骨形態發生蛋白7通過下調Ajuba減輕糖尿病腎病大鼠腎纖維化*

馮昭衛， 代云莉， 梁 丹， 李志陽， 王一凡， 呂厚星， 陳佳佳，陳圣杰， 郭 兵， 肖 瑛△

（1貴州省常見慢性疾病發病機制及藥物研究重點實驗室，2貴州醫科大學病理生理學教研室，貴州 貴陽 550025）

糖尿病（diabetes mellitus， DM）是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，隨著病情發展加重，糖尿病患者罹患各種疾病的風險也會提高，其中糖尿病腎病（diabetic kidney disease， DKD）是最常見和危害性最重的并發癥，常導致腎功能衰竭，也是終末期腎病的主要原因[1］。DKD 的發病機制復雜，涉及多種因素、環節，其典型腎臟組織病理學改變包括腎小球基底膜增厚、系膜基質擴張、腎小球硬化、腎小管萎縮和腎小管-間質纖維化、小動脈透明質變，并伴有細胞外基質（extracellular matrix， ECM），如III型膠原蛋白（collagen type III， Col-III）和纖維連接蛋白（fibronectin， FN）的沉積增多[2-3］。此外，DKD 可發生上皮細胞向間充質細胞轉分化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）促進ECM 分泌和沉積，使腎纖維化進行性加重。目前對DKD 的防治包括有效的控制血糖和血壓、阻斷腎素-血管緊張素-醛固酮系統[2］、鈉-葡萄糖共轉運體2 抑制劑及干細胞等治療方式，但仍不能遏制DKD 或對抗纖維化的進程，故不斷深入探尋DKD 的發病機制及尋找DKD 治療的有效靶點就顯得格外的重要[4-5］。

Ajuba屬于LIM鋅指結構域蛋白中的Ajuba/Zyxin亞家族，具有調節細胞遷移、細胞黏附、器官細胞生長發育、控制器官大小、限制Hippo 信號通路的作用及在早期腫瘤發生發展中發揮關鍵作用的生理功能[6］。如在結直腸癌中，Ajuba 可介導鋅指轉錄因子Snail 引起E-鈣黏蛋白減少，誘導EMT[7］。也有研究觀察到Ajuba 參與著特發性肺纖維化的進程[8］，表明Ajuba 在部分疾病纖維化的進程中發揮著重要的作用，然未見其在DKD 及腎纖維化中的相關報道。Yes 相 關 蛋 白1（yes-associated protein1， YAP1）是Hippo信號通路的下游效應分子之一，參與調節細胞增殖及組織器官生長，在生物體組織再生和修復過程中具有重要作用[9］。據報道YAP1 參與了急性腎損傷和慢性腎臟疾病的腎損害修復過程[10］。課題組的前期結果提示，YAP1 可通過調控轉化生長因子β（transforming growth factor-β， TGF-β）參與DKD 腎臟纖維化進程[11］。雖然Ajuba 或YAP1 參與了多種疾病的發生發展過程，但是有關Ajuba 與YAP1 二者在DKD 中的作用及受到什么因素的調控卻未見報道。骨 形 態 發 生 蛋 白7（bone morphogenetic protein 7，BMP7）是TGF-β1 超家族成員，在哺乳動物胎腎和成年腎臟中大量表達，不僅能夠維持和促進腎組織的正常發育，而且能對抗腎臟纖維化，但其確切機制尚不清楚[12］。課題前期研究表明在腎臟組織中BMP7可抑制TGF-β/Smads 通路減輕腎臟纖維化程度[13］。以上提示為BMP7與Ajuba、YAP1共同參與調控臟器纖維化提供了可能性。

本研究擬通過檢測DKD 大鼠腎皮質和NRK-52E 細胞中BMP7、Ajuba 和YAP1 的變化及過表達BMP7 腺 相 關 病 毒（BMP7 adeno-associated virus,rAAV-BMP7）和予外源性人重組BMP7（recombinant human BMP7，rhBMP7）干預BMP7 表達后各指標的變化，以此探討BMP7 是否可通過下調Ajuba 而抑制YAP1 的表達，進行性減少ECM 的沉積，延緩DKD 腎纖維化的進展，為挖掘DKD 時BMP7 減輕腎臟纖維化的機制提供新的實驗依據。

