CD38經(jīng)TFEB介導(dǎo)促進(jìn)溶酶體再生而調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞膽固醇外流*

許 浩， 孫雪妮， 吳天祺， 劉進(jìn)源， 黃倩琳， 莫 蝶， 王嘉馨，陳沈嫻， 鄧伯丹， 許小洋△

（1廣州醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院，廣東 廣州 511436；2廣州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 511436）

近年來發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞因吞噬氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein， oxLDL）而形成的脂滴（膽固醇酯）可以通過自噬[即脂噬（lipophagy）］的方式，與溶酶體融合并被其中的酶水解為游離膽固醇而經(jīng)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)（reverse cholesterol transport，RCT）途徑排出細(xì)胞外[1-2］。因此，促進(jìn)脂噬可防止泡沫細(xì)胞的形成和凋亡、增強(qiáng)RCT，從而起到抑制粥樣斑塊形成的目的。

在脂噬的過程中，隨著溶酶體與含脂滴的自噬體（autophagosome）的不斷融合，溶酶體的數(shù)量將不斷減少[3］。然而，細(xì)胞存在自噬性溶酶體再生（autophagic lysosome reformation， ALR）的機(jī)制[4］，以維持溶酶體數(shù)量的動態(tài)平衡，確保巨噬細(xì)胞對膽固醇攝取、代謝及排出機(jī)制的穩(wěn)態(tài)維持。因此，對溶酶體再生機(jī)制的闡明，將有助于探索抑制泡沫細(xì)胞形成的新途徑，進(jìn)而為動脈粥樣硬化的干預(yù)提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

在ALR 過程中，已明確溶酶體膜上的瞬時感受器電位ML1（transient receptor potential-mucolipin 1，TRPML1）鈣通道釋放的Ca2+，可激活鈣調(diào)磷酸酶（calcineurin， Cn），后者使轉(zhuǎn)錄因子EB（transcription factor EB， TFEB）去磷酸化而進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄活性，從而導(dǎo)致哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR）的激活而促進(jìn)溶酶體再生[5-8］。因此，尋找高效的、可激活TRPML1 的信號分子（或信號通路），將不僅可促進(jìn)溶酶體再生，也將為抑制泡沫細(xì)胞的形成乃至預(yù)防或延緩動脈粥樣硬化的發(fā)生提供靶點(diǎn)。

煙酸腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate， NAADP）作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使，可激活TRPML1通道而增加溶酶體Ca2+釋放[9］。NAADP 可通過ADP 核糖基環(huán)化酶-CD38 催化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP＋）與煙酸（nicotinic acid， NA）反應(yīng)生成[10］。本課題組前期報道過NA 可促進(jìn)巨噬細(xì)胞溶酶體膽固醇外流[11］，高脂飲食的CD38基因敲除小鼠可在冠狀動脈中發(fā)現(xiàn)斑塊的形成[12］，提示CD38/NAADP 可激活TRPML1 而發(fā)揮其抑制巨噬細(xì)胞溶酶體膽固醇蓄積的作用，但其是否可促進(jìn)溶酶體再生仍有待進(jìn)一步觀察。有鑒于此，本研究擬從CD38 入手，觀察其對巨噬細(xì)胞溶酶體再生及膽固醇調(diào)節(jié)的影響，以期為探尋溶酶體再生的觸發(fā)機(jī)制及其效應(yīng)提供新的實(shí)驗(yàn)支持。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

