干預(yù)后CASMCs 內(nèi)Ca2+上升程度（F2-F0）/（F1-F0）和第二次加藥干預(yù)后CASMCs 內(nèi)Ca2+上升程度（F4-F0）/（F3-F0）。細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度變化曲線使用SigmaPlot 14.0軟件作圖獲得。

3.4 細(xì)胞免疫熒光染色 CASMCs培養(yǎng)在激光共聚焦專用皿約48 h，用PBS 清洗3 次，加入1 mL 4%多聚甲醛室溫固定15 min，隨后PBS 清洗3 次，加入含0.2% Triton X 的PBS溶液室溫打孔15 min，PBS清洗3 次，再加入含4% BSA 的PBS 溶液室溫封閉30 min，棄去封閉液，加入100 μL 用封閉液稀釋的Ⅰ抗（1∶100），于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜。棄去Ⅰ抗后，PBS 清洗3 次，避光條件下加入與Ⅰ抗種屬來(lái)源相同的熒光Ⅱ抗溶液（1∶500）室溫孵育1 h，棄去Ⅱ抗，PBS 清洗3 次，加入適量含DAPI 的封片劑使細(xì)胞被覆蓋，10 min 后用LSM900 激光共聚焦顯微鏡掃描染色結(jié)果。

3.5 Western blot siRNA 處理后的CASMCs 用PBS洗3 次，加入含蛋白酶抑制劑的強(qiáng)RIPA 于冰上裂解30 min，刮下細(xì)胞并收集于EP管中，4 ℃、13 500×g離心15 min，收集的上清液為細(xì)胞總蛋白。BCA 法測(cè)定蛋白濃度后加入上樣緩沖液（4× loading buffer）和RIPA，配成等體積等質(zhì)量的蛋白樣品，100 ℃煮沸10 min使蛋白變性，依次進(jìn)行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉、TBST洗滌3次（每次5 min）、Ⅰ抗4 ℃孵育過夜、TBST 洗滌3 次、Ⅱ抗室溫孵育1 h、TBST 洗滌3次和ECL 試劑盒顯影蛋白條帶。最后利用ImageJ 圖像分析軟件進(jìn)行灰度值結(jié)果分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 21.0進(jìn)行分析，使用GraphPad 9.0 將統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果繪制圖。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)Piezo1 蛋白在CASMCs中的表達(dá)

采用原代細(xì)胞培養(yǎng)獲得CASMCs，再進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果顯示Piezo1在原代培養(yǎng)CASMCs的胞質(zhì)和胞核中均有所表達(dá)，Piezo1蛋白在細(xì)胞核周圍的表達(dá)較高，見圖1。

Figure 1. Cell immunofluorescence staining showed that Piezo1 was expressed in CASMCs （scale bar=20 μm）.圖1 細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示Piezo1在CASMCs中表達(dá)

2 Piezo1 誘導(dǎo)CASMCs 胞內(nèi)Ca2+升高與L 型鈣通道無(wú)關(guān)

如圖2 所示，與DMSO 組相比，Yoda1 （10 μmol/L）組Ca2+熒光強(qiáng)度顯著增加（P＜0.01）；與Yoda1組相比，Yoda1+GsMTx4（3 μmol/L；Piezo1 抑制劑）組Ca2+熒光強(qiáng)度顯著降低（P＜0.01），而Yoda1+Nif（1 μmol/L；L 型鈣通道抑制劑）組Ca2+熒光強(qiáng)度沒有明顯變化。

Figure 2. The changes of intracellular Ca2+ concentration mediated by Piezo1 were not affected by L-type calcium channels.A： representative fluorescence intensity of CASMCs stimulated by Yoda1 in Tyrode's solution with 2 mmol/L Ca2+； B： the changes of intracellular Ca2+ concentration in CASMCs stimulated by Yoda1. Mean±SEM. n=111 in DMSO group； n=154 in Yoda1 group； n=152 in Yoda1+Nif group； n=121 in Yoda1+GsMTx4 group.**P＜0.01 vs DMSO group； ##P＜0.01 vs Yoda1 group.圖2 L型鈣通道不參與Piezo1誘導(dǎo)CASMCs胞內(nèi)Ca2+升高

