牛骨多肽酶解工藝優化及其抗氧化活性研究

白玉，周中馳，陳飛，朱太海，陳安徽，邵穎

1.南京愛莎香精有限公司（南京 210000）；2.徐州工程學院食品（生物）工程學院（徐州 221111）；3.江蘇諾普樂生物科技有限公司（徐州 221116）

牛骨是我國肉牛產業的主要副產物之一，其中蛋白含量豐富，達16%～25%[1-2]。但是我國牛骨資源利用率較低，大部分牛骨被丟棄，不僅造成資源的浪費，也帶來一定的環境污染壓力，僅少部分牛骨被作為生產骨泥、骨粉、骨油、骨膠、骨湯等產品的原料，也有制作鈣制劑和動物飼料的應用，總體牛骨產品附加值較低[3-4]。因此，如何有效利用牛骨資源并精深開發利用成為研究熱點。

研究顯示，牛骨中豐富的膠原蛋白經酶解分離純化后所得多肽具有抗骨質疏松、促進成骨細胞增殖和抑制骨質流失等作用，對改善人體健康有重要意義[5-8]。因此采用生物技術手段，以牛骨為原料進行多肽物質的提取分離純化研究成為牛骨資源深入開發的重要方向。胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶及風味蛋白酶都是酶解牛骨膠原蛋白的主要水解酶[9-12]。如：穆紅等[13]探究超聲輔助雙酶法水解牛骨蛋白的最佳工藝，用中性蛋白酶與風味蛋白酶作為復合酶進行酶解，在最佳工藝條件下水解度達20.73%；吳暉等[14]利用堿性蛋白酶對牛骨進行酶解，結果發現當酶解產物平均分子量2025 Da時具有較強的抗氧化活性。

通過響應面設計試驗對牛骨多肽復合酶解工藝進行優化，初步分離得到不同分子量多肽，并對多肽樣品進行體外抗氧化活性檢測，以期為牛骨資源的開發利用及牛骨類產品的精深加工提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

新鮮牛骨（購于徐州市雨潤農貿市場）。

風味蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶（國藥集團化學有限公司）；其余試劑為國產分析純。

有機膜分離實驗機（BONA-GM-18）、進口微濾膜元件（0.2 μm、16691）、進口超濾膜元件（5000 Da、16421）、進口納濾膜元件（600 Da、16424；150 Da、16324）：濟南博納生物技術有限公司；掃描型紫外可見分光光度計（UV-1900PC，上海皓緹儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 牛骨泥的制備

新鮮牛骨剔除表面肌肉后粉碎成骨泥，裝袋密封后于-20 ℃保存備用。

1.2.2 牛骨泥脫脂

采用高溫蒸煮法脫脂，按照料液比1∶10（g/mL）加入蒸餾水，置于高壓蒸汽滅菌鍋內于121 ℃蒸煮10 min，取出后在4 ℃條件下冷卻3 h去除表面油脂，備用。

1.2.3 多肽得率的測定

多肽質量濃度的測定：采用雙縮脲法[15]測定多肽含量。分別準確吸取1 mL質量濃度3，4，5，6和7 mg/mL的標準蛋白溶液，加入5 mL雙縮脲試劑與4 mL蒸餾水，避光反應30 min后于波長540 nm處測定吸光度，繪制標準曲線。添加20 mL 10%三氯乙酸與20 mL多肽酶解液，充分混均，離心15 min，取1 mL上清液，加入5 mL雙縮脲試劑與4 mL蒸餾水反應，于波長540 nm處測定吸光度，按式（1）計算多肽得率。

1.2.4 復合酶種類的確定

將風味蛋白酶（53 ℃）、酸性蛋白酶（45 ℃）、木瓜蛋白酶（55 ℃）、胃蛋白酶（37 ℃）、中性蛋白酶（40 ℃）、堿性蛋白酶（45 ℃）、胰蛋白酶（37 ℃）在其各自理論最適溫度下，在加酶量1%、酶解時間2 h條件下對牛骨進行單酶酶解并計算多肽得率，確定多肽得率最高的2種酶作為復合酶。

