脂多糖誘導(dǎo)年輕小鼠骨髓及脾臟造血干細(xì)胞衰老表型的作用研究*

白 可， 鄒 密， 詹 薔， 黃穎欣， 鞠振宇， 陳陟陽(yáng)

（暨南大學(xué)教育部再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，衰老與再生醫(yī)學(xué)研究院，生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510632）

造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells， HSCs）具有自我更新及多潛能分化能力，可以產(chǎn)生所有成熟的血液細(xì)胞，對(duì)整個(gè)生命時(shí)長(zhǎng)的造血系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)維持起到重要作用[1］。在下游成熟細(xì)胞減少的缺血應(yīng)激壓力條件下，為滿足機(jī)體對(duì)成熟血液細(xì)胞的需求，造血干細(xì)胞進(jìn)行應(yīng)激造血以維持血液系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)平衡[2］。脾臟作為髓外重要的造血器官，脾臟介導(dǎo)的骨髓外造血對(duì)緩解應(yīng)激造血具有重要作用[3-4］。炎癥刺激導(dǎo)致血液和免疫系統(tǒng)出現(xiàn)一系列的反應(yīng)，固有免疫和適應(yīng)性免疫的先后激活促進(jìn)炎癥的消除，同時(shí)伴隨著大量成熟血液細(xì)胞的損失，造血干細(xì)胞隨即啟動(dòng)應(yīng)激造血以滿足機(jī)體的需求[5-6］。有研究報(bào)道，造血干細(xì)胞表達(dá)多種炎癥因子受體，提示除了被動(dòng)響應(yīng)下游成熟血液細(xì)胞損失的負(fù)反饋調(diào)控以外，造血干細(xì)胞可以直接對(duì)炎癥進(jìn)行反應(yīng)應(yīng)答[7-8］。慢性炎癥累積是衰老的重要特征，造血干細(xì)胞應(yīng)對(duì)炎癥的應(yīng)答及炎癥對(duì)造血干細(xì)胞衰老的影響有待進(jìn)一步研究。LPS 作為一種常見(jiàn)的細(xì)菌內(nèi)毒素，具有易于使用，模型重現(xiàn)性好，反應(yīng)機(jī)制明確的特點(diǎn)，因此被作為構(gòu)建炎癥模型的金標(biāo)準(zhǔn)試劑[9］。本研究應(yīng)用LPS誘導(dǎo)的急性炎癥小鼠模型，旨在探究急性炎癥刺激對(duì)骨髓及脾臟中造血干/祖細(xì)胞的影響。并初步探索了LPS 誘導(dǎo)的急性炎癥反應(yīng)與造血干/祖細(xì)胞衰老之間的關(guān)系，以期為拓寬靶向干預(yù)炎癥信號(hào)延緩衰老的策略提供參考。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

年輕小鼠以及年老小鼠由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2021-0006，引進(jìn)并飼養(yǎng)繁殖于暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)屏障環(huán)境SYXK（粵）2017-0174，雌雄及數(shù)量不限，2～24 月齡，所有小鼠均為C57BL/6J 品系。本實(shí)驗(yàn)已獲得暨南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并嚴(yán)格按照動(dòng)物使用原則執(zhí)行。

2 主要儀器和試劑

流式細(xì)胞分析儀（BD，F(xiàn)ortessa）；流式細(xì)胞分選儀（BD，Aria III）。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相關(guān)抗體： Biotin-Gr1（13-5931-86），Biotin-CD11b（101204），Biotin-B220（103204），Biotin-CD4（100508），Biotin-CD8（100704），F(xiàn)ITC-CD4（100510），F(xiàn)ITC-CD8（100706），F(xiàn)ITC-B220（48-0452-82），APC-Cy7-CD11b（A15390），PE-Cy7-Sca-1（122514），PE-CD150（115927），APC-c-Kit（17-1171-83），APC-Cy7-SA（405208），PE-CD45（11-0459-42），F(xiàn)ITC-Ki67（11-5698-82）購(gòu)自Thermo Fisher； BV510-CD48 （563536） ， BV605-CD150（567309） 購(gòu)自BD Biosciences；脂多糖（PA173178）購(gòu)自Thermo Fisher；紅細(xì)胞裂解液（555899）購(gòu)自BD Pharmingen；胎牛血清（FSP500）購(gòu)自ExCellbio；DAPI（D9542-10MG）購(gòu)自Sigma；BD Cytofix/Cytoperm buffer （554714）購(gòu)自BD Biosciences。