RPMI-1640 培養(yǎng)液和胎牛血清購自Gibco；CD38 siRNA、β-actin 抗體和溶酶體相關(guān)膜蛋白1（lysosomal associated membrane protein 1， Lamp1）抗體購自Santa Cruz；CD38 質(zhì)粒購自GeneCopoeia；siRNA 及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒購自SignaGen；NA 和煙酰胺（nicotinamide）購自Sigma-Aldrich；實(shí)時熒光定量PCR 試劑盒購自Qiagene；山羊抗大鼠Alexa Fluor 633 熒光Ⅱ抗購自Thermo；細(xì)胞培養(yǎng)玻片（8 室）購自Biologix；oxLDL 購自廣州瑞千公司；Filipin 染色液、NAADP 拮抗劑NED-19 和Ca2+螯合劑BAPTA 購自Cayman；DiIoxLDL 購自Scintol；NAADP 購自AAT Bioquest；Nile red染色劑購自MedChemExpress；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒和DMSO 購自碧云天；HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG試劑購自Southern Biotech；環(huán)孢素A（cyclosporine A，CsA）購自InvivoChem；磷酸化TFEB（Ser211）抗體購自Affinity；NAADP ELISA 檢測試劑盒購自SAB Signalway。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)所用原代巨噬細(xì)胞按已發(fā)表的方法培養(yǎng)[12-13］。簡述如下：按無菌操作的要求取下小鼠股骨和脛骨，剪斷骨骼兩端。用注射器吸取RPMI-1640 培養(yǎng)基插入一側(cè)骨髓腔，沖出骨髓。再將骨髓輕柔吹打成細(xì)胞懸浮液，1 500 r/min 離心3 min，棄上清，用含10%胎牛血清、15% L-929 條件培養(yǎng)基的RPMI-1640 培養(yǎng)基（2%雙抗）10 mL 輕柔吹打成懸浮細(xì)胞并移至培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。7 d 后細(xì)胞分化完成，即可用于相應(yīng)實(shí)驗(yàn)。

2.2 NAADP 拮抗劑及Ca2＋螯合劑處理 在觀察NAADP 拮抗劑NED-19、Ca2＋螯合劑BAPTA 及鈣調(diào)磷酸酶抑制劑CsA 對NA 影響溶酶體膽固醇外流實(shí)驗(yàn)中，先加入NED-19、BAPTA或CsA，1 h后加入NA，再經(jīng)1 h 后加入oxLDL，48 h 后固定細(xì)胞，經(jīng)破膜、Lamp1 抗體標(biāo)記、filipin 和Nile red 染色等處理以進(jìn)行激光共聚焦成像檢測觀察。在觀察NA 對CD38 mRNA、CD38蛋白表達(dá)及磷酸化TFEB水平影響的實(shí)驗(yàn)中，按上述順序分別加入NED-19（或BAPTA 或CsA）、NA 和oxLDL， 24 h 后提取總RNA 進(jìn)行RT-qPCR 測CD38 mRNA 水平，48 h 后提取蛋白進(jìn)行Western blot測目的蛋白表達(dá)。

2.3 巨噬細(xì)胞溶酶體數(shù)量檢測 將巨噬細(xì)胞按每皿1.0×106個接種于35 mm 玻璃培養(yǎng)皿中，巨噬細(xì)胞溶酶體采用DiI-oxLDL 染色，溶酶體數(shù)量變化通過活細(xì)胞共聚焦掃描成像系統(tǒng)（Zeiss Axio Observer Z1，Carl Zeiss Microscopy）檢測。各種處理結(jié)束后將含細(xì)胞的玻璃培養(yǎng)皿置于熒光成像系統(tǒng)的細(xì)胞室中（37 ℃、 5% CO2），觀察時長設(shè)置為12 h， 掃描間隔2 h，細(xì)胞掃描分層（Z軸）為16層。

2.4 巨噬細(xì)胞內(nèi)NAADP 水平檢測 經(jīng)不同處理后，按照ELISA 檢測試劑盒的操作說明收集、裂解巨噬細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)NAADP 檢測。細(xì)胞裂解與Western blot 中細(xì)胞裂解操作相同，即用50 μL RIPA裂解并超聲后，經(jīng)1 500×g于4 ℃離心10 min 以移除細(xì)胞碎片，吸取上清進(jìn)行蛋白濃度測定并進(jìn)行NAADP 檢測。NAADP 實(shí)際水平用蛋白量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化定量。