1.2.5 復合酶比例的確定

對中性蛋白酶和胰蛋白酶按照1∶4，1∶1.5，1∶1，4∶1和1.5∶1的比例進行復配，復配后在加酶量1%、酶解時間2 h條件下對牛骨進行酶解并計算多肽得率，確定中性蛋白酶和胰蛋白酶的復配比例。

1.2.6 牛骨肽提取工藝優化

1.2.6.1 單因素試驗

固定酶解參數溫度45 ℃、酶解時間2 h，酶添加量2%、pH 7，以pH（pH 5，6，7，8和9）、酶添加量（1.0%，1.5%，2.0%，2.5%和3.0%）、酶解溫度（35，40，45，50和55 ℃）和酶解時間（0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 h）4個因素為單因素，在只改變某一因素的條件下進行單因素試驗。

1.2.6.2 響應面提取工藝優化

在單因素試驗基礎上，選取酶添加量、酶解溫度、酶解時間3個變量為影響因子，牛骨多肽酶解率為響應值，采用Design Expert 8.0.6.1設計三因素三水平試驗，通過模型預測牛骨肽最優提取工藝。試驗因素水平設計見表1。

表1 響應面設計試驗因子及水平

1.2.7 牛骨肽不同分子量肽段的分離

牛骨酶解液通過孔徑0.2 μm的微濾膜元件去除酶解液中的大分子物質后，依次通過截留分子量5000，600和150 Da的膜分離元件并收集相關組分，得到3個不同分子量組分，分別命名為組分Ⅰ（分子量＞5000 Da）、組分Ⅱ（600～5000 Da）、組分Ⅲ（150～600 Da）。制備成10 mg/mL多肽，備用。測定酶解原液與膜分離所得3個組分的多肽含量與抗氧化活性。

1.2.8 不同分子量牛骨肽抗氧化活性

1.2.8.1 DPPH自由基清除率測定

DPPH自由基清除能力測定參照魏潔瓊等[16]的方法并改進。使用無水乙醇配制0.3 mmol/L DPPH溶液，取2 mL 10 mg/mL樣品液與DPPH溶液，充分混合，避光反應20 min后于517 nm波長處測定吸光度，用A1表示。用同等體積的無水乙醇代替DPPH作為對照樣，測定得到的吸光度用A2表示，用等體積的無水乙醇代替DPPH作為空白樣，測定得到的吸光度用A0表示，DPPH自由基清除率按式（2）計算。

式中：A1為試驗樣吸光度；A2為對照樣吸光度；A0為空白樣吸光度。

1.2.8.2 羥自由基清除率測定

羥自由基清除率測定采用水楊酸法，參照項瑩[17]的方法并加以改進。取8 mmo/L FeSO4和8 mmol/L水楊酸-乙醇溶液各1 mL，在反應體系中加入1 mL的10 mg/mL多肽樣品溶液后加入1 mL的8.8 mmol/L H2O2啟動反應，在37 ℃反應30 min后于波長510 nm處測定吸光度，用相同體積的去離子水代替樣品溶液作為樣品的本底吸收組，用相同體積的去離子水代替過氧化氫溶液作為對照組，羥自由基清除率按式（3）計算。

式中：A1為試驗組吸光度；A0為對照組吸光度；A2為無顯色劑時樣品本底溶液的吸光度。

1.2.8.3 還原力測定

還原力測定采用鐵氰化鉀法，參照項瑩[17]的方法并改進。取1 mL的10 mg/mL樣品溶液加入3 mL的1%鐵氰化鉀溶液和同等體積的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.6），于50 ℃保溫15 min。加入3 mL的10%三氯乙酸溶液，按4000 r/min離心5 min，離心后取3 mL上清液，并加入3 mL去離子水和0.5 mL 0.1%的氯化鐵溶液，靜置反應10 min后測定波長700 nm處吸光度，以等體積去離子水替代樣品溶液作為空白對照。吸光度的大小與樣品的還原能力呈正比。