3 主要方法

3.1 小鼠體內(nèi)急性炎癥模型的建立 參考前期發(fā)表的文章[10］，腹腔注射LPS 進(jìn)行建模，LPS 注射劑量為1.5 mg/kg。對(duì)照組腹腔注射等體積的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）。建模成功后的小鼠分為PBS 對(duì)照組、LPS 刺激3 h、6 h、16 h、24 h、96 h、168 h組，共七組，每組3～5只。

3.2 小鼠骨髓中造血干/祖細(xì)胞（hematopoietic stem/progenitor cells， HSCPs）分析參考已發(fā)表的文章[11-12］，小鼠頸椎脫臼犧牲，取小鼠小腿骨、大腿骨、髂骨及脊柱，使用研杵擠壓骨頭釋放骨髓細(xì)胞。按照1×108/mL 的細(xì)胞密度使用染色緩沖液（1×PBS+2%胎牛血清）重懸細(xì)胞，從中取1×107全骨髓細(xì)胞置于U 型底96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。每孔加入10 μL Lin抗體混合物[生物素標(biāo)記的lineage 細(xì)胞抗體組合，生物素（biotin）分別與CD4、CD8、B220、Ter119、CD11b和Gr1 偶聯(lián)的抗體用于標(biāo)記HSPCs］，冰上避光孵育30 min。每孔加200 μL 染色緩沖液后離心（288×g、4 ℃離心5 min），棄上清，30 μL 染色緩沖液重懸細(xì)胞。按照表1 進(jìn)行其他表面標(biāo)記抗體染色，冰上避光孵育30 min。用300 μL染色緩沖液重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至流式管中，使用流式細(xì)胞分析儀（BD Fortessa）分析。上機(jī)前加入0.3 μL 1 g/L 濃度的DAPI 進(jìn)行染色，使用FlowJo 10軟件處理流式細(xì)胞數(shù)據(jù)。

表1 骨髓細(xì)胞及脾臟細(xì)胞HSPC流式染色方案Table 1. Flow cytometry staining protocol for bone marrow and splenic HSPCs

3.3 小鼠脾臟中造血干/祖細(xì)胞分析 小鼠頸椎脫臼犧牲后，取出小鼠脾臟置于PBS 中。使用5 mL 注射器的推針器尾部（平底部分）研磨脾臟，按照1×108mL 的細(xì)胞密度使用染色緩沖液重懸細(xì)胞，從中取1×107脾臟單細(xì)胞懸液置于U 型底96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。每孔加入10 μL Lin 抗體混合物，冰上避光孵育30 min。染色緩沖液洗去抗體后，按照表1進(jìn)行其他表面標(biāo)記抗體染色，冰上避光孵育30 min。每孔加200 μL 染色緩沖液后離心（288×g、4 ℃離心5 min），棄上清；使用400 μL染色緩沖液重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至流式管中，使用流式細(xì)胞分析儀（BD Fortessa）分析。上機(jī)前加入0.4 μL 1 g/L 濃度的DAPI 進(jìn)行染色，使用FlowJo 10軟件處理流式細(xì)胞數(shù)據(jù)。

3.4 小鼠外周血和脾臟中各類成熟細(xì)胞的分析對(duì)小鼠進(jìn)行深度麻醉后，使用取血針通過(guò)眼眶后靜脈叢采集小鼠全血（每只20 μL）。使用U 型底96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行抗體染色。參照表2 每孔加入30 μL抗體混合物，與20 μL全血樣本充分混合后，冰上避光孵育30 min。每孔加入200 μL 1×裂紅緩沖液重懸細(xì)胞，在室溫下避光放置5～10 min 完成裂紅處理。200 μL 染色緩沖液重懸細(xì)胞后轉(zhuǎn)移到流式管中，使用流式細(xì)胞分析儀（BD Fortessa）進(jìn)行分析；對(duì)于小鼠脾臟中各類成熟細(xì)胞的分析，參考3.3 制備小鼠脾臟細(xì)胞懸液。取1×107脾臟細(xì)胞進(jìn)行抗體染色，參照表2每孔加入30 μL抗體混合物，在4 ℃避光條件下孵育30 min。每孔加入200 μL 1×裂紅緩沖液重懸細(xì)胞，在室溫避光下放置5～10 min 完成裂紅處理。200 μL染色緩沖液重懸細(xì)胞后轉(zhuǎn)移到流式管中，使用流式細(xì)胞分析儀（BD Fortessa）進(jìn)行分析。