2.5 巨噬細(xì)胞游離膽固醇及脂質(zhì)蓄積檢測 巨噬細(xì)胞游離膽固醇和中性脂質(zhì)（膽固醇酯）分別通過filipin 和Nile red 熒光染色劑染色；溶酶體采用溶酶體膜表面特征蛋白Lamp1 抗體免疫標(biāo)記；將誘導(dǎo)分化好的巨噬細(xì)胞按每室5×104個接種于8室細(xì)胞培養(yǎng)玻片中，經(jīng)不同處理后，按已報道的方法進(jìn)行固定、破膜、Lamp1 抗體標(biāo)記、filipin 染色[13］，之后細(xì)胞用Nile red孵育10 min，PBS洗1次后封片用于激光共聚焦檢測。激光共聚焦掃描拍照采用多光子激光掃描顯微鏡（Zeiss LSM 510，Carl Zeiss Microscopy），不同通道圖像采取依次掃描方式獲取以防止干擾，整個過程所有參數(shù)均保持一致。熒光成像的激發(fā)和發(fā)射波長參數(shù)分別為Alexa Fluor 633（ex 633 nm/em 650～710 nm）、filipin（ex 740 nm/em 435～485 nm）和Nile red（ex 514 nm/em535～590 nm）。熒光強(qiáng)度采用Image Pro 9.1軟件（Media Cybernetics）定量，其中filipin強(qiáng)度代表游離膽固醇的量，Nile red 強(qiáng)度代表中性脂質(zhì)的量。同時分析filipin 與Lamp1 間的共定位系數(shù)（Pearson's），以判定溶酶體中游離膽固醇的量。

2.6 CD38 蛋白表達(dá)及磷酸化TFEB 蛋白水平檢測 參照已有報道中的方法[14］，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)的Western blot 程序完成。Ⅰ抗及Ⅱ抗?jié)舛染鶠?∶500，Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，Ⅱ抗常溫孵育1 h。

2.7 CD38 mRNA 表達(dá)檢測 巨噬細(xì)胞經(jīng)NA、ox-LDL 處理24 h 后，提取總RNA 按已有報道中的方法進(jìn)行RT-qPCR，以檢測CD38的mRNA表達(dá)[12］。

2.8CD38siRNA 干擾及CD38基因回補(bǔ) 采用GenMute 轉(zhuǎn)染試劑盒，依照原報道中的方法進(jìn)行[12］。RNA 干擾效應(yīng)于轉(zhuǎn)染24 h 后經(jīng)RT-qPCR 驗(yàn)證。在CD38siRNA 干擾對細(xì)胞溶酶體再生及膽固醇蓄積影響實(shí)驗(yàn)中，于轉(zhuǎn)染scramble siRNA 和CD38 siRNA后24 h 加入NA 和oxLDL，48 h 后固定細(xì)胞，再經(jīng)破膜、Lamp1 抗體標(biāo)記、filipin 和Nile red 染色等處理以進(jìn)行激光共聚焦成像檢測觀察。在CD38基因回補(bǔ)對LDLr/CD38雙基因敲除（double knockout， DKO）巨噬細(xì)胞膽固醇外流的影響實(shí)驗(yàn)中，于轉(zhuǎn)染含CD38cDNA 質(zhì)粒（或vector） 24 h后加入NA 和oxLDL，再經(jīng)48 h 后固定細(xì)胞，經(jīng)破膜、Lamp1 抗體標(biāo)記、filipin 和Nile red 染色等處理以進(jìn)行激光共聚焦成像檢測觀察。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SigmaPlot 12.5 for Windows 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組間顯著性差異比較使用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)（Holm-Sidak 法）。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 NAADP促進(jìn)LDLr-/-巨噬細(xì)胞溶酶體數(shù)量增加

為探討CD38/NAADP 信號途徑是否可經(jīng)Ca2+/Cn/TFEB 促進(jìn)溶酶體再生，本研究首先觀察了NAADP對溶酶體數(shù)量的影響。