3 Piezo1 誘導(dǎo)CASMCs 胞內(nèi)Ca2+釋放與IP3R 和RyR通道無(wú)關(guān)

無(wú)鈣臺(tái)式液中加入Yoda1（10 μmol/L），Yoda1組Ca2+熒光強(qiáng)度與DMSO組相比顯著增加（P＜0.01），見圖3A。分別使用IP3R 抑制劑xestospongin C （0.1 μmol/L）和RyR 抑制劑dantrolene （10 μmol/L）抑制IP3R 和RyR 通道，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與Yoda1 組相比，Yoda1+xestospongin C 組 和Yoda1+dantrolene 組Ca2+熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化，見圖3B。

Figure 3. The intracellular calcium release mediated by Piezo1 were not affected by IP3R and RyR calcium channels. A： representative fluorescence intensity of CASMCs stimulated by Yoda1 in Tyrode's solution without Ca2+ （n=101 in DMSO group； n=110 in Yoda1 group）； B： representative fluorescence intensity of CASMCs stimulated by Yoda1 in Tyrode's solution without Ca2+ after treatment with IP3R and RyR inhibitors （n=109 in Yoda1 group； n=122 in Yoda1+xestospongin C group； n=113 in Yoda1+dantrolene group）. Mean±SEM. **P＜0.01 vs DMSO group.圖3 IP3R和RyR鈣通道不參與Piezo1誘導(dǎo)胞內(nèi)Ca2+釋放

4 Piezo1 誘導(dǎo)CASMCs 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和其它細(xì)胞器Ca2+釋放

無(wú)鈣臺(tái)式液中使用SERCA2 抑制劑TG （2 μmol/L），結(jié)果如圖4A～E 所示，第一峰值中TG 引起的Ca2+熒光升高比值明顯高于Yoda1（P＜0.01）；第二峰值中，TG-Yoda1 組Ca2+熒光強(qiáng)度與對(duì)照組TG-TG 組相比顯著增加（P＜0.01），Yoda1-TG 組Ca2+熒光強(qiáng)度與TG-TG 組相比顯著增加（P＜0.01）。免疫熒光染色結(jié)果顯示，Piezo1 與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志物SERCA2、線粒體外膜標(biāo)志物TOM20和核膜標(biāo)志物lamin B1共定位程度較高，見圖4F～H。

5 Piezo1 通過誘導(dǎo)CASMCs 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+耗竭而激活SOCC

如圖5A 所示，與Nif 組相比，Nif+BTP2（10 μmol/L；SOCC抑制劑）組中2 mmol/L CaCl2誘導(dǎo)的Ca2+熒光強(qiáng)度顯著降低（P＜0.01）。敲減STIM1后，Western blot 結(jié)果顯示CASMCs 中STIM1 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01），見圖5B；激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯示si-STIM1 組中2 mmol/L CaCl2誘導(dǎo)的Ca2+熒光強(qiáng)度顯著低于si-NC 組（P＜0.01），見圖5C。敲減Piezo1后，si-Piezo1 組蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05），見圖5D；敲減STIM1后，si-STIM1 組蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01），見圖5E；與si-NC 組相比，si-Piezo1 組中2 μmol/L TG 誘導(dǎo)的Ca2+熒光強(qiáng)度顯著增加（P＜0.05），si-STIM1 組中2 mmol/L CaCl2誘導(dǎo)的Ca2+熒光強(qiáng)度顯著降低（P＜0.01），見圖5F。

6 抑制SOCC 后Piezo1 能誘導(dǎo)CASMCs 胞外Ca2+內(nèi)流

Western blot 結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，si-Piezo1 組中Piezo1 蛋白表達(dá)顯著減少（P＜0.01），見圖6A。在無(wú)鈣臺(tái)式液中使用1 μmol/L Nif 和10 μmol/L BTP2 抑制L 型鈣通道和SOCC，與si-NC 組相比，si-Piezo1 組中10 μmol/L Yoda1 和2 mmol/L CaCl2誘導(dǎo)的Ca2+熒光強(qiáng)度顯著降低（P＜0.01），見圖6B。

Figure 6. Piezo1 on cell membrane induced extracellular Ca2+ influx. A： the protein expression of Piezo1 in the CASMCs after knockdown of Piezo1 （n=4）； B： representative fluorescence intensity of CASMCs stimulated by Yoda1 and CaCl2 in Tyrode's solution without Ca2+ after treatment with Nif and BTP2 （n=195 in si-NC group； n=250 in si-Piezo1 group）. Mean±SEM. **P＜0.01 vssi-NC group.圖6 細(xì)胞膜上Piezo1誘導(dǎo)細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流

