類視黃醇X受體對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的大鼠II型肺泡上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控作用*

王肖婷， 徐俊鵬▲， 黃 曼， 陳思安， 張淇昊， 曹文傑，田云娜， 高 慧， 王萬鐵△

（1溫州醫(yī)科大學(xué)缺血/再灌注損傷研究所，浙江 溫州 325035；2河南大學(xué)附屬淮河醫(yī)院病理科，河南 開封 475000）

肺原發(fā)性移植物功能障礙是一種嚴(yán)重的急性肺損傷，導(dǎo)致肺移植后早期發(fā)病率和死亡率增加，其發(fā)病機(jī)制主要是肺缺血再灌注損傷（lung ischemia-reperfusion injury， LIRI）[1］。臨床上大量肺移植、心肺復(fù)蘇等手術(shù)應(yīng)用的同時，也大大提高了LIRI 的發(fā)生率，由于目前臨床上尚無有效的防治措施，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后康復(fù)甚至威脅生命。

LIRI的病理生理機(jī)制復(fù)雜，一個特定器官由于缺血引起的組織損傷往往會在再灌注時進(jìn)一步加劇，這一過程比缺血本身更加有害。這一過程需要有氧的存在、血管、體液以及細(xì)胞因子的激活和維持[1］，機(jī)體在各種有害刺激下，發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生并聚集大量活性氧（reactive oxygen species， ROS），引發(fā)一系列細(xì)胞和組織病理性反應(yīng)。當(dāng)機(jī)體遭受不良刺激時，ROS 可在II 型肺泡上皮細(xì)胞（type II alveolar epithelial cells， AECII）、內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞等肺組織細(xì)胞中的積聚，通過核因子κB（nuclear factorκB， NF-κB）等轉(zhuǎn)錄因子激活炎癥過程，引起染色質(zhì)重塑和促炎癥介質(zhì)基因的表達(dá)，從而加劇氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起肺組織損傷[2-3］。

類視黃醇X 受體（retinoid X receptor， RXR）是繼視黃酸受體之后發(fā)現(xiàn)的又一類核受體，主要包括3個亞型，其中以RXRα 研究最為充分。近年來，對RXR 的研究越來越多，人們對于RXR 的作用不斷有了新的認(rèn)識。研究表明，RXR 廣泛參與腫瘤、糖尿病、心血管疾病等疾病過程[4-5］。研究報(bào)道，RXR 激動劑可以通過抑制蛋白激酶C 途徑來增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力，削弱高糖誘導(dǎo)下血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)，其機(jī)制可能與RXRα 的抗氧化應(yīng)激效應(yīng)有關(guān)[6］。AECII是LIRI中主要的效應(yīng)細(xì)胞，故本研究以大鼠AECII 為主要研究目標(biāo)，通過建立細(xì)胞缺氧/復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation， HR）損傷模型，模擬在體LIRI[7-8］，旨在進(jìn)一步明確氧化應(yīng)激在HR 損傷中的發(fā)生機(jī)制；同時以RXR 為研究靶點(diǎn)，通過RXR 激動劑和抑制劑對AECII 進(jìn)行預(yù)處理，研究RXR 在肺HR 損傷誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)過程中的可能作用及其調(diào)控機(jī)制，從而為在體LIRI的防治提供參考。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

大鼠AECII 系購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

2 主要試劑及儀器

高糖DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清、青-鏈霉素混合液、PBS、0.25%胰酶（含EDTA）和無血清細(xì)胞凍存液為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純；RXR 激動劑9-順式視黃酸（9-cis-retinoic acid， 9-RA）和RXR拮抗劑HX531購自Sigma；CCK-8 試劑盒購自Dojindo；抗表面活性物質(zhì)蛋白A（surfactant protein A， SP-A）、RXRα 和核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）抗體購自Abcam；Nrf2 引物設(shè)計(jì)合成購自上海生工生物工程股份有限公司；即用型BCA 蛋白定量試劑盒購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）測定試劑盒（WST-1 法）和丙二醛（malondialdehyde， MDA）測定試劑盒（微板法）購自南京建成生物工程研究所。

凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）；高通量熒光定量PCR儀（ABI）；透射電鏡（Hitachi）。

3 主要方法

3.1 實(shí)驗(yàn)分組及ACEⅡ缺氧/復(fù)氧模型的制備 按照隨機(jī)原則將細(xì)胞分為：（1）對照（control， C）組：含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)液常氧箱內(nèi)培養(yǎng)30 h；（2）HR 組：低氧箱內(nèi)（參數(shù)37 ℃，1% O2）無糖無血清DMEM 培養(yǎng)液處理細(xì)胞6 h 后，使用無血清的DMEM 培養(yǎng)液常氧箱內(nèi)正常培養(yǎng)24 h；（3）HR+溶劑二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide， DMSO）組（HD 組）：在缺氧造模前用含終濃度低于0.1% DMSO 的無血清培養(yǎng)液處理1.5 h；（4）HR+9-RA 組（RA 組）：用含9-RA（100 nmol/L）的無血清培養(yǎng)液預(yù)處理細(xì)胞1 h，之后進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理；（5）HR+HX531組（HX組）：在缺氧造模前先用100 nmol/L 的9-RA 預(yù)處理細(xì)胞0.5 h，再用2.5 μmol/L 的HX531 預(yù)處理1 h，其余處理同HR組。HR模型參考其他學(xué)者研究方法及在本實(shí)驗(yàn)室前期研究基礎(chǔ)上[7-10］，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)多次實(shí)踐再進(jìn)行整合改進(jìn)構(gòu)建大鼠缺氧/復(fù)氧模型。細(xì)胞缺氧處理用無糖無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)并放置于低氧箱6 h后再用不含血清的高糖DMEM 培養(yǎng)液，放置常氧箱恢復(fù)氧氣培養(yǎng)24 h。

3.2 免疫熒光標(biāo)記法 用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，經(jīng)打孔處理后，進(jìn)行封閉處理，滴加相應(yīng)Ⅰ抗（Nrf2，1∶1 000）后放于濕盒內(nèi)避光，4 ℃冰箱孵育過夜，PBS洗滌3 次后用對應(yīng)的熒光Ⅱ抗（1∶5 000）室溫避光孵育1 h 后，再次PBS 充分洗滌3 次，使用DAPI 對核進(jìn)行染色，封片，并在正置熒光顯微鏡下觀察并拍片。

3.3 CCK-8 實(shí)驗(yàn) 根據(jù)CCK-8 試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，按照VCCK-8∶V培養(yǎng)液=1∶10 進(jìn)行混合。96 孔板每孔加入110 μL CCK8 和培養(yǎng)液的混合液，37 ℃孵育1 h，450 nm測每孔的吸光度（A）值。

3.4 檢測細(xì)胞SOD 活性 首先，用蛋白酶抑制劑PMSF+RAPI 法提取細(xì)胞蛋白樣品，用BCA 法測蛋白濃度，再按照SOD 試劑盒使用說明步驟對試劑反應(yīng)液進(jìn)行配制和添加，水浴鍋37 ℃孵育30 min 后立即在酶標(biāo)儀450 nm 處測定A值，計(jì)算SOD 活性。SOD活性（U/mg）=SOD 抑制率/50%×反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)（0.24 mL/0.02 mL）/待測樣品蛋白濃度（mg/mL），SOD 抑制率（%）=[（A對照-A對照空白）-（A測定-A測定空白）］/（A對照-A對照空白）×100%。

3.5 檢測細(xì)胞MDA 含量 提取細(xì)胞蛋白并測定蛋白濃度。按照試劑盒說明書滴加反應(yīng)液，EP 管用針頭刺一小孔，放于水浴鍋95 ℃高溫孵育40 min，流水下沖洗使之逐漸冷卻，離心機(jī)2 680×g進(jìn)行離心15 min，吸取200 μL 上清液在96 孔板中，酶標(biāo)儀立即測定各管在532 nm處的A值，計(jì)算MDA 含量。MDA 含量（nmol/mg）=（A測定-A對照）/（A標(biāo)準(zhǔn)-A空白）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（10 nmol/mL）/待測樣品蛋白濃度（mg/mL）。