采用LDL 受體敲除（LDLr-/-）小鼠的骨髓源性巨噬細(xì)胞作為觀察對象，以更好地模擬高膽固醇的細(xì)胞環(huán)境。結(jié)果顯示，NAADP 可明顯促進(jìn)巨噬細(xì)胞中溶酶體數(shù)量的增加（溶酶體再生增強(qiáng)），這種效應(yīng)可被NAADP 拮抗劑NED-19、Ca2+螯合劑BAPTA 及Cn（Ca2+直接激活的下游分子）抑制劑CsA明顯抑制（P＜0.05）；有趣的是，溶酶體數(shù)量增加后，其分布范圍朝細(xì)胞邊緣明顯靠近（P＜0.05），見圖1。

Figure 1. NAADP increased lysosome number in LDLr-/- macrophages. Macrophages were incubated with oxLDL （40 mg/L） and DiIoxLDL （1 mg/L） for 48 h， followed by being chased for 24 h， then incubated with NAADP（100 nmol/L） with or without NAADP antagonist NED-19 （100 μmol/L）， calcium chelator BAPTA （5 μmol/L） or calcineurin inhibitor CsA （5 μmol/L）and proceeded to live cell confocal microscopic scanning （duration 12 h， interval 2 h）. A： real-time （living cell） confocal microscopic images of DiI-oxLDL staining； B： summarized lysosome number calculated with Image-Pro Premier software；C： percentage of lysosome closer to cell edge analyzed with Image-Pro Premier software. Mean±SD. n=6. *P＜0.05 vs control group.圖1 NAADP增加LDLr-/-巨噬細(xì)胞溶酶體數(shù)量

2 CD38促進(jìn)LDLr-/-巨噬細(xì)胞中NAADP的合成

為明確CD38 和NA 在LDLr-/-巨噬細(xì)胞NAADP合成中的作用，我們檢測了NA 對細(xì)胞內(nèi)NAADP 水平的影響；同時將LDLr-/-小鼠的CD38基因敲除，以確定CD38 對NAADP 合成的作用。結(jié)果顯示：加入NAADP合成底物NA后，經(jīng)oxLDL處理LDLr-/-巨噬細(xì)胞中的NAADP 水平顯著升高（P＜0.05）；該現(xiàn)象在CD38基因敲除LDLr-/-巨噬細(xì)胞中消除（P＜0.05），見圖2。

Figure 2. CD38 catalyzed NAADP synthesis in LDLr-/- macrophages. A： intracellular NAADP levels of LDLr-/- macrophages treated with oxLDL， NA and CD38 inhibitor nicotinamide （Nic， 6 mmol/L）； B： NA-induced changes of NAADP level in LDLr-/-macrophages with or without CD38 gene. DKO： double knockout. Mean±SD. n=6 in A； n=4 in B. *P＜0.05 vs control group； #P＜0.05 vsNA+oxLDL group； △P＜0.05 vs LDLr-/- macrophage group； ▲P＜0.05 vsoxLDL （LDLr-/-） group.圖2 CD38促進(jìn)LDLr-/-巨噬細(xì)胞NAADP合成

3 NA促進(jìn)CD38 mRNA和蛋白表達(dá)

為探討NA 與CD38之間是否存在相互作用的關(guān)系，我們觀察了NA 對CD38 mRNA 和蛋白表達(dá)的影響。為了排除不同基因背景下CD38表達(dá)的異同，我們同時觀察了NA對野生型（wild type， WT）和LDLr-/-小鼠巨噬細(xì)胞CD38表達(dá)的調(diào)節(jié)。結(jié)果顯示，不論是在WT 還是在LDLr-/-巨噬細(xì)胞中，NA 均可促進(jìn)CD38的mRNA 和蛋白表達(dá)，尤其對LDLr-/-巨噬細(xì)胞的作 用更明顯（P＜0.05），見圖3。