材 料 和 方 法

1 動物與細胞

18只8周齡的SPF級雄性SD大鼠，體質量（180±20） g，購自遼寧長生生物技術有限公司[生產許可證號為SCXK（遼）2015-0001］。NRK-52E 細胞（大鼠腎小管上皮細胞）來源于美國細胞培養物收藏中心。

2 藥物與試劑

鏈脲佐菌素（streptozotocin， STZ）為Sigma 產品；生化指標檢測試劑盒（南京建成生物技術有限公司）；DAB 染色試劑盒（基因科技上海股份有限公司）；天狼星紅染液（北京華越洋生物科技有限公司）；抗β-actin 抗體（普美生物科技有限公司）；兔抗纖維連接蛋白（Abcam）；兔抗Ajuba蛋白抗體（Signalway Antibody）；兔抗BMP7、兔抗YAP1、兔抗III 型膠原抗體及重組人BMP7蛋白（武漢三鷹生物技術有限公司）；Ajuba、YAP1、β-actin 引物（上海生工生物技術工程服務有限公司）；胎牛血清（上海玉博生物科技有限公司）；低糖（5.5 mmol/L glucose） DMEM 培養液（Gibco Introvigen）。

3 體內過表達BMP7腺相關病毒

利用美國國家生物技術信息中心網站數據庫，查詢獲得BMP7基因的序列。并根據基因序列，分別進行基因合成，插入腺相關病毒表達穿梭質粒載體中，并與輔助質粒一起完成腺相關病毒過表達質粒構建。

4 實驗方法

4.1 動物模型的建立與分組 18只SD 大鼠適應性喂養1 周后隨機分為正常對照（normal control，NC）組、糖尿病（diabetes mellitus， DM）組和DM+rAAVBMP7 組，每組6 只。DM 組和DM+rAAV-BMP7 組按55 mg/kg 尾靜脈一次性注射STZ 溶液復制糖尿病大鼠模型。3 d 后大鼠空腹血糖值≥16.7 mmol/L 且穩定則認定為糖尿病模型復制成功[14］。6周后，向DM+rAAV-BMP7 組大鼠予尾靜脈一次性注射過表達BMP7 腺相關病毒，注射量為1.5×1015pfu/L。繼續飼養8 周后處死。期間按期監測大鼠血糖、體重。所有操作均遵照實驗動物倫理學要求（1900073）進行[13-16］。

4.2 NRK-52E 細胞培養 待細胞密度生長到90%左右時，胰酶消化細胞制為細胞懸液，用于細胞鋪板和細胞傳代。將細胞隨機分成3 個組，即正常糖（normla glucose，NG）組、高糖（high glucose，HG）組以及HG+rhBMP7組，培養 48 h后加入裂解液提取細胞蛋白[13-16］。

4.3 取材與生化指標檢測 大鼠在處死前24 h 轉移至代謝籠內收集24 h 尿；前6 h 禁食不禁水；股動脈取血并處死，血液離心（4 ℃、13 400 ×g） 20 min，收集血清；檢測血糖、血肌酐、甘油三酯、總膽固醇、24 h 尿蛋白；生理鹽水灌洗腎臟后取雙側腎臟，分為若干份用于不同實驗[13-16］。

4.4 RT-qPCR 檢測大鼠腎皮質中mRNA 含量Trizol 法提取大鼠腎皮質組織RNA。測其濃度并進行逆轉錄獲得cDNA，按照熒光定量試劑盒配制反應體后，于熒光定量PCR 儀中擴增檢測。結果以β-actin 為內參照，目的基因相對含量采用2-ΔΔCt法計算并進行統計分析[13-16］。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

4.5 大鼠腎組織病理學染色 將存放于4%多聚甲醛溶液中的組織塊沖洗，脫水透明、石蠟包埋，制作成3 μm 的石蠟切片。石蠟切片按試劑盒說明書步驟進行天狼星紅染色及HE染色[13-16］。

4.6 Western blot 檢測腎皮質及NRK-52E 細胞BMP7、Ajuba、YAP1、FN、Col-III 蛋白表達水平 向3組大鼠腎皮質組織或3 組NRK-52E 細胞中加入裂解液，碾磨制作為組織或細胞蛋白勻漿。離心（4 ℃、13 400 ×g） 20 min，取組織或細胞蛋白上清。根據BCA 試劑盒說明書進行操作，檢測上清中蛋白的濃度，并加入5×蛋白上樣緩沖液稀釋，100 ℃煮沸15 min獲得組織或細胞上樣蛋白。