3.6 透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化 用1 mL戊二醛固定液固定細(xì)胞，放到4 ℃冰箱過夜。隔日用PBS 放置搖床上洗3 次后，按照1%鋨酸后固定，1%醋酸鈾塊染，丙酮梯度脫水、浸透，環(huán)氧樹脂812 包埋劑包埋聚合的順序依次進(jìn)行，然后超薄切片，最后透射電鏡下觀察并拍攝。

3.7 RT-PCR 檢測Nrf2 的mRNA 表達(dá) 使用Trizol法提取細(xì)胞總RNA。將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束用2.0%瓊脂糖凝膠對其進(jìn)行電泳，然后全自動凝膠成像系統(tǒng)曝光成像半定量分析。Nrf2 的上游引物序列為5'-GAAAAGAAGTGGGCAACTGTGG-3'，下游引物序列為5'-GGTGGGATTTGAGTCTAAGGAGGT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為117 bp；內(nèi)參照GAPDH 的上游引物序列為5'-ATTGCCGACAGGATGCAGAA-3'，下游引物序列為5'-GAATGTGGATAGGCTGGCGA-3'。

3.8 Western blot 檢測Nrf2 蛋白表達(dá) 造模結(jié)束后立即按照VPMSF∶VRAPI裂解液=1∶100 配制裂解混合液，冰上裂解細(xì)胞30 min 后收集6 孔板裂解液，超聲后離心收集細(xì)胞上清液并用BCA 法測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液后金屬孵育器（100 ℃）孵育10 min變性。依次經(jīng)電泳儀電泳，轉(zhuǎn)膜（濕轉(zhuǎn)）、10%脫脂牛奶封閉2 h，Tris-HCl 緩沖鹽溶液+Tween 20 （TBST）洗膜3次，Nrf2 抗體（1∶1 000）4 ℃孵育過夜。TBST 充分洗滌后，Ⅱ抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次，滴加適量ECL 發(fā)光液（VA液∶VB液=1∶1），用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光拍攝，半定量分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 9 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，則多組樣本均數(shù)間的比較使用單因素方差分析評估統(tǒng)計(jì)意義；否則，使用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)來評估統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 免疫熒光標(biāo)記法鑒定AECII

用免疫熒光標(biāo)記法檢測AECII 的特異性表達(dá)標(biāo)志物SP-A。熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示：藍(lán)色熒光為細(xì)胞核，紅色熒光為SP-A蛋白位置，定位于AECII細(xì)胞核周邊，證實(shí)本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞為AECII，見圖1。

Figure 1. Identification of type II alveolar epithelial cells. Blue arrow： nucleus； yellow arrow： surfactant protein A（SP-A）.圖1 免疫熒光標(biāo)記法鑒定II型肺泡上皮細(xì)胞的結(jié)果

2 CCK-8檢測AECII活力

與C組比較，其余四組細(xì)胞的A值可見顯著下降（P＜0.05）；與HR 組比較，RA 組的A值顯著升高（P＜0.05）；與RA 組比較，HX 組的A值顯著降低（P＜0.05）；而HR、HD 和HX 三組兩兩相比，A值無顯著差異（P＞0.05），見圖2。

Figure 2. The changes of absorbance value in all groups. Mean±SD. n=5. ▲P＜0.05 vs C group； #P＜0.05 vs HR group； *P＜0.05 vs RA group.圖2 CCK-8檢測結(jié)果

3 免疫熒光標(biāo)記法檢測AECII中RXRα表達(dá)