Figure 3. NA promoted CD38 expression in macrophages. Total RNA and protein were extracted 24 and 48 h， respectively， from macrophages loaded with oxLDL （40 mg/L） in the presence of niacin （NA， 5 mmol/L） for CD38 expression assay. A：summarized CD38 mRNA levels by RT-qPCR； B： representative Western blot images of CD38 bands （top） and summarized intensity （bottom）. The intensity was normalized to control. Mean±SD. n=5. *P＜0.05 vs control group； △P＜0.05 vs oxLDL（wild type） group； #P＜0.05 vs oxLDL （LDLr-/-） group.圖3 NA促進(jìn)巨噬細(xì)胞CD38的表達(dá)

4 NA 經(jīng)CD38/NAADP 途徑降低TFEB 的磷酸化水平

如圖4 所示，NA 可顯著降低TFEB 的磷酸化水平（即促進(jìn)TFEB 去磷酸化），而NAADP 拮抗劑NED-19、Ca2+螯合劑BAPTA 及Cn 抑制劑CsA 則明顯抑制NA 的這一效應(yīng)（P＜0.05）。提示NA 可能通過CD38/NAADP途徑激活Ca2+/Cn/TFEB 信號通路而促進(jìn)溶酶體再生。

Figure 4. NA reduced phosphorylated TFEB （p-TFEB） in macrophages. Total protein was extracted from LDLr-/- macrophages incubated with oxLDL （40 mg/L） in the presence of NA （5 mmol/L） with NAADP antagonist NED-19 （100 μmol/L）， Ca2+ chelator BAPTA （5 μmol/L） or calcineurin inhibitor CsA （5 μmol/L） for 48 h. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs oxLDL group； #P＜0.05 vs NA+oxLDL group.圖4 NA降低巨噬細(xì)胞TFEB的磷酸化水平

5 阻斷CD38/NAADP 信號途徑可抑制NA 誘導(dǎo)的溶酶體數(shù)量增加和膽固醇外流

結(jié)果如圖5 所示：NA 可顯著增加巨噬細(xì)胞的溶酶體數(shù)量（溶酶體數(shù)量增加且向細(xì)胞邊緣靠近）、減少溶酶體中游離膽固醇（藍(lán)色強(qiáng)度及其與紅色重合部分）和胞質(zhì)中脂滴（黃染部分，主要成分為膽固醇酯）的蓄積（P＜0.05）；NAADP 拮抗劑NED-19、Ca2+螯合劑BAPTA 和CD38敲減均可明顯減弱NA 的上述效應(yīng)（P＜0.05）。

6 CD38 回補(bǔ)對LDLr/CD38 雙基因敲除巨噬細(xì)胞溶酶體數(shù)量及膽固醇外流的影響

為進(jìn)一步明確CD38/NAADP 對巨噬細(xì)胞溶酶體再生和膽固醇調(diào)節(jié)的影響，我們將LDLr-/-小鼠和CD38基因敲除（CD38-/-）小鼠雜交，篩選出子代中LDLr/CD38DKO 小鼠，以其骨髓為細(xì)胞源培養(yǎng)LDLr/CD38DKO巨噬細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)；并利用基因回補(bǔ)技術(shù)將CD38 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染該細(xì)胞，以明確CD38/NAADP 信號通路在巨噬細(xì)胞溶酶體再生和膽固醇調(diào)節(jié)中作用。

結(jié)果顯示：NAADP 可明顯增加LDLr/CD38DKO巨噬細(xì)胞中溶酶體數(shù)量（P＜0.05）、減少溶酶體中游離膽固醇和胞質(zhì)中膽固醇酯的蓄積（即促進(jìn)溶酶體和胞質(zhì)中膽固醇外流，P＜0.05）；NA 對LDLr/CD38DKO 巨噬細(xì)胞中溶酶體數(shù)量及膽固醇的蓄積無明顯影響，進(jìn)行CD38基因回補(bǔ)后，NA 促進(jìn)溶酶體數(shù)量增加和抑制膽固醇蓄積的效應(yīng)才明顯地顯示出來（P＜0.05），見圖6。