制作不同濃度聚丙烯酰胺凝膠，經蛋白上樣、電泳、轉膜、封閉、洗滌、加入β-actin （1∶5 000）、BMP7（1∶1 000）、Ajuba （1∶1 000）、YAP1 （1∶1 000）、FN （1∶1 000）、Col-III （1∶1 000）抗體于4 ℃孵育過夜。次日取出，洗滌后加Ⅱ抗孵育；使用增強化學發光法顯色、曝光獲得目的條帶，經統計軟件分析后得到灰度值進行統計分析[13-16］。

4.7 免疫組織化學染色檢測腎組織中Ajuba， YAP1蛋白的表達部位 石蠟切片經烤片、脫蠟、抗原修復、洗滌、3% H2O2阻斷，洗滌后加Ⅰ抗YAP1（1∶200）、Ajuba （1∶100），4 ℃孵育過夜；次日取出復溫、加Ⅱ抗孵育，DAB 顯色，蘇木素染色，上行脫水，封片，光鏡下觀察并拍照[13-16］。

5 統計學處理

數據統計采用SPSS 25.0 分析處理，以均數±標準差表示。兩組間采用獨立樣本t檢驗，3 組或以上組數據組間因素比較則采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義；采用Pearson 相關性分析Ajuba與BMP7、YAP1，Ajuba與FN、Col-III以及BMP7與YAP1 之間的相關性并使用GraphPad prism 9.0 進行統計作圖[13-16］。

結 果

1 過表達BMP7可改善糖尿病大鼠的腎功能

Western blot 結果見圖1，DM 組中BMP7 蛋白表達低于NC 組（P＜0.05），但與DM 組相比，DM+rAAVBMP7 組中BMP7 則顯著增加（P＜0.05），提示BMP7過表達成功。

Figure 1. Relative protein expression of BMP7 in renal tissues of rats. Mean± SD. n=6. *P＜0.05 vsNC group； #P＜0.05 vsDM group.圖1 大鼠腎皮質中BMP7蛋白的表達

表2 所示：DM 組大鼠的尿肌酐較NC 組顯著降低（P＜0.05），血肌酐、24 h尿蛋白、血糖、總膽固醇和甘油三酯較NC 組顯著升高（P＜0.05）；而在DM+rAAV-BMP7組中大鼠總膽固醇、甘油三酯和血肌酐、24 h尿蛋白顯著降低，尿肌酐則顯著升高（P＜0.05），但兩組的血糖值持續穩定大于16.7 mmol/L，二者之間無顯著差異（P＞0.05）。

表2 大鼠血糖、尿肌酐、血肌酐、24 h尿蛋白、總膽固醇和甘油三酯的變化Table 2. The changes of blood glucose （BG）， urine creatinine （UCr）， serum creatinine （SCr）， 24 h urinary total protein （UTP），total cholesterol （TC）， triglyceride （TG） level （Mean±SD. n=6）

2 過表達BMP7 后糖尿病大鼠腎組織病理形態得到了改善

HE 染色結果見圖2： NC 組腎小管排列緊密整齊，形態結構正常，無萎縮和蛋白管型，腎小球形態結構較規則未見增生，腎間質正常；DM 組中，雖然未見腎小管玻璃樣變性，但腎小管排列較紊亂，部分腎小管變形、萎縮、水腫，腎小球系膜細胞出現增生，腎小球系膜區基質增多，腎間質出現纖維組織以及少量炎癥細胞浸潤；DM+rAAV-BMP7 組腎組織病理改變較DM組顯著減輕。

天狼星紅染色見圖3：與NC 組比較，DM 組大鼠腎小管、間質的膠原纖維沉積顯著增加，DM+rAAVBMP7組較DM組膠原纖維沉積顯著減少。

3 過表達BMP7 后可抑制DKD 大鼠腎皮質組織中ECM累積

Western blot 結果見圖4： DM 組大鼠腎皮質中FN 和Col-III 蛋白表達水平較NC 組顯著升高（P＜0.05），而在過表達BMP7 后蛋白表達顯著下降（P＜0.05）。

Figure 4. FN and Col-III protein expressions in renal tissues of rats. Mean±SD. n=6. *P＜0.05 vs NC group； #P＜0.05 vs DM group.圖4 大鼠腎皮質中FN、Col-III蛋白表達