與C組相比，其余四組細(xì)胞中的RXRα含量顯著增加（P＜0.01）；與HR 組相比，RA 組的RXRα含量增加（P＜0.01）；與RA 組對比，HX 組細(xì)胞的RXRα含量顯著降低（P＜0.01）；而HR、HD、HX 三組兩兩相比，細(xì)胞中RXRα含量無顯著差異（P＞0.05），見圖3。

Figure 3. The RXRα expression was detected by immunofluorescence staining （scale bar=100 μm）. Mean±SD. n=5. ▲▲P＜0.01 vs C group； ##P＜0.01 vs HR group；**P＜0.01 vs HD group； △△P＜0.01 vs RA group.圖3 免疫熒光標(biāo)記法檢測RXRα表達(dá)結(jié)果

4 AECII中的SOD活性和MDA含量

與C 組相比，HR、HD、RA 和HX 這4 組在相應(yīng)處理后細(xì)胞的SOD 活性均下降（P＜0.05），而此4 組細(xì)胞MDA 的表達(dá)上升（P＜0.05）；與HR 組相比，RA 組的SOD 活性增高（P＜0.05），而MDA 表達(dá)下降（P＜0.05）；與RA 組相比較，HX 組細(xì)胞的SOD 活性減少（P＜0.05），細(xì)胞中MDA 表達(dá)增加（P＜0.05）；而HR、HD 和HX 三組兩兩相比，SOD 活性及MDA 含量的變化無顯著差異（P＞0.05），見圖4。

Figure 4. Changes of SOD activity （A） and MDA content （B） in each group. Mean±SD. n=5. ▲P＜0.05 vs C group； #P＜0.05 vs HR group； *P＜0.05 vsRA group.圖4 SOD活性和MDA含量檢測結(jié)果

5 透射電鏡觀察AECII超微結(jié)構(gòu)

透射電鏡下看見，C組肺泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)未見明顯異常，可見豐富的板層小體；與C 組相比，剩余四組肺泡細(xì)胞內(nèi)部可見結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度的紊亂。其中HR、HD 和HX 三組AECII 內(nèi)線粒體發(fā)生高度腫脹，線粒體嵴線溶解甚至消失，偶見變異性的增生，板層小體變性，出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象；RA 組相較于HR、HD 和HX三組，AECII損傷減弱，板層小體數(shù)目增多且空泡化現(xiàn)象減少，線粒體結(jié)構(gòu)相對較為完整，線粒體僅出現(xiàn)輕微腫脹且線粒體嵴清晰。見圖5。

Figure 5. Ultrastructure of the cells under electron microscope.n=5. Scale bar=0.5 μm. The yellow arrow indicates mitochondria， and the blue arrow indicates lamellar bodies.圖5 透射電鏡觀察結(jié)果

6 AECII中Nrf2表達(dá)

RT-PCR 檢測結(jié)果顯示，與C 組相比，HR、HD、RA 和HX 這四組的Nrf2 mRNA 表達(dá)均顯著減少（P＜0.01）；與HR和HD組相比，RA組的Nrf2 mRNA表達(dá)顯著增加（P＜0.01）；與RA 組相比，HX 組表達(dá)下降（P＜0.01）；HR、HD 和HX 三組兩兩相比，各組細(xì)胞Nrf2 mRNA表達(dá)改變無顯著差異（P＞0.05），見圖6。

Figure 6. The mRNA expression of Nrf2 in each group. Mean±SD. n=5. ▲▲P＜0.01 vs C group； ##P＜0.01 vs HR group； **P＜0.01 vs HD group； △△P＜0.01 vs RA group.圖6 RT-PCR檢測結(jié)果

與C 組相比，剩余四組細(xì)胞中Nrf2 蛋白的表達(dá)下降（P＜0.05）；與HR 和HD 組相比，RA 組的Nrf2 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與RA 組相比，HX 組表達(dá)下降（P＜0.01）；HR、HD 和HX 三組兩兩相比，Nrf2蛋白表達(dá)變化無顯著差異（P＞0.05），見圖7。