表2 外周血和脾臟成熟細(xì)胞流式染色方案Table 2. Flow cytometry staining protocol for peripheral blood and splenic mature cells

3.5 細(xì)胞周期分析 參考方法3.2，使用針對(duì) Sca-1、c-Kit、Lin/SA 的流式抗體對(duì)全骨髓以及脾臟細(xì)胞進(jìn)行染色，以標(biāo)記HSPCs（Lin-Sca1+c-Kit+， LSK）。抗體標(biāo)記后的細(xì)胞使用BD Cytofix/Cytoperm buffer 進(jìn)行固定，0.4% Triton X-100 破膜。將固定破膜后的細(xì)胞與FITC-Ki67 抗體混合后冰上孵育1.5 h；加入1 μL 1 g/L 濃 度 的DAPI 冰 上 孵 育30 min 后 上 機(jī) 分析，使用流式細(xì)胞儀（BD Fortessa）分析。

3.6 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析 基于GSE100425[13］數(shù)據(jù)集：篩選數(shù)據(jù)集中同時(shí)滿足|log2（fold change）|≥2 和P＜0.01 的基因，分別作為相應(yīng)處理的差異基因。利用clusterProfiler 對(duì)表達(dá)變化趨勢(shì)相同的差異基因進(jìn)行GSEA富集分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用GraphPad Prism 9.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均為至少3 次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間比較采用Student'st檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 LPS 誘導(dǎo)骨髓中的造血干細(xì)胞數(shù)量增多及外周血和脾臟出現(xiàn)髓系分化偏向

構(gòu)建LPS 誘導(dǎo)的急性炎癥小鼠模型，對(duì)年輕小鼠進(jìn)行腹腔注射LPS （1.5 mg/kg）處理（圖1A），不同時(shí)間點(diǎn)取小鼠骨髓進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)（圖1B）。與對(duì)照組小鼠相比，骨髓中LSK 的百分率在LPS 刺激16 h 顯著升高（P＜0.01），見(jiàn)圖1C。進(jìn)一步對(duì)外周血和脾臟中B細(xì)胞、T細(xì)胞和髓系細(xì)胞（CD11b+）進(jìn)行分析，結(jié)果可見(jiàn)，與PBS對(duì)照組相比，LPS刺激24 h小鼠外周血中B 細(xì)胞和T 細(xì)胞百分率顯著下降（P＜0.01），但髓系細(xì)胞顯著上升（P＜0.01），且小鼠脾臟中髓系細(xì)胞數(shù)目增多（P＜0.05），見(jiàn)圖1D、E。

Figure 1. LPS stimulation resulted in an elevated percentage of HSPCs in bone marrow （BM） and a shift towards myeloid cell production in peripheral blood （PB） and spleen. A. experimental scheme of LPS-induced acute inflammation model in mice.Young （2-month-old） WT mice were injected with LPS （1.5 mg/kg） or PBS. B and C： the percentage of HSPCs （Lin-Sca1+ c-Kit+ cells， LSKs） in BM. The ratio of mature cells in PB and the number of mature cells in spleen were analyzed by FACS. Representative FACS files （B） and histograms （C） showing the percentage of LSKs in BM at the indicated time points post LPS treatment. D： the percentage of B cells （B220+）， T cells （CD4+ CD8+） and myeloid cells （CD11b+） in PB of young（2-month-old） WT mice with or without LPS treatment. E： the number of B cells， T cells and myeloid cells in spleen was analyzed by FACS. Mean±SD. n=3～11. *P＜0.05， ** P＜0.01 vs PBS group.圖1 LPS誘導(dǎo)骨髓造血干/祖細(xì)胞及外周血和脾臟髓系細(xì)胞增多

2 LPS對(duì)小鼠脾臟髓外造血的影響

與PBS 組相比，LPS 刺激24 h 小鼠脾臟變大（圖2A）。稱重及細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果顯示，LPS 組小鼠脾臟重量顯著增多（P＜0.01），脾臟細(xì)胞數(shù)目增多（P＜0.05），見(jiàn)圖2B、C。對(duì)年輕小鼠進(jìn)行腹腔注射LPS（1.5 mg/kg）之后，在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)脾臟中造血干/祖細(xì)胞的百分率。結(jié)果顯示，與PBS 對(duì)照組相比，LPS 刺激誘導(dǎo)小鼠脾臟中LSK 的百分率升高（P＜0.05），見(jiàn)圖2D。

