大米肽螯合物的體外抗氧化作用研究

劉建，段升霞，陳瀏安，張東立，張大虎，趙貴紅

1.菏澤學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院（菏澤 274000）；2.菏澤學(xué)院化工學(xué)院（菏澤 274000）；3.山東大樹達(dá)孚特膳食品有限公司（菏澤 274000）

礦物質(zhì)元素鈣、鐵、鋅等，不僅是酶的必需成分和激活劑，而且是維持人體生命活動(dòng)和生長(zhǎng)發(fā)育的一類具有生理功能的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]。隨著社會(huì)的發(fā)展以及人們飲食結(jié)構(gòu)的不斷變化，當(dāng)前許多食物經(jīng)過精深加工后導(dǎo)致維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)素的流失，造成人體中礦物質(zhì)元素的缺失。另外，礦物質(zhì)元素在小腸內(nèi)的吸收模式也在一定程度上降低了其生物利用率[2]。根據(jù)《中國(guó)居民營(yíng)養(yǎng)與健康狀況》[3-4]監(jiān)測(cè)報(bào)告顯示：中國(guó)居民膳食鈣攝入量低于平均需要量，城鄉(xiāng)差別不大，提示絕大多數(shù)人群都存在著膳食鈣攝入不足的風(fēng)險(xiǎn)；35.6%的居民鋅的攝入量低于平均需要量，有攝入不足風(fēng)險(xiǎn)；居民中存在鐵攝入不足風(fēng)險(xiǎn)的比例是11.5%。

礦物質(zhì)元素的缺乏會(huì)引發(fā)一系列營(yíng)養(yǎng)性疾病，如：兒童缺鈣會(huì)得佝僂病；孕婦缺鈣會(huì)得妊高征；老年人缺鈣引起骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)增生[5]。孕婦、快速成長(zhǎng)期兒童，尤其是嬰幼兒處于快速生長(zhǎng)發(fā)育的階段，對(duì)鐵的需求量相對(duì)很大，普通飲食容易出現(xiàn)鐵營(yíng)養(yǎng)不良，會(huì)導(dǎo)致缺鐵性貧血、抵抗力下降或精神不振等現(xiàn)象[6]。兒童缺鋅會(huì)導(dǎo)致厭食、生長(zhǎng)發(fā)育不良、免疫力下降、智力發(fā)育落后等嚴(yán)重后果。鋅在人體內(nèi)的吸收代謝受種種因素的限制，而鋅缺乏已成為我國(guó)及許多發(fā)展中國(guó)家的公共衛(wèi)生問題[7]。因此，及時(shí)地補(bǔ)充鈣、鋅、鐵等人體所必需的礦物質(zhì)元素，尤其對(duì)特殊人群如嬰幼兒、兒童、青少年的生長(zhǎng)發(fā)育，以及孕婦和乳母的健康都具有重要意義。

多肽-礦質(zhì)元素螯合物作為一種新型的礦物元素補(bǔ)充劑越來越受到關(guān)注。當(dāng)多肽和礦質(zhì)元素形成螯合物之后，其能夠借助肽在小腸內(nèi)的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)特點(diǎn)以配合物的整體形式被主動(dòng)吸收，進(jìn)而提高無(wú)機(jī)態(tài)金屬離子的生物利用率。另外，礦質(zhì)元素與具有特殊生物活性的肽螯合后，螯合物仍具有抗氧化、抗菌、免疫調(diào)節(jié)、降血脂、降血糖等生物活性[8]，因此在食品、醫(yī)藥、飼料添加劑等領(lǐng)域都具有非常重要的研究意義和應(yīng)用價(jià)值。