討 論

多數(shù)機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)過程依賴于機(jī)械激活的陽(yáng)離子通道來(lái)使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，導(dǎo)致Ca2+依賴的下游信號(hào)通路被激活，進(jìn)而控制不同的細(xì)胞過程和生理反應(yīng)[6］。Piezo1 作為一種機(jī)械敏感性陽(yáng)離子通道，在心血管系統(tǒng)中充當(dāng)壓力傳感器[6］，并與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。研究表明，Piezo1存在于內(nèi)皮細(xì)胞、VSMCs和成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞中，它能將機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)Ca2+信號(hào)，參與細(xì)胞的分化、增殖、遷移等生物過程[4，7］。其中，VSMCs 具備感受機(jī)械刺激和傳導(dǎo)的能力，它在維持血管完整性和血管重塑方面發(fā)揮著重要作用[8］。冠狀動(dòng)脈是供應(yīng)心臟血液的血管，位于冠脈中層VSMCs 的收縮狀況是影響冠脈血流量大小的重要因素，Piezo1能將脈管系統(tǒng)中的生物力學(xué)轉(zhuǎn)化為CASMCs 內(nèi)Ca2+信號(hào)，通過Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)血管功能[2，4］，從而影響心臟的供血。因此，選擇探索Piezo1 在CASMCs 中對(duì)Ca2+穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的機(jī)制對(duì)心血管系統(tǒng)研究有重要意義。本研究通過細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Piezo1存在于原代細(xì)胞培養(yǎng)的CASMCs 中，在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)，且在細(xì)胞核周圍表達(dá)較高，可能是由于Piezo1 廣泛表達(dá)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上[9］，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與核膜相互連接所導(dǎo)致。

VSMCs 內(nèi)Ca2+濃度變化主要包括細(xì)胞膜上Ca2+通道誘導(dǎo)細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)Ca2+儲(chǔ)存器誘導(dǎo)內(nèi)Ca2+釋放。血管平滑肌功能異常在一定程度上取決于細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化[10］，包括Piezo1在內(nèi)的各種Ca2+通道在維持胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)以及調(diào)節(jié)血管平滑肌興奮性中發(fā)揮著重要作用[11］。小分子Yoda1 是Piezo1 的特異性激動(dòng)劑，可直接與Piezo1 結(jié)合，通過改變其構(gòu)象來(lái)激活Piezo1。已有研究證實(shí)Yoda1 可以誘導(dǎo)CASMCs 中Ca2+水平升高[5］，但Piezo1 參與CASMCs 的Ca2+濃度調(diào)節(jié)機(jī)制還不太明確。本研究在含鈣臺(tái)式液中使用Piezo1 的選擇性抑制劑GsMTx4，結(jié)果顯示Yoda1 誘導(dǎo)Ca2+內(nèi)流顯著減少，證明CASMCs 中Ca2+水平升高是由Piezo1 導(dǎo)致的。L 型鈣通道屬于常見的細(xì)胞內(nèi)外Ca2+交換通道，本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Piezo1 誘導(dǎo)CASMCs 中Ca2+水平升高與細(xì)胞膜上的L 型鈣通道無(wú)關(guān)。在無(wú)鈣臺(tái)式液中加入Yoda1，CASMCs 的Ca2+熒 光 強(qiáng) 度 顯 著 增 加，提 示Piezo1 可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+庫(kù)的Ca2+釋放。使用Ca2+通道抑制劑后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Piezo1誘導(dǎo)CASMCs內(nèi)Ca2+釋放與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的RyR和IP3R無(wú)關(guān)。

細(xì)胞內(nèi)大部分Ca2+儲(chǔ)存在細(xì)胞器中[12］，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和核膜等。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的SERCA2 可以將胞質(zhì)中Ca2+重新攝回內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，使用其阻斷劑TG 可以導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+耗竭。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在無(wú)鈣臺(tái)式液中加入TG 引起胞內(nèi)Ca2+釋放顯著高于Yoda1所誘導(dǎo)的Ca2+釋放，而且加入Yoda1之后TG仍能引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放，說明Piezo1只能誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中部分Ca2+釋放；在無(wú)鈣臺(tái)式液中使用TG 排空內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+后，加入Yoda1 也能顯著引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放，說明Piezo1 能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以外其它細(xì)胞器Ca2+釋放。雙標(biāo)免疫熒光染色結(jié)果顯示，Piezo1與CASMCs 中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志物SERCA2、線粒體外膜標(biāo)志物TOM20 和核膜標(biāo)志物L(fēng)amin B1 的共定位程度較高，表明除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以外，Piezo1 也可能誘導(dǎo)線粒體和核膜Ca2+釋放。