Figure 2. LPS induced extramedullary hematopoiesis in spleen of young mice. A： picture showed the size of spleen from mice after LPS （right， 1.5 mg/kg） or PBS （left） injections； B： weight of spleens； C： the bar graph showed the number of spleen cells； D： representative FACS files and histogram showing the percentage of HSPCs （Lin- Sca1+ c-Kit+ cells， LSKs） in spleen at the indicated time points after LPS exposure （1.5 mg/kg）. Mean±SD. n=3～11. *P＜0.05， **P＜0.01 vs PBS group.圖2 LPS刺激促進(jìn)小鼠脾臟髓外造血

3 LPS對(duì)骨髓和脾臟中造血干/祖細(xì)胞增殖的影響

細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示，在穩(wěn)態(tài)下，年輕小鼠骨髓和脾臟中的LSK 絕大多數(shù)處于G0和G1期；我們對(duì)脾臟中LSK 的增殖情況進(jìn)行分析，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，穩(wěn)態(tài)下，脾臟中的LSK 多處于G1期；與PBS 對(duì)照組相比，LPS 刺激促進(jìn)脾臟中LSK 的增殖（P＜0.05），見(jiàn)圖3A。同時(shí)，與PBS 對(duì)照組相比，LPS 刺激6 h和24 h，骨髓中處于S-G2-M 期的LSK 百分率顯著升高（P＜0.01），與之對(duì)應(yīng)，處于G0 期的LSK 百分率顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)圖3B。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)脾臟中LSK 的CD45 蛋白表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，與PBS 對(duì)照組相比，LPS 刺激24 h 后CD45 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01），見(jiàn)圖3C。

Figure 3. LPS promoted proliferation of HSPCs in the BM and spleen. A： representative FACS files and bar graphs showing the cell cycle status of HSPCs （Lin- Sca1+ c-Kit+ cells， LSKs） in spleen； B： representative FACS files and bar graphs showing the cell cycle status of LSKs in BM； C： representative FACS files and bar graphs showing the percentage of CD45high and CD45low LSKs in spleen. Mean±SD. n=4. *P＜0.05， **P＜0.01 vs PBS group.圖3 LPS刺激促進(jìn)骨髓和脾臟造血干/祖細(xì)胞增殖

4 衰老對(duì)小鼠脾臟髓外造血的影響

與年輕小鼠相比，24 月齡的年老小鼠脾臟變大（圖4A）。稱重及細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果顯示，與年輕小鼠相比，老年小鼠的脾臟重量顯著升高（P＜0.05），脾臟細(xì)胞數(shù)目無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)圖4B、C。對(duì)2 月齡的年輕小鼠與24 月齡的年老小鼠脾臟中造血干/祖細(xì)胞的分析顯示，與2 月齡年輕小鼠相比，24 月齡的年老小鼠脾臟中的LSK 和HSC（CD48-CD150+LSK）的百分率顯著升高（P＜0.01），見(jiàn)圖4D。

Figure 4. Old mice exhibited extramedullary hematopoiesis in spleen. A： picture shows the size of spleens from young（upper） and old （lower） mice； B： the weight of spleen in young and old mice； C： the total number of cells in spleens from young and old mice； D： representative FACS files and bar graphs showing the percentage of HSPCs in spleen from young and old mice. Mean±SD. n=3～14. #P＜0.05， ## P＜0.01 vs yong group.圖4 衰老促進(jìn)小鼠脾臟髓外造血

5 衰老促進(jìn)骨髓中造血干/祖細(xì)胞比例升高及外周血和脾臟出現(xiàn)髓系偏向

使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)2 月齡的年輕小鼠與不同年齡（10月齡、18月齡、24月齡）年老小鼠骨髓中LSK和HSC 的百分率。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示與年輕小鼠相比，年老小鼠骨髓中LSK 和HSC 的百分率顯著升高（P＜0.01），見(jiàn)圖5A。進(jìn)一步針對(duì)外周血及脾臟的流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，與年輕小鼠相比，年老小鼠外周血中的B 細(xì)胞百分率顯著降低（P＜0.01），髓系細(xì)胞百分率顯著升高（P＜0.01）；年老小鼠脾臟中的B 細(xì)胞百分率顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)圖5B。