2 結果與分析

2.1 酶的篩選

不同種類酶水解牛骨后的多肽得率如圖1所示。6種蛋白酶分別酶解牛骨后酶解液中多肽得率均顯著高于未加蛋白酶的空白組，其中中性蛋白酶與胰蛋白酶酶解后多肽得率最高，顯著高于其他酶解液中多肽的得率，分別達到10.59%±0.21%和9.93%±0.19%。因此選擇中性蛋白酶和胰蛋白酶進行復配以提高牛骨多肽得率。

圖1 不同種類酶的多肽得率

2.2 復合酶復配比例的確定

中性蛋白酶和胰蛋白酶按照不同的比例進行復配并對牛骨進行酶解。圖2結果顯示：2種蛋白酶添加比例相近時，酶解液中多肽得率較低，可能是2種酶之間存在拮抗作用的結果；中性蛋白酶與胰蛋白酶任意一種酶比例較高時，協同作用占據優勢，多肽得率明顯上升。綜合考慮工業化生產的經濟成本等因素影響，最終確定：復合酶添加最佳比例為中性蛋白酶與胰蛋白酶的復配比例1∶4。

圖2 不同比例復合酶的多肽得率

2.3 酶解工藝優化

2.3.1 酶解工藝單因素的確定

2.3.1.1 復合酶添加量的確定

考察復合酶不同添加量對牛骨多肽得率的影響。由圖3結果可知，復合酶添加量1.0%～3.0%范圍內，多肽得率呈先升后降趨勢，復合酶添加量1.5%時，多肽得率達到最高，為14.44%±0.14%，加酶量1.5%～3.0%范圍內呈下降趨勢。因此牛骨多肽酶解的最佳加酶量為1.5%。

圖3 復合酶不同添加量對多肽得率的影響

2.3.1.2 酶解時間的確定

酶解時間會影響牛骨多肽的得率。從圖4可以看出，隨著酶解時間的延長，多肽得率呈上升趨勢，酶解時間0.5～2.0 h內牛骨多肽得率上升較為明顯，酶解2 h后可能由于底物的大量消耗使其濃度降低，造成多糖得率變化較為平緩。因此最佳酶解時間為2 h，此時多肽得率達到最高，為15.11%±0.23%。

圖4 不同酶解時間對多肽得率的影響

2.3.1.3 酶解溫度的確定

由圖5可知，酶解溫度對牛骨多肽得率的影響顯著。隨著酶解溫度的升高，多肽得率呈現先顯著增加后顯著下降趨勢，酶解溫度40 ℃時牛骨多肽的得率達到最高，為15.33%±0.10%，之后隨著酶解溫度升高，牛骨多肽得率顯著下降。這應該與復合酶的最適反應溫度有關，溫度偏離酶的最適溫度均會造成酶活力的下降，從而使得多肽得率降低。

圖5 酶解溫度對多肽得率的影響

2.3.1.4 酶解pH的確定

由圖6可知，酶解環境pH在中性附近時牛骨多肽的得率較高，pH 7.5時多肽得率最高。但偏離中性環境時，偏酸或偏堿的條件下均使得復合酶的活性降低，造成多肽得率下降。中性環境有利于牛骨多肽的酶解，無需對酶解環境pH進行刻意調節，因此，試驗不將pH作為響應面優化因素。

圖6 不同pH對多肽得率的影響

2.3.2 響應面試驗結果

2.3.2.1 響應面優化試驗因素分析

在單因素試驗結果基礎上，選擇對牛骨多肽得率影響較大的加酶量（A）、酶解溫度（B）、酶解時間（C）3個因素，以肽得率為響應值，根據響應面分析方法，設計三因素三水平試驗方案，軟件設計方案共17個試驗點，其中12個分析試驗，5個為中心試驗。響應面試驗設計及結果見表2。