肽鈣螯合物作為新一代鈣補(bǔ)充劑，它是鈣二價(jià)離子以配位鍵及離子鍵和多肽結(jié)合形成的具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的絡(luò)合物，這種螯合物既有利于微量元素以螯合物形式完整地被轉(zhuǎn)運(yùn)吸收，需要時(shí)又能有效地把鈣離子釋放出來。鈣螯合肽被認(rèn)為是改善鈣生物利用度的新型功能性成分，目前，已有大量鈣結(jié)合肽從各種食品資源中分離出來，如魚骨[9]、乳清[10]、大豆[11]等。因此，多肽螯合鈣必將成為補(bǔ)鈣劑發(fā)展的趨勢(shì)。多肽螯合鐵是蛋白質(zhì)水解生成的多肽與二價(jià)鐵離子螯合而成的生物態(tài)鐵，具有穩(wěn)定性好、吸收率高、毒性小等優(yōu)點(diǎn)，是一種理想的補(bǔ)鐵劑。研究發(fā)現(xiàn)，多肽螯合鐵可以大大提高鐵離子的吸收率。王利[12]以豬血為主要原料制備了豬血紅蛋白多肽螯合鐵，抗貧血功能試驗(yàn)結(jié)果表明豬血紅蛋白多肽螯合鐵抗貧血效果明顯優(yōu)于氯化亞鐵、葡糖糖酸亞鐵，與氯化高鐵血紅素相當(dāng)。鄧尚貴等[13]以鱈魚皮復(fù)合肽為原料，制備了鱈魚皮-亞鐵螯合物，并對(duì)其抗大鼠貧血效果進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，F(xiàn)e-FPH對(duì)抗大鼠貧血有明顯的效果。所以，多肽螯合鐵可作為一種比較理想的補(bǔ)鐵劑，用來改善缺鐵性貧血等癥狀。同時(shí)，氨基酸和小肽具有促進(jìn)鋅吸收的作用，而且氨基酸或肽的金屬?gòu)?fù)合體如鐵、鋅的生物學(xué)利用率比無(wú)機(jī)鹽高且無(wú)毒副作用。因此，研究開發(fā)這種多肽螯合鋅，具有十分重要的意義。

研究擬通過以大米肽為主要原料，制備富含鈣鐵鋅三種營(yíng)養(yǎng)素的大米肽螯合物。采用ABTS、DPPH自由基清除試驗(yàn)和還原力試驗(yàn)考察對(duì)比螯合原料和螯合物的體外抗氧化功能，對(duì)提高大米肽產(chǎn)品的品質(zhì)和附加值、促進(jìn)多肽螯合物及相關(guān)產(chǎn)業(yè)的進(jìn)步與發(fā)展，具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與時(shí)間

大米肽（山東大樹達(dá)孚特膳食品有限公司）；DPPH（純度98%，上海源葉生物技術(shù)有限公司）；氯化鈣、硫酸鋅、硫酸亞鐵（分析純）、ABTS（純度98%）、過硫酸鉀（純度99%）：上海麥克林生化科技有限公司；無(wú)水乙醇（煙臺(tái)遠(yuǎn)東精細(xì)化工有限公司）；三氯乙酸、氯化鐵（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；鐵氰化鉀（天津市福晨化學(xué)試劑廠）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司）；FA2004N電子天平（上海菁海儀器有限公司）；V-1200型可見分光光度計(jì)（上海美析儀器有限公司）；XK80-A快速混勻器（江蘇新康醫(yī)療機(jī)械有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大米肽的制備

大米蛋白粉→加水調(diào)制一定濃度→復(fù)合蛋白酶水解→滅酶→過濾→濃縮→噴霧干燥→包裝成品

1.3.2 大米肽-鈣、鋅、鐵螯合物的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[14-15]并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。大米肽-鈣螯合物：取5.5 g大米肽溶于100 mL去離子水中，充分?jǐn)嚢杌靹颍尤? g氯化鈣；將混合物以超聲波振蕩器充分振蕩均勻，以1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)混合溶液至pH 8.0，在40 ℃恒溫水浴中孵育100 min。大米肽-鋅螯合物：取4.0 g大米肽溶于100 mL去離子水中，充分?jǐn)嚢杌靹颍尤? g硫酸鋅；將混合物以超聲波振蕩器充分振蕩均勻，以1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)混合溶液至pH 5.0，在60 ℃恒溫水浴中孵育100 min。大米肽-鐵螯合物：取2.0 g大米肽溶于100 mL去離子水中，充分?jǐn)嚢杌靹颍尤?.0 g硫酸亞鐵和硫酸亞鐵質(zhì)量0.25%的抗壞血酸，防止抗氧化；將混合物以超聲波振蕩器充分振蕩均勻，以1 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)混合溶液至pH 6.5，在35 ℃恒溫水浴中孵育40 min。然后3種螯合物分別倒在4倍體積的無(wú)水乙醇中，經(jīng)12 h靜置沉淀，倒出上清液。將沉淀放在30 ℃鼓風(fēng)干燥箱中，干燥成粉，得到大米肽螯合物。