SOCC 在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[13］，它主要由STIM1 和通道蛋白ORAI1 構(gòu)成。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+濃度變化信號(hào)能被跨膜Ca2+傳感器STIM1所感知，導(dǎo)致位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的STIM1 遷移至細(xì)胞膜與ORAI1 結(jié)合，隨后激活SOCC，進(jìn)而觸發(fā)鈣庫(kù)操縱性Ca2+內(nèi)流（store-operated calcium entry， SOCE）[14］。因此，進(jìn)一步探究Piezo1 誘導(dǎo)CASMCs 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放后是否會(huì)導(dǎo)致SOCE 發(fā)生。本研究在無(wú)鈣臺(tái)式液中抑制L 型鈣通道以及使用SOCC 阻斷劑BTP2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抑制SOCC后Yoda1誘導(dǎo)細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流減少；通過敲減STIM1抑制SOCC 的功能，實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次證明Yoda1 可以誘導(dǎo)細(xì)胞膜上SOCE 發(fā)生。為了探究Piezo1 誘導(dǎo)SOCE 發(fā)生的機(jī)制，分別敲減Piezo1和STIM1，并且在實(shí)驗(yàn)中抑制了L 型鈣通道，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明敲減Piezo1并不影響TG 誘導(dǎo)的SOCE，提示Piezo1 是通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放從而激活SOCC，可能不會(huì)直接影響SOCC。有研究報(bào)道SERCA2 和Piezo1 的相互抑制作用[15］，本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示敲減Piezo1后TG 誘導(dǎo)的Ca2+釋放顯著增加，證明了Piezo1 對(duì)SERCA2 具有抑制作用。敲減Piezo1并抑制細(xì)胞膜上的SOCC 和L 型鈣通道，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)胞膜上Piezo1通道能誘導(dǎo)胞外Ca2+內(nèi)流。

研究表明Piezo1 介導(dǎo)細(xì)胞Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡是疾病的重要觸發(fā)因素：Piezol 通過升高[Ca2+］i促進(jìn)肺動(dòng)脈高壓的進(jìn)展[9］；高血壓下Piezo1 激活引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+調(diào)控異常是血栓形成的關(guān)鍵[16］；Piezo1 激活調(diào)控Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)加重主動(dòng)脈瓣鈣化病的發(fā)展[17］等。目前大部分研究關(guān)注Piezo1 的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)和Ca2+信號(hào)調(diào)控作用，而Piezo1促進(jìn)CASMCs鈣濃度增加的機(jī)制仍不清楚。研究正常生理狀態(tài)下Piezo1 對(duì)CASMCs 鈣調(diào)節(jié)的機(jī)制，以及Piezo1 與重要Ca2+通道之間的關(guān)系，為疾病狀態(tài)Piezo1 導(dǎo)致鈣穩(wěn)態(tài)失衡提供了干預(yù)策略。[Ca2+］i增加受離子通道和蛋白的調(diào)節(jié)，除了常見的Ca2+通道和Ca2+庫(kù)，細(xì)胞中還有其它更復(fù)雜的鈣調(diào)節(jié)機(jī)制，并且在疾病狀態(tài)下，Piezo1 是如何感知病理變化進(jìn)行Ca2+調(diào)節(jié)仍然未知，因此Piezo1在細(xì)胞中鈣調(diào)控機(jī)制有待更深入的研究。

綜上所述，本研究初步證實(shí)Piezo1 激動(dòng)劑在CASMCs 中誘導(dǎo)細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流主要通過細(xì)胞膜上Piezo1 通道和間接激活的SOCC，也能觸發(fā)胞內(nèi)細(xì)胞器Ca2+釋放，共同增加CASMCs 中[Ca2+］i。這些結(jié)果為Piezo1調(diào)控細(xì)胞Ca2+平衡提供更多可能性。