黑果腺肋花楸多酚提取工藝優(yōu)化及其抗氧化性研究

王亞菲，杜琳，潘勇韜，朱鳳妹

1.河北科技師范學(xué)院（秦皇島市 066000）；2.秦皇島市林業(yè)局（秦皇島市 066000）

黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa）又名野櫻莓[1-2]。20世紀(jì)90年代在我國遼寧開始引種栽培，具有食用價值、藥用價值及經(jīng)濟價值[3-4]。黑果腺肋花楸果實中含有豐富的多酚類物質(zhì)[5]，具有多種生物活性功能，如抗氧化性和抑菌作用。近年來，人們對黑果腺肋花楸的組分、保健作用及臨床療效的研究興趣越來越大，國內(nèi)對黑果腺肋花楸的研究大部分集中在活性物質(zhì)的提取及開發(fā)利用。

黑果腺肋花楸果主要含有豐富的花青素、原花青素、黃酮醇等[6]，其次含有槲皮素、槲皮素苷和表兒茶素等[7]。原花青素含量最高，通常含有80%～95%的可提取原花青素[8]。黑果腺肋花楸果及其提取物具有預(yù)防尿路感染[5]、抗糖尿病[9]、抗癌作用、抑菌、治療脂肪肝、抗動脈粥樣硬化[10]等功效。

從植物基質(zhì)中回收多酚的經(jīng)典方法是使用酸化的甲醇、乙醇或丙酮水溶液進行溶劑萃取[11]。在相同條件下，在室溫下使用純水比有機溶劑-水混合物的提取水平低[12]。然而，提取產(chǎn)率可以通過超聲處理[13]、加壓液體提取[14]、脈沖電場處理[15]或植物細胞壁的酶降解[16]等技術(shù)提高。水超聲處理提高工藝效率的主要原因是聲空化現(xiàn)象及其產(chǎn)生的熱效應(yīng)和機械效應(yīng)[17]，與傳統(tǒng)技術(shù)相比，它可提高傳質(zhì)和顯著破壞細胞壁，從而提供更高的提取率并顯著縮短加工時間[18]。另外，為了提高多酚得率，常將兩種或兩種以上提取技術(shù)結(jié)合使用[19]。水作為提取溶劑，具有綠色環(huán)保、操作簡單的優(yōu)點，而且考慮到食用安全等問題，采用超聲水提黑果腺肋花楸中的多酚并優(yōu)化提取工藝，旨在為黑果腺肋花楸多酚的研究提供相關(guān)工藝技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果腺肋花楸果（遼寧富康源黑果花楸科技開發(fā)有限公司）；沒食子酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；1 mol/L福林酚、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2’-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（ABTS）：上海源葉生物科技有限公司；無水碳酸鈉（天津歐博凱化工有限公司）；水楊酸（天津市鼎盛鑫化工有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ5200DB數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；V-5100可見分光光度計（武漢高精密科學(xué)儀器有限公司）；Star A1115型pH計[梅特勒-托利多（上海）有限公司]。

1.3 提取黑果腺肋花楸多酚

1.3.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

參考王淞[20]測定黑果腺肋花楸多酚的方法并稍作修改。配制1.0 mg/mL的沒食子酸溶液，稀釋至10，20，30，40，50，60和70 μg/mL 7個質(zhì)量濃度。取定量稀釋液于試管中，加入定量的10%福林酚試劑，避光反應(yīng)5 min后，加入定量Na2CO3溶液，在30 ℃恒溫水浴鍋中避光靜置1 h，測定波長765 nm處的吸光度，試驗重復(fù)3次并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 多酚提取及得率測定

將黑果腺肋花楸果洗凈，放入烘箱中烘干至果實表面無水滴。超聲輔助提取后收集上清液，吸取1.0 mL上清液，按1.3.1小節(jié)的方法測定A765nm，多酚得率按式（1）計算。

式中：Y為多酚得率，mg/g；C為黑果腺肋花楸水提液多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；V為水提液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；m為黑果腺肋花楸質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 料液比

準(zhǔn)確稱取20 g洗凈的黑果腺肋花楸果，在超聲功率200 W、提取溫度40 ℃、提取時間25 min、pH 6.68的條件下，測定料液比1∶30，1∶40，1∶50，1∶60和1∶70（g/mL）時多酚的得率，確定最佳料液比。每組試驗平行3次，結(jié)果取平均值。

1.3.3.2 提取時間

稱取20 g洗凈的黑果腺肋花楸，按1∶50（g/mL）料液比加水打漿。控制超聲功率200 W、提取溫度40 ℃、pH 6.68，分別提取5，15，25，35和45 min，計算多酚得率并確定最佳提取時間。每組試驗平行3次，結(jié)果取平均值。

1.3.3.3 提取溫度

稱取20 g洗凈的黑果腺肋花楸，按1∶50（g/mL）料液比加水打漿。控制超聲功率200 W、pH 6.68、提取時間25 min，分別測定20，30，40，50和60 ℃下多酚得率并確定最佳提取溫度。每組試驗平行3次，結(jié)果取平均值。