Figure 6. Effect of CD38 rescue on lysosome number and cholesterol egression in LDLr/CD38 DKO macrophages. The macrophages were incubated with oxLDL at 40 mg/L in the presence of NAADP （100 nmol/L） for 48 h and labelled with filipin （free cholesterol， blue）， Lamp1 antibody （lysosomes， red）， and Nile red （lipid droplets of cholesterol ester， yellow）. For plasmid transfection， the macrophages were transfected with 1.33 mg/L of vector （negative control） or CD38 plasmid， and 24 h after transfection， the macrophages were incubated with 40 mg/L of oxLDL in the presence of NA（5 mmol/L） for 48 h. A：confocal fluorescence images of filipin， Lamp1 antibody and Nile red staining； B： lysosome number calculated with Image-Pro Premier software； C： summarized intensity free cholesterol （FC） stained by filipin； D： colocalization coefficient between filipin and Lamp1 （lysosome）； E： intensity analysis of Nile red-stained lipid droplets（cholesterol ester）. lm： lumen. Mean±SD. n=6. *P＜0.05 vs control group； #P＜0.05 vs oxLDL group； △P＜0.05 vsvector+NA+oxLDL group.圖6 CD38回補(bǔ)對LDLr/CD38雙基因敲除巨噬細(xì)胞溶酶體數(shù)量及膽固醇外流的影響

討 論

巨噬細(xì)胞的溶酶體在RCT 途徑中發(fā)揮著重要的作用[15-16］。溶酶體的功能異常可影響膽固醇的代謝和排出，進(jìn)而促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)生[15，17］。同理，若溶酶體的數(shù)量減少也可導(dǎo)致類似的病理過程。

脂噬有助于防止巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞的轉(zhuǎn)變[18-20］，抑制脂噬則促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成[21］。但脂噬的過程伴隨有溶酶體數(shù)量的減少，需通過自噬性溶酶體再生的機(jī)制維持溶酶體數(shù)量的動態(tài)平衡[4］。因此，對溶酶體再生機(jī)制的闡明，將有助于探索抑制泡沫細(xì)胞形成的新途徑，進(jìn)而為動脈粥樣硬化的干預(yù)提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

在自噬性溶酶體再生中，mTOR為關(guān)鍵的信號中樞[4，22-23］。經(jīng)溶酶體TRPML1 鈣通道釋放的Ca2+，通過Cn/TFEB 信號途徑介導(dǎo)，激活mTOR 而促進(jìn)溶酶體再生[5-8］。本研究進(jìn)一步觀察了CD38/NAADP信號通路對巨噬細(xì)胞溶酶體再生及膽固醇調(diào)節(jié)的影響，以期為探尋溶酶體再生的觸發(fā)機(jī)制及其效應(yīng)提供新的實(shí)驗(yàn)支持。

本研究發(fā)現(xiàn)，NAADP 可顯著增加巨噬細(xì)胞中溶酶體的數(shù)量，提示其可能具有促進(jìn)溶酶體再生的作用，且阻斷Ca2+/Cn信號通路則抑制NAADP的上述效應(yīng)，表明NAADP 的效應(yīng)可能是通過激活TRPML1 而釋放Ca2+，后者再激活Cn而發(fā)揮溶酶體再生的作用。

NAADP 作為細(xì)胞內(nèi)第二信使，可由一關(guān)鍵酶CD38 催化NADP＋與NA 的煙酰胺基團(tuán)交換產(chǎn)生[10］。與此相一致，本研究也觀察到NA 可使LDLr-/-巨噬細(xì)胞中的NAADP 水平顯著升高，當(dāng)CD38基因敲除后，NA 的這種效應(yīng)基本消失。這一結(jié)果進(jìn)一步明確了CD38 在NA 促進(jìn)NAADP 生成中作用，同時也提示，NA有可能成為促進(jìn)溶酶體再生的潛在藥物。