Figure 5. Old mice exhibited increased percentage of HSPCs in BM and a shift in myeloid cell production in PB and spleen. A： representative FACS files and bar graph showing the percentage of HSPCs （Lin- Sca1+ c-Kit+ cells， LSKs） and HSCs（CD48- CD150+ LSKs） in BM from young and old mice； B： representative FACS files and bar graphs showing the percentage of B cells （B220+）， T cells （CD4+ CD8+） and myeloid cells （CD11b+） in PB and spleen from young （2-month-old）and old （24-month-old） WT mice. Mean±SD. n=3～7. ##P＜0.01 vs young group.圖5 衰老促進(jìn)骨髓造血干/祖細(xì)胞及外周血和脾臟髓系細(xì)胞增多

6 LPS處理誘導(dǎo)造血干細(xì)胞炎癥、ROS和凋亡信號(hào)激活

為了探究炎癥誘導(dǎo)造血干細(xì)胞功能損傷的潛在調(diào)控機(jī)制，我們重新分析了GSE100425[13］數(shù)據(jù)集中TLR4 和TLR2 炎癥受體激活劑LPS 和Pam3CSK4（Pam3）體內(nèi)刺激后12 h小鼠造血干細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組變化。針對(duì)炎癥刺激誘導(dǎo)的差異基因進(jìn)行GSEA分析。分析結(jié)果顯示，IL-6、TNF-α、INF-γ、TGF-β 及IL-2/STAT5等炎癥信號(hào)通路被激活（圖6A），此外，刺激導(dǎo)致氧化應(yīng)激及凋亡通路富集（圖6B）。

Figure 6. LPS induced activation of inflammatory， ROS and apoptosis signaling in HSCs. A： dot plot showing the up-regulated pathways in HSCs of mice 12 h after LPS and Pam3 treatment； B： gene set enrichment analysis （GSEA） showed that the genes involved in apoptosis pathway were enriched in HSCs of mice 12 h after LPS and Pam3 treatment.圖6 LPS誘導(dǎo)造血干細(xì)胞炎癥、ROS和凋亡信號(hào)通路激活

討 論

慢性炎癥累積會(huì)導(dǎo)致干細(xì)胞衰老，進(jìn)而影響多種組織器官的長(zhǎng)期穩(wěn)態(tài)維持。炎癥刺激導(dǎo)致造血干細(xì)胞功能受損，損害移植后造血重建能力及誘導(dǎo)髓系偏向分化[14-16］。多數(shù)研究以連續(xù)炎癥刺激作為切入點(diǎn)研究炎癥累積對(duì)造血干細(xì)胞功能及衰老的影響[8］，而急性炎癥刺激對(duì)造血干/祖細(xì)胞的影響仍有待進(jìn)一步探索。在本研究中，我們應(yīng)用LPS 刺激模擬細(xì)菌炎癥構(gòu)建急性炎癥小鼠模型，開(kāi)展了針對(duì)小鼠造血干/祖細(xì)胞應(yīng)對(duì)炎癥刺激后動(dòng)態(tài)變化的研究。我們的研究顯示，炎癥刺激后短時(shí)間內(nèi)，骨髓造血干/祖細(xì)胞展現(xiàn)出迅速的增殖，提示骨髓造血干細(xì)胞在第一時(shí)間響應(yīng)LPS刺激。伴隨著LPS刺激，骨髓造血干細(xì)胞向脾臟遷移進(jìn)而促進(jìn)髓外造血，提示骨髓和脾臟在應(yīng)對(duì)炎癥時(shí)協(xié)同調(diào)控應(yīng)激造血。有研究提示，炎癥是潛在推動(dòng)造血干細(xì)胞衰老相關(guān)功能失調(diào)的關(guān)鍵因素[17］。本研究中，LPS誘導(dǎo)的急性炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的骨髓造血干/祖細(xì)胞增殖、外周成熟細(xì)胞髓系分化偏向以及脾臟中的髓外造血等現(xiàn)象與小鼠造血衰老表型非常相似，提示衰老過(guò)程中的炎癥累積導(dǎo)致造血系統(tǒng)功能異常。明確炎癥調(diào)控造血干細(xì)胞功能的具體機(jī)制，將為緩解造血干細(xì)胞衰老及治療衰老相關(guān)血液學(xué)疾病提供重要的干預(yù)靶點(diǎn)。