1.3.3.4 pH

稱取20 g洗凈的黑果腺肋花楸，按1∶50（g/mL）料液比加水打漿。控制超聲功率200 W、提取時間25 min、提取溫度40 ℃，分別測定pH在2.68，3.68，4.68，5.68和6.68下多酚得率并確定最適pH。每組試驗平行3次，結(jié)果取平均值。

1.3.4 響應(yīng)面試驗

對水提黑果腺肋花楸多酚的單因素試驗結(jié)果進行分析（SPSS 25.0），選擇料液比、溫度、pH這3個顯著因素進行響應(yīng)面試驗，通過試驗得出最優(yōu)提取工藝。

表1 響應(yīng)面試驗因素及水平

1.4 黑果腺肋花楸多酚抗氧化活性測定

1.4.1 DPPH自由基清除率測定

參考葉樹才等[21]的方法并稍作修改。吸取定量多酚溶液，加定量0.1 mmol/L DPPH溶液，靜置30 min，在波長517 nm處測A1。吸取定量乙醇，加入定量DPPH溶液，靜置30 min，在波長517 nm處測A0。吸取定量多酚溶液，加入定量乙醇，靜置30 min，在波長517 nm處測A2。3次平行試驗，VC代替多酚重復(fù)上述步驟。DPPH自由基清除率按式（2）計算。

式中：Y為DPPH自由基清除率，%；A0為空白組吸光度；A1為測定組吸光度；A2為對照組吸光度。

1.4.2 ABTS自由基清除率測定

參考趙彥巧等[22]的方法并稍作修改。將ABTS溶液（7.0 mmol/L）與K2S2O8溶液（2.5 mmol/L）等比例混合，避光放置過夜。將溶液吸光度調(diào)整至0.700±0.002，并在配制完成后的4 h內(nèi)使用。反應(yīng)體系：1 mL不同濃度黑果腺肋花楸多酚溶液+3 mL ABTS工作液，避光反應(yīng)5 min后在波長734 nm處測A1；1 mL不同濃度黑果腺肋花楸多酚溶液+3 mL無水乙醇，避光反應(yīng)5 min后在波長734 nm處測A2；1 mL無水乙醇+3 mL ABTS工作液，避光反應(yīng)5 min后在波長734 nm處測A0。3次平行試驗，VC代替多酚重復(fù)上述步驟。ABTS自由基清除率按（2）計算。

1.4.3 羥自由基清除率測定參考Zhang[23]的方法，將不同濃度多酚溶液、FeSO4、H2O2定量加入試管中，搖勻。靜置10 min后加入定量水楊酸，10 min后在波長530 nm處測A1。在其他條件不變的情況下用去離子水代替H2O2，測定A2。在其他條件不變的情況下，用去離子水代替多酚溶液，測定A0。3次平行試驗，同時做VC陽性對照。羥自由基清除率按（2）計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。回歸方程式為y=0.0127x+0.0185，R2=0.9995，其中沒食子酸質(zhì)量濃度為x，吸光度為y。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗結(jié)果與分析

2.2.1 料液比對黑果腺肋花楸多酚得率的影響

如圖2所示，多酚得率隨料液比中液體占比的增大先上升后降低（P＜0.01）。1∶50（g/mL）時多酚得率最高，多酚在此時已經(jīng)全部溶出。隨著料液比中液體占比持續(xù)增大，伴隨著黑果腺肋花楸多酚溶出，可能還有其他活性物質(zhì)溶出，使多酚得率下降[27]，因此選擇1∶40～1∶60（g/mL）進行后續(xù)試驗較為合適。

圖2 料液比對多酚得率的影響

2.2.2 提取時間對黑果腺肋花楸多酚得率的影響

如圖3所示，提取時間對多酚得率影響不顯著（P＞0.05）。隨著時間的延長，超聲的內(nèi)能效應(yīng)、機械效應(yīng)加速了多酚穿過細胞壁大量溶出，但長時間的超聲可能破壞了部分多酚的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致多酚得率下降[28]。因此，后續(xù)試驗中超聲提取時間選擇25 min較為合適。

圖3 時間對多酚得率的影響

2.2.3 提取溫度對黑果腺肋花楸多酚得率的影響

如圖4所示，多酚得率隨提取溫度的上升呈先增后降趨勢（P＜0.01）。當(dāng)提取溫度達到30 ℃時，多酚得率為0.94 mg/g。溫度升高促進分子運動，使多酚與蛋白質(zhì)等大分子結(jié)合不穩(wěn)定，氫鍵斷裂，加快多酚的溶出。溫度過高破壞了多酚的結(jié)構(gòu)，加速多酚氧化，使其含量降低，所以選擇選擇20～40 ℃進行響應(yīng)面試驗。

圖4 溫度對多酚得率的影響

2.2.4 pH對黑果腺肋花楸多酚得率的影響

如圖5所示，隨著pH的增大，多酚得率呈先上升后下降的趨勢（P＜0.01）。pH為5.68時多酚得率最高，為0.72 mg/g，隨著pH繼續(xù)增大，多酚得率逐漸降低。這可能是因為多酚類物質(zhì)在弱酸及中性環(huán)境下較穩(wěn)定，過酸或過堿都會使多酚分解，從而降低多酚得率。所以選擇pH 4.68～6.68進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