為進(jìn)一步闡明NA 的作用機(jī)制，本研究觀察了NA 對CD38 mRNA 和蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，NA 可促進(jìn)WT 和LDLr-/-巨噬細(xì)胞CD38 的mRNA 和蛋白表達(dá)，尤其對LDLr-/-巨噬細(xì)胞的作用更明顯。提示NA 不僅作為反應(yīng)底物促進(jìn)NAADP 的合成，還可通過酶誘導(dǎo)作用，促進(jìn)CD38的表達(dá)而增強(qiáng)其催化效應(yīng)。至于NA 對促進(jìn)LDLr-/-巨噬細(xì)胞CD38 表達(dá)的作用為何更明顯，仍有待進(jìn)一步深入探討，可能與LDLr基因敲除小鼠體內(nèi)存在較高水平的LDL，后者通過某種機(jī)制促進(jìn)了CD38的表達(dá)有關(guān)。

如前所述，在自噬性溶酶體再生的過程中，Ca2+/Cn/TFEB 信號途徑起著始動性的作用[5-8］。本研究的結(jié)果顯示，NA 可顯著促進(jìn)TFEB 去磷酸化，且阻斷NAADP/Ca2+/Cn 信號分子則明顯抑制NA 的這一效應(yīng)。從而表明NA 可能通過CD38/NAADP 途徑激活Ca2+/Cn/TFEB信號通路而促進(jìn)溶酶體再生。

巨噬細(xì)胞溶酶體再生對維持溶酶體數(shù)量的穩(wěn)態(tài)、促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)和減少泡沫細(xì)胞的形成至關(guān)重要[24］。本研究觀察到，NA 不僅可增加巨噬細(xì)胞的溶酶體數(shù)量，還可減少溶酶體中游離膽固醇和胞質(zhì)中膽固醇酯（脂滴）的蓄積；阻斷CD38/NAADP 信號通路后，NA 的上述效應(yīng)明顯減弱。說明CD38/NAADP 信號通路與溶酶體再生的始動環(huán)節(jié)密切相關(guān)，激活CD38/NAADP 信號通路既可促進(jìn)溶酶體再生，也有利于巨噬細(xì)胞中對膽固醇的調(diào)節(jié)，從而有助于減少泡沫細(xì)胞的發(fā)生。而CD38 基因回補(bǔ)的結(jié)果則進(jìn)一步證實(shí)了CD38/NAADP 信號通路在促進(jìn)巨噬細(xì)胞溶酶體再生和抑制膽固醇蓄積中的作用。

自噬性溶酶體再生過程往往需要一定的誘發(fā)因素，如饑餓、缺氧或化學(xué)試劑的誘導(dǎo)[25-26］，實(shí)驗(yàn)中常用饑餓作為誘發(fā)自噬的手段[27］。如能避開饑餓等手段，直接通過某種藥物或信號分子干預(yù)巨噬細(xì)胞自噬性溶酶體再生的信號通路，則有可能影響溶酶體的再生甚至調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞細(xì)胞對脂質(zhì)的代謝。而本研究結(jié)果表明，不必采取饑餓的手段，NA 即可經(jīng)CD38/NAADP 信號通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞溶酶體再生，進(jìn)而對巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)調(diào)節(jié)產(chǎn)生有利影響。這為日后動脈粥樣硬化的預(yù)防和治療提供了新的思路。

本研究觀察到CD38/NAADP 信號通路經(jīng)TFEB介導(dǎo)，參與了巨噬細(xì)胞溶酶體的再生過程，但目前只是對該過程中Ca2+/Cn/TFEB 信號途徑的觸發(fā)機(jī)制進(jìn)行了探討，今后應(yīng)針對如何提高NA 對CD38/NAADP的作用效應(yīng)及其對TFEB 的下游信號通路的影響進(jìn)行更加深入的觀察，以期為促進(jìn)溶酶體再生進(jìn)而抑制泡沫細(xì)胞的形成提供更多的實(shí)驗(yàn)支持。

綜上所述，CD38 可經(jīng)TFEB 介導(dǎo)，觸發(fā)巨噬細(xì)胞溶酶體再生，進(jìn)而促進(jìn)巨噬細(xì)胞溶酶體游離膽固醇和胞質(zhì)中膽固醇酯的外流。