1.3.3 抗氧化作用測(cè)定

1.3.3.1 DPPH·清除能力測(cè)定[16]

稱取0.0059 g DPPH·（純度為98%）放入250 mL的容量瓶中，用70%的乙醇定容，配成DPPH·工作液（濃度為0.06 mmol/L-1）。取不同濃度的0.5 mL樣品溶液加入試管，分別加入5 mL DPPH·工作液混勻（對(duì)照管中則加0.5 mL的70%乙醇溶液，空白管中加0.5 mL的蒸餾水），吸光度測(cè)定波長(zhǎng)為517 nm，在室溫避光條件下放置30 min，測(cè)定吸光度，重復(fù)測(cè)定3次。

1.3.3.2 ABTS+·清除能力測(cè)定[16]

將0.192 g ABTS+·（純度98%）與0.033 g過硫酸鉀（純度99%）分別溶解于50 mL蒸餾水中，等量混合均勻，室溫黑暗處放置12～16 h，之后向母液中加入一定量的蒸餾水，溶液稀釋至在波長(zhǎng)734 nm處吸光度0.7±0.02，即為此次試驗(yàn)的ABTS+·工作液。取不同濃度的0.5 mL樣品溶液加入試管，分別加入5 mL ABTS+·工作液混勻（對(duì)照管中則加0.5 mL的70%乙醇溶液，空白管中加0.5 mL的蒸餾水），吸光度測(cè)定波長(zhǎng)為734 nm，在室溫避光條件下放置10 min，測(cè)定吸光度，重復(fù)測(cè)定3次。

1.3.3.3 還原力的測(cè)定

將2.5 mL樣品溶液與2.5 mL的蒸餾水、2.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液加入試管中充分混勻，在50 ℃的條件下孵育20 min，然后加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，混勻后靜置10 min。取2.5 mL試管中的混合溶液加入新試管，再加2.5 mL的蒸餾水和0.5 mL 0.1%的氯化鐵溶液，充分混勻，測(cè)定其在波長(zhǎng)700 nm下的吸光度，重復(fù)測(cè)定3次。將吸光度達(dá)到0.5所需要的有效濃度定義為A0.5。A0.5越小，表明樣品的還原能力越強(qiáng)[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大米肽分子量分析

根據(jù)文獻(xiàn)[18]進(jìn)行大米肽的分子量分布檢測(cè)，結(jié)果表明肽含量為88.3±1.13 g/100 g樣品。由表1可知，大米肽的分子量主要集中在1000 Da附近，分子量分布范圍主要在200～2000 Da之間，用峰面積歸一法計(jì)算得出分子量小于2000 Da的大米肽占總肽量的比例約為82.02%，分子量小于1000 Da的大米肽占總肽量一半以上（52.53%）。根據(jù)文獻(xiàn)[19]進(jìn)行大米肽的氨基酸組成分析，由表2可知，大米肽氨基酸含量最高的為谷氨酸，其次是天門冬氨酸、精氨酸、亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、丙氨酸等。多肽的抗氧化活性與其特定氨基酸組成以及氨基酸序列有密切關(guān)系，如組氨酸、精氨酸、賴氨酸、谷氨酸和天門冬氨酸作為極性帶電氨基酸，可以吸引帶有異性電荷的自由基和金屬離子，賦予肽抗氧化能力[20]。

表1 大米肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布

表2 大米肽的氨基酸組成分析 單位：g/100 g蛋白質(zhì)

2.2 體外抗氧化活性試驗(yàn)