圖5 pH對多酚得率的影響

2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

2.3.1 回歸模型的建立及方差分析

回歸模型設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 黑果腺肋花楸多酚響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

使用軟件對響應(yīng)面試驗結(jié)果進行多項擬合回歸，得到回歸方程：

由表3可知，模型回歸方程中F=85.02，P＜0.0001，該模型達到了極顯著水平。失擬項（P=0.1051＞0.05）不顯著，R2=0.9909，Radj2=0.9793，表明模型擬合度良好，可用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。變異系數(shù)為1.76%，說明試驗具有較高的可信度。一次項A、B、C，交互項AC，二次項A2、B2、C2差異極顯著（P＜0.01），說明這些因素對黑果腺肋花楸多酚得率影響很大。由F值可得，不同因素對黑果腺肋花楸多酚得率的影響大小為提取溫度＞pH＞料液比。

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析

2.3.2 各因素交互作用

料液比與提取溫度的交互作用，料液比與pH的交互作用及提取溫度與pH的交互作用的響應(yīng)面圖及等高線圖如圖6所示。

圖6 料液比、提取溫度、pH之間交互作用的等高線及響應(yīng)面圖

響應(yīng)曲面可以直觀反映各因素對黑果腺肋花楸多酚得率的影響，曲面越彎曲說明交互作用越大；反之，曲面越平緩說明交互作用越小。顏色變化越快表明坡度越大，即對結(jié)果影響更顯著。圖6中AC曲面彎曲程度明顯高于AB與BC，且坡度較陡；AC的等高線圖顯示出較細長的橢圓形，說明AC交互項具有顯著影響。

2.3.3 驗證試驗

模型預(yù)測的提取黑果腺肋花楸多酚的最優(yōu)工藝為料液比1∶53.07（g/mL）、提取溫度34.14 ℃、pH 5.97，多酚得率為0.85 mg/g。進行驗證試驗時，結(jié)合實際操作及儀器精密度，將提取工藝調(diào)整為料液比1∶53（g/mL）、提取溫度34 ℃、pH 6。按此條件平行3次，測得實際多酚得率0.84 mg/g。說明該模型精確可信，可用于黑果腺肋花楸多酚的提取工藝優(yōu)化。

2.4 黑果腺肋花楸多酚抗氧化活性測定結(jié)果與分析

2.4.1 DPPH自由基清除率測定

DPPH外觀呈深紫色，抗氧化劑會與其電子配對，進而使溶液顏色變成淺黃色或無色，根據(jù)顏色的變化可以判斷抗氧化劑的抗氧化能力。如圖7所示，隨著多酚溶液濃度的增加，DPPH自由基清除率顯著增大（P＜0.05）。溶液質(zhì)量濃度為10 mg/mL時，多酚對DPPH自由基清除率（97.59%）大于VC對照組（96.33%），說明多酚具有良好的清除DPPH自由基的能力。

圖7 黑果腺肋花楸中多酚類物質(zhì)對DPPH自由基的清除能力

2.4.2 ABTS自由基清除率測定

ABTS法是一種被廣泛用于檢測物質(zhì)體外抗氧化能力的方法。如圖8所示，ABTS自由基清除率隨著多酚溶液質(zhì)量濃度的增大呈極顯著（P＜0.01）增大的趨勢。溶液質(zhì)量濃度為2 mg/mL時，多酚對ABTS自由基清除率（89.41%）略低于VC對照組（99.6%），說明多酚具有一定的清除ABTS自由基的能力。

圖8 黑果腺肋花楸中多酚類物質(zhì)對ABTS自由基的清除能力

2.4.3 羥自由基清除率測定

水楊酸能快速捕捉羥自由基，通過測定吸光度可以判斷抗氧化劑的抗氧化性。如圖9所示，羥自由基的清除率隨著多酚濃度的增大而逐漸增大（P＞0.05）。當(dāng)質(zhì)量濃度為6 mg/mL時，羥自由基清除率（81.56%）低于VC對照組（99.64%），說明多酚具有一定的清除羥自由基的能力。

圖9 黑果腺肋花楸中多酚類物質(zhì)對羥自由基的清除能力

3 結(jié)論

通過單因素試驗及響應(yīng)面試驗獲得最優(yōu)提取工藝：料液比1∶53（g/mL）、提取溫度34 ℃、pH 6、提取時間25 min。按最優(yōu)提取工藝提取黑果腺肋花楸多酚，得率為0.84 mg/g，與預(yù)測值相近，表明該模型可靠。分析黑果腺肋花楸多酚的抗氧化活性，結(jié)果表明：多酚對DPPH自由基（97.59%）、ABTS自由基（89.41%）、羥基自由基（81.56%）具有良好的清除能力，黑果腺肋花楸多酚具有良好的抗氧化能力，為黑果腺肋花楸多酚的提取及保存提供理論依據(jù)。