4 過表達BMP7 可下調DKD 大鼠腎皮質Ajuba 和YAP1的蛋白和mRNA表達水平

免疫組織化學染色結果顯示，NC 組、DM 組和DM+rAAV-BMP7 組中Ajuba 蛋白和YAP1 蛋白在腎小管上皮細胞質和核內表達，呈棕黃色染；DM 組中Ajuba 與YAP1 的棕黃染顯著增加，DM+rAAV-BMP7組二者的棕黃色染顯著減少，見圖5、6。

Figure 5. Expression of Ajuba in renal tissue of rat detected by immunohistochemical staining. The brown-yellow color was the positive expression area. Ajuba was mainly expressed in the cytoplasm and nucleus of renal tubular epithelium， and was significantly increased in DM group， while significantly decreased after overexpression of BMP7.圖5 免疫組織化學染色檢測大鼠腎皮質Ajuba的表達

Figure 6. Expression of YAP1 in renal tissue of rats detected by immunohistochemical staining. The brown-yellow color was the positive expression area. YAP1 was mainly expressed in the cytoplasm and nucleus of renal tubular epithelium， and was significantly increased in DM group， while significantly decreased after overexpression of BMP7.圖6 免疫組織化學染色檢測大鼠腎皮質YAP1的表達部位

Western blot 結果顯示，DM 組中Ajuba 和YAP1蛋白表達水平顯著增加（P＜0.05），在過表達BMP7后二者表達水平顯著降低（P＜0.05），見圖7。

Figure 7. YAP1 and Ajuba protein expressions in renal tissues of rats. Mean±SD. n=6. *P＜0.05 vsNC group； #P＜0.05 vsDM group.圖7 大鼠腎皮質中YAP1和Ajuba蛋白的表達

RT-qPCR 結果顯示，各組大鼠腎皮質中Ajuba和YAP1的mRNA水平變化與蛋白一致，見圖8。

Figure 8. Ajuba and YAP1 mRNA levels in renal cortex of rats.Mean±SD. n=6. *P＜0.05 vsNC group； #P＜0.05 vs DM group.圖8 大鼠腎皮質中Ajuba、YAP1的mRNA水平

5 過表達BMP7 可減少NRK-52E 細胞中ECM 沉積及Ajuba和YAP1的表達

Western blot 結果顯示，與NG 組比較，HG 組FN和Col-III 蛋白表達水平顯著增加（P＜0.05），在予外源性rhBMP7干預后，上述蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；同時HG 組Ajuba 和YAP1 蛋白水平也高于NG 組（P＜0.05），而HG+rhBMP7 組Ajuba 和YAP1 蛋白水平較HG組顯著降低（P＜0.05），見圖9。

Figure 9. Ajuba， YAP1， FN and Col-III protein expression of NRK-52E cells. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vsNG group； #P＜0.05 vs HG group.圖9 NRK-52E細胞中Ajuba、YAP1、FN和Col-III蛋白的表達

6 Pearson 法分析Ajuba 與YAP1、FN 和Col-III 及BMP7與Ajuba和YAP1的相關性結果

如圖10 所示，Ajuba 與YAP1、FN 和Col-III 均呈正相關，相關系數分別為0.840、0.802 和0.856（P＜0.01）；而BMP7 與Ajuba 和YAP1 均呈負相關，相關系數分別為-0.591和-0.608（P＜0.01）。

Figure 10. The correlations between Ajuba and YAP1/FN/Col-III， and BMP7 and Ajuba/YAP1 were analyzed by Pearson method.圖10 Pearson法分析Ajuba與YAP1、FN和Col-III及BMP7與Ajuba和YAP1的相關性結果

討 論

本研究中，DM 組和DM+rAAV-BMP7 組大鼠較NC 組，血糖均持續穩定高于16.7 mmol/L，腎功能指標血肌酐、24 h 尿蛋白和脂質代謝指標膽固醇、甘油三酯均顯著升高，尿中出現蛋白；病理形態學染色觀察到DM組腎組織中有膠原纖維的大量沉積、腎小管出現水腫、空泡，并伴腎間質炎癥細胞浸潤，腎小球增生等，而DM+rAAV-BMP7 組其病理改變顯著減輕甚至消失，以上實驗結果表明DM大鼠模型復制成功且出現了腎功能的損害，過表達BMP7可顯著改善腎臟病理形態，與課題組前期研究結果一致[15］。