2.2.1 DPPH自由基清除能力的比較

截至目前，多項(xiàng)研究使用DPPH來檢測(cè)功能活性化合物對(duì)自由基清除能力大小[21-23]。DPPH自由基是一種順磁化合物，具有單電子，可接受抗氧化劑提供的一個(gè)單電子，從而形成穩(wěn)定的DPPH-H化合物，同時(shí)自身顏色可從紫色逐漸變?yōu)辄S色，因此在波長(zhǎng)517 nm下吸光度的變化可反映出自由基清除程度[24-25]。大米肽及其螯合物清除DPPH自由基對(duì)比結(jié)果如圖1所示。大米肽及其鈣鐵鋅螯合物對(duì)DPPH自由基均具有一定的清除能力，且清除率隨樣品濃度的升高而升高（2～10 mg/mL）。其中，大米肽和大米肽螯合鈣變化趨勢(shì)較明顯，幾乎呈線性趨勢(shì)，經(jīng)擬合曲線公式計(jì)算得到大米肽和大米肽螯合鈣對(duì)清除DPPH自由基的IC50值分別為6.35±0.66 mg/mL和10.05±2.61 mg/mL。大米肽螯合鋅在樣品濃度高于6 mg/mL后，對(duì)DPPH自由基清除率穩(wěn)定在25%左右。大米肽螯合鐵對(duì)DPPH自由基清除率的增加較平穩(wěn)，在2 mg/mL時(shí)，即達(dá)到73.6%。結(jié)合圖1可知，在同樣濃度下，大米肽及其螯合物清除DPPH自由基的能力大小為大米肽螯合鐵＞大米肽＞大米肽螯合鈣＞大米肽螯合鋅。大米肽螯合鈣和大米肽螯合鋅清除DPPH自由基的能力小于大米肽，可能是由于螯合后，螯合物的結(jié)構(gòu)相比于原料大米肽發(fā)生改變，進(jìn)而導(dǎo)致氧化還原電勢(shì)小于原料肽[26]，而Fe2+可能與大米肽中的某些基團(tuán)結(jié)合，其清除DPPH自由基的能力大于大米肽的大米肽螯合鐵[21]。經(jīng)計(jì)算，圖2對(duì)照組VC清除DPPH自由基的IC50值為0.33±0.01 mg/mL，即VC清除DPPH自由基的能力明顯高于大米肽及其螯合物。

圖1 大米肽及其螯合物清除DPPH自由基對(duì)比圖

圖2 VC清除DPPH自由基對(duì)照?qǐng)D

2.2.2 ABTS自由基清除能力的比較

ABTS自由基清除試驗(yàn)同樣是被廣泛用于檢測(cè)功能活性化合物抗氧化能力大小的方法之一。測(cè)定物與被氧化的ABTS反應(yīng)后，通過顏色變化程度可測(cè)定被檢測(cè)抗氧化能力強(qiáng)弱[27]。

大米肽及其螯合物清除ABTS自由基對(duì)比結(jié)果如圖3所示。大米肽及其鈣鐵鋅螯合物對(duì)ABTS自由基均具有較好的清除能力，且清除率隨樣品濃度的升高而升高（0.2～1.0 mg/mL）。其中，大米肽、大米肽螯合鈣、大米肽螯合鋅、大米肽螯合鐵分別在0.2～0.8，0.2～0.6，0.2～0.8和0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi)變化趨勢(shì)較明顯，幾乎呈線性趨勢(shì)，經(jīng)擬合曲線公式計(jì)算得到大米肽、大米肽螯合鈣、大米肽螯合鋅、大米肽螯合鐵和VC對(duì)清除ABTS自由基的IC50值分別為0.61±0.01，0.54±0.04，0.92±0.01，1.08±0.02和1.03±0.01 mg/mL。結(jié)合圖3和圖4可知，在0.4～0.8 mg/mL范圍內(nèi)，大米肽及其螯合物清除ABTS自由基的能力大小為大米肽螯合鈣＞大米肽、大米肽螯合鋅＞大米肽螯合鐵＞VC。進(jìn)一步分析，螯合后，大米肽螯合鈣清除ABTS自由基的能力高于大米肽（0.2～1.0 mg/mL）、大米肽螯合鐵清除ABTS自由基的能力，低于大米肽（0.4～1.0 mg/mL），大米肽螯合鋅與大米肽清除ABTS自由基的能力區(qū)別不明顯。在0.4～0.8 mg/mL范圍內(nèi)，大米肽、大米肽螯合鈣、大米肽螯合鋅、大米肽螯合鐵清除ABTS自由基的能力均顯著高于VC。

圖3 大米肽及其螯合物清除ABTS自由基對(duì)比圖

圖4 VC清除ABTS自由基對(duì)照?qǐng)D

2.2.3 還原能力的比較

還原能力是抗氧化功能評(píng)價(jià)的一個(gè)重要指標(biāo)。它是將三價(jià)鐵還原為二價(jià)鐵，以波長(zhǎng)700 nm處的吸光度表示還原能力，吸光度的大小與化合物還原能力的強(qiáng)弱呈正比[28]。