Figure 7. The protein expression of Nrf2 in each group. Mean±SD. n=5. ▲P＜0.05， ▲▲P＜0.01 vs C group； ##P＜0.01 vs HR group； **P＜0.01 vs HD group； △△P＜0.01 vs RA group.圖7 Western blot檢測結(jié)果

討 論

氧化應(yīng)激反應(yīng)是肺缺血再灌注損傷重要的發(fā)生機(jī)制，其產(chǎn)生病理性損害的直接原因是ROS的積聚，ROS 是一種高度不穩(wěn)定的氧分子，肺內(nèi)大量自由基的增加，使導(dǎo)致肺細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及功能的異常，伴隨細(xì)胞通透性增加、腫脹甚至溶解壞死，肺毛細(xì)血管通透性異常，大量組織液無法及時被系統(tǒng)吸收，最終發(fā)展為肺水腫[11］。在病理?xiàng)l件下，大量自由基的迅速堆積引起自由基清除系統(tǒng)超負(fù)荷工作而被迫＂癱瘓＂，必然引起細(xì)胞的損傷[12］。目前研究認(rèn)為，Nrf2 在細(xì)胞介導(dǎo)的抗氧化應(yīng)激防御反應(yīng)中發(fā)揮著不可或缺的重要作用[13］。另外， SOD是一種抗氧化酶，在氧化應(yīng)激反應(yīng)的緩沖中占有關(guān)鍵地位，具有清除ROS 的特殊功能。機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)時，抗氧化機(jī)制無法滿足機(jī)體的正常運(yùn)轉(zhuǎn)需求，必然造成脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而生成降解產(chǎn)物MDA，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷[14］。MDA的含量也可以反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)氧化的程度。本實(shí)驗(yàn)通過測定細(xì)胞SOD、MDA 和Nrf2 來檢測細(xì)胞損傷程度，結(jié)果表明，與C 組比較，HR、HD、RA和HX 四組的MDA 含量均升高，SOD 活性和Nrf2 mRNA 及蛋白表達(dá)水平均下降。另外，細(xì)胞活力呈下降趨勢，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)也發(fā)生損傷性改變，表明缺氧/復(fù)氧作為誘因引發(fā)了氧化應(yīng)激反應(yīng)，最終導(dǎo)致大鼠AECII損傷性改變。

RXR 是細(xì)胞核激素受體超家族中的重要成員之一，已經(jīng)證實(shí)RXR 是由位于人類9 號染色體（RXRA，又稱NR2B1）、6號染色體（RXRB、NR2B2）和1號染色體（RXRG，NR2B3）三個不同基因編碼[15］。RXR 可以與甲狀腺素受體（thyroid hormone receptor， TR）、維生素D 受體（vitamin D receptor， VD）等受體結(jié)合形成二聚體，發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)。RXRα作為其重要的分型之一，廣泛表達(dá)于多個臟器，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展。RXRα的抗氧化應(yīng)激效應(yīng)，維護(hù)細(xì)胞穩(wěn)定等特性已被得到證實(shí)[6］。本實(shí)驗(yàn)通過運(yùn)用RXR 激動劑9-RA 和RXR 拮抗劑HX531 來干預(yù)，結(jié)果顯示，與HR、HD 和HX 組相比，RA 組的MDA 含量顯著降低，SOD 活性、Nrf2 mRNA 及蛋白表達(dá)水平升高，細(xì)胞活力上升，細(xì)胞損傷程度減輕。而在應(yīng)用RXR 拮抗劑HX531 后，上述作用被成功阻斷。這些結(jié)果證明激動RXR 在一定程度上可通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，對HR損傷的大鼠AECII起到一定保護(hù)作用。

綜上所述，HR 可加劇大鼠AECII 的氧化應(yīng)激反應(yīng)，而激動RXR 在一定程度上減輕了大鼠AECII 的HR 損傷，提示其機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。本研究為在體肺缺血/再灌注損傷的防治提供了新的有效干預(yù)靶點(diǎn)。