Ajuba 是Twist 的共激活因子，并以此激活N-鈣黏蛋白的轉錄，而Twist 是EMT 的主要標志物，參與組織器官的纖維化過程，能促進細胞運動和侵襲活動，抑制Ajuba/Twist 通路可能成為治療腫瘤轉移的新靶點[17］。動物和細胞實驗結果顯示，Ajuba 的蛋白表達水平顯著高于正常對照組，并伴隨FN 和Col-III的蛋白表達升高，與腎臟纖維化指標FN 和Col-III 進行了Pearson 相關性分析后發現，Ajuba 與FN、Ajuba與Col-III 之間呈顯著正相關，提示在DKD 大鼠和高糖誘導的NRK-52E 細胞中Ajuba 表達增多可能促進了腎小管上皮細胞ECM 的沉積，參與高糖狀態下的腎臟纖維化進程。此外，課題組前期研究觀察到高糖狀態下NRK-52E 細胞，信號轉導及轉錄激活因子3（signal transduction and transcriptional activation factors 3， STAT3）通過轉錄促進下游靶基因YAP1的表達，促進腎小管上皮細胞EMT，介導腎小管-間質纖維化的發生[12］，提示YAP1參與了腎小管上皮細胞的纖維化過程。Liang 等[18］在單側輸尿管梗阻小鼠模型中的研究觀察到YAP1 被激活后可致ECM 沉積增多，可加劇腎纖維化進程。也有研究顯示Ajuba可通過抑制含WW 結構域的人同源重組蛋白SAV 和腫瘤抑制基因Lats的表達，進而調控YAP1從而影響TGFβ，最終加劇特發性肺纖維化[6］。提示Ajuba 或調節YAP1 并參與了多種疾病纖維化的發生發展過程。但有關Ajuba 與YAP1 二者在DKD 中的作用及受到什么因素的調控以及在DKD 腎小管-間質纖維化的發生發展具有何作用還未見報道？本研究動物和細胞結果顯示NC 組和NG 組中YAP1 的蛋白和mRNA 表達水平較低，DM 組和HG 組中YAP1 的蛋白和mRNA 表達水平顯著增高，與Ajuba 進行Pearson 相關性分析也呈顯著正相關，提示Ajuba 可能影響YAP1 共同參與DKD 腎小管-間質纖維化的進程。

結合課題組前期研究結果，在DKD 和高糖的狀態下，BMP7 在腎臟組織中的表達水平是降低的，而外源性給予rhBMP7 有著逆轉EMT 和腎小球肥大等作用，能夠緩解腎間質纖維化進程[19］。同時有研究顯示在鼠肺肌成纖維化中，BMP7 正是通過抑制TGF-β 介導的骨膠原從而減緩纖維化的進程[13］。以上提示為BMP7 與Ajuba、YAP1 共同參與調控臟器纖維化提供了可能性。再結合京都基因與基因組百科全書（KEGG）網站信號通路圖，我們猜想它們之間會不會有著某種聯系，于是我們進行了下列相關動物和細胞實驗。本研究觀察到，尾靜脈注射腺相關病毒過表達BMP7 后，DKD 大鼠腎臟組織中Ajuba、YAP1 的蛋白和mRNA 表達水平顯著降低，腎功能、脂代謝功能指標也得到改善，ECM 的沉積減少，腎纖維化程度得到了緩解，Pearson 相關性分析也 可 知BMP7 與Ajuba、BMP7 與YAP1 呈 顯 著 負 相關，提示BMP7 可能通過抑制Ajuba 與YAP1 的水平來發揮減輕腎臟纖維化程度。考慮到大鼠體內環境復雜多樣性及可能存在其他信號通路的調控，為了進一步驗證，于是我們在體外高糖培養的腎小管上皮細胞中采用外源性rhBMP7 進行干預，并得到了與大鼠實驗相同的結果。

綜上所述，本研究顯示了BMP7 減輕糖尿病大鼠腎臟纖維化程度的又一可能信號通路，即BMP7可能通過下調Ajuba 的蛋白及mRNA 水平，抑制Hippo 通路的下游效應分子YAP1 的水平，進而減緩了ECM 沉積，為BMP7 減輕糖尿病大鼠腎臟纖維化提供了參考，但具體作用機制仍需要進一步探討。