大米肽及其螯合物還原能力對(duì)比結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，大米肽及其鈣鐵鋅螯合物均具有一定的還原能力，且還原能力隨樣品濃度的升高而升高（0.2～1.0 mg/mL）。其中，大米肽螯合鈣和大米肽螯合鐵變化趨勢(shì)較明顯，幾乎呈正比例線性增加趨勢(shì)，而大米肽和大米肽螯合鋅線性增加趨勢(shì)較平緩。在樣品濃度為0.2 mg/mL時(shí)，大米肽的還原能力最強(qiáng)，高于大米肽螯合鈣和大米肽螯合鐵。在樣品濃度0.6～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，大米肽螯合鈣和大米肽螯合鐵的還原能力高于大米肽，而大米肽螯合鋅的還原能力始終最低（0.2～1.0 mg/mL）。結(jié)合圖6，大米肽及其螯合物還原能力均顯著低于VC。

圖5 大米肽及其螯合物還原能力對(duì)比圖

圖6 VC還原能力對(duì)照?qǐng)D

2.2.4 大米肽及其螯合物的紅外光譜分析

紅外光譜是用來分析有機(jī)化合物官能團(tuán)組成的重要手段之一，能夠反映出大米肽與鈣鋅鐵螯合前后的配體基團(tuán)變化情況[29]。大米肽及其螯合物的紅外光譜見圖7～圖9。大米肽在3290 cm-1附近有寬吸收峰，是由N——H和OH的伸縮振動(dòng)引起的[30]。大米肽在1658 cm-1處有吸收峰，這歸因于C＝O鍵的伸縮振動(dòng)。當(dāng)大米肽結(jié)合鈣、鋅、鐵后，在該處的吸收峰分別移至1670，1662和1660 cm-1處，表明C＝O鍵參與了鈣、鋅、鐵這3種離子的結(jié)合[31]。與鈣、鋅、鐵結(jié)合后，大米肽在1400 cm-1處的——COO譜帶分別轉(zhuǎn)移至1402，1411和1403 cm-1，這充分表明該——COOH與這3種金屬離子成功結(jié)合，并且這種類型的螯合劑可能是由于未結(jié)合的自由電子所致[32]。另外，大米肽在1240 cm-1和1072 cm-1處的吸收峰可分別歸結(jié)于C——N的拉伸振動(dòng)和N——H的彎曲振動(dòng)。與鈣、鋅、鐵結(jié)合后，大米肽在N——H處的吸收峰分別轉(zhuǎn)移至1079，1114和1080 cm-1，這再次表明含氮官能團(tuán)與金屬離子的成功絡(luò)合。另外，大米肽結(jié)合鈣、鋅、鐵后，分別在533，612和615 cm-1處出現(xiàn)了尖銳的吸收峰，這再次表明大米肽中羧基與金屬離子的成功結(jié)合。綜上，大米肽與鈣、鋅、鐵的螯合后，形成了新的不同結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)變化機(jī)理還需進(jìn)一步分析。

圖7 大米肽及大米肽螯合鈣紅外光譜圖

圖8 大米肽及大米肽螯合鋅紅外光譜圖

圖9 大米肽及大米肽螯合鐵紅外光譜圖

3 結(jié)論

大米肽的分子量分布檢測(cè)證明分子量小于1000 Da的大米肽占總肽量一半以上（52.53%），而大米肽氨基酸含量最高的為谷氨酸。通過ABTS、DPPH自由基清除試驗(yàn)和還原力試驗(yàn)考察對(duì)比大米肽及其螯合物的體外抗氧化功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大米肽及其螯合物均表現(xiàn)出良好的體外抗氧化性，且均隨著濃度的增加而上升。樣品濃度在2～10 mg/mL，大米肽螯合鐵清除DPPH自由基的能力高于大米肽；在0.4～0.8 mg/mL，大米肽螯合鈣清除ABTS自由基的能力高于大米肽，且顯著高于VC；在0.6～1.0 mg/mL，大米肽螯合鈣和大米肽螯合鐵的還原能力高于大米肽。紅外光譜檢測(cè)結(jié)果表明，正是由于大米肽與鈣、鋅、鐵的螯合后，形成了新的不同結(jié)構(gòu)，賦予了大米肽螯合物不同的體外抗氧化能力。文章證明了大米肽及其鈣鋅鐵螯合物的體外抗氧化活性，并初步解析了其結(jié)構(gòu)變化，對(duì)于提高大米肽產(chǎn)品的品質(zhì)和附加值、促進(jìn)多肽螯合物及相關(guān)產(chǎn)業(yè)的進(jìn)步與發(fā)展，提供了理論基礎(chǔ)。