表2 響應面設計試驗結果

2.3.2.2 方差分析

根據試驗得到二元多次回歸方程：多肽得率=17.3-0.17A-0.19B+0.29C+0.11AB-0.34AC-0.11BC-1.02A2-1.32B2-0.82C2。如表3所示，試驗選用的回歸模型為差異極顯著（P＜0.0001），失擬項中P值為0.13（P＞0.05），不顯著。模型回歸系數R2=0.9900，決定系數Radj2=0.9772，說明選用模型與實際相切合，并且方程對試驗擬合度結果較好，根據表3中的P值可知，A、B對多肽得率的影響為差異顯著，C則為差異極顯著，并且加酶量與酶解時間的交互作用為差異極顯著，3個因素對多肽得率的影響大小為酶解時間＞酶解溫度＞加酶量。

表3 方差分析表

2.3.2.3 各因素交互作用響應面結果分析

圖7為各個因素間的交互作用的等高線與3D曲面圖。由圖7（b）可知，酶解時間（C）與加酶量（A）之間的3D曲面圖較為陡峭，等高線為橢圓形，可知這2個因素交互作用明顯，與方差分析表結果一致。試驗分析所得最佳工藝條件為酶添加量1.44%、酶解溫度39.58 ℃、酶解時間2.10 h，預測所得多肽提取率17.35%。經綜合考慮，條件修正為酶添加量1.40%、酶解溫度39.6 ℃、酶解時間2.10 h，進行驗證試驗，3次平行所得驗證試驗結果為17.11%±0.24%，與預測值相差較小，說明該模型能較好預測牛骨肽提取最佳工藝。

圖7 響應曲面圖與等高線圖

2.4 不同分子量多肽組分抗氧化活性

牛骨多肽酶解液經不同孔徑膜分離處理后，截留獲得3個分子量范圍的肽段組分，分別為組分Ⅰ（多肽分子量＞5000 Da）、組分Ⅱ（600～5000 Da）、組分Ⅲ（150～600 Da），測定3個組分在牛骨酶解液中的含量同時對不同分子量組分和牛骨酶解液進行抗氧化檢測。

由表4可知，牛骨酶解液中多肽分子量主要集中在600～5000 Da范圍內，占比43.14%±0.23%，分子量150～600 Da范圍內的較少，占比18.82%±0.15%。這可能是由于復合酶具有特定的酶切位點，所以分子量600～5000 Da范圍內的肽段含量較高，而分子量150～600 Da范圍內小肽含量較少。抗氧化活性結果顯示，牛骨酶解液及不同分子量的多肽均有一定的抗氧化性，樣品濃度均為10 mg/mL時，組分Ⅲ的DPPH活性最高，為87.89%±0.18%，組分Ⅲ的羥自由基清除活性最高，為52.49%±0.22%，組分Ⅲ的還原力最高，為0.382±0.02。3種不同分子量的多肽組分間抗氧化活性差別較小，組分Ⅲ（150～600 Da）的抗氧化活性高于其他組分，組分Ⅲ對DPPH自由基清除率可達87.89%，而牛骨酶解液的抗氧化性最弱，由此可知試驗獲得牛骨多肽分子量越小，其抗氧化活性越強。

表4 抗氧化試驗結果

3 結論

采用響應面法優化牛骨多肽的最佳復合酶解工藝，其酶解條件為中性蛋白酶與胰蛋白酶復配比例1∶4、復合酶添加量1.40%、酶解溫度39.6 ℃、酶解時間2.1 h，牛骨多肽得率17.11%±0.24%，多肽得率較未優化前提高11.61%。牛骨酶解液經過不同孔徑膜分離后得到3種不同分子量范圍的多肽，對3種不同分子量多肽及牛骨酶解液進行抗氧化活性驗證，結果發現其均具有一定抗氧化活性，抗氧化活性大小排序為組Ⅲ（150～600 Da）＞組分Ⅱ（600～5000 Da）＞組分Ⅰ（＞5000 Da）＞牛骨酶解液，分子量較小的多肽較分子量大的多肽具有更強的抗氧化活性。試驗以肉牛加工產業副產物牛骨為原料，對牛骨多肽的酶解工藝及酶解物的抗氧化活性進行研究，為牛骨多肽的制備提供有效方案，同時不同分子量牛骨多肽抗氧化活性的測定也為牛骨資源精深加工及精準開